2023高通量测序技术在肿瘤精准诊疗中的临床应用.docx

2023高通量测序技术在肿瘤精准诊疗中的临床应用摘要高通量测序技术与传统的基因检测技术相比，实现了多样本、多位点、多变异类型的大规模平行L检测，在提供临床诊疗信息的同时还能挖掘大量具有研究价值的信息，其在临床的应用范围日益广泛。另一方面，基于基础研究的不断深入，医药产业的转化产出也逐渐加大，靶向治疗、免疫治疗等新型方式将肿瘤带入"个体化精准诊疗"时代，从病种管理逐渐发展到基因管理，以患者基因组大数据为核心，实现疾病的分类、诊断、治疗与预后方案的制定，因此基因检测在整个肿瘤的管理过程中占据了不可替代的重要作用。目前，高通量测序在肿瘤临床应用中涉及了靶向治疗、辅助诊断、评估预后、复发或耐药监测等诸多方面，本文对以上各方面的临床实践现状和进展进行详细介绍。近年来，肿瘤精准诊疗的概念不断"微观化"，同时伴随着生物信息学与测序技术的交叉融合，基因检测越来越广泛地应用于临床各个领域。高通量测序技术，即二代测序(nextgenerationsequencing,NGS)次检测即可实现对大量DNA片段进行测序，极大地推动了精准诊疗概念在肿瘤全程管理中的建立11肿瘤的治疗方式经历了变化的轨迹：从手术治疗到放疗、化疗，再到靶向治疗、免疫治疗等新方法，肿瘤的发生发展机制复杂，但其本质是基于驱动基因变异导致的疾病，基因检测可获取相应变异信息。因此，随着基因组学的不断深入发展，NGS技术在肿瘤临床应用中扮演的角色也越来越重要。一、NGS相比传统分子技术的优势当NGS技术还未应用于临床肿瘤伴随诊断时，已有多个基于免疫组化技术、荧光定量聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术和荧光免疫杂交技术等传统分子检测技术的产品作为靶向治疗药物的伴随诊断试剂盒在国内外获得批准。这些传统分子检测技术存在明显局限性:(1)检测通量低，单次检测只能测出有限的基因变异数目和类型；(2)无法检出未知的变异,可能会发生罕见变异的漏检,导致假阴性结果2;(3)无法区分具体变异位点，如表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)基因19号外显子的缺失变异有多种核昔酸变异形式，PCR方法无法区分具位点3;(4)近年来肿瘤突变负荷(tumormutationburden,TMB微卫星不稳定(microsatelliteinstability,MSI)与免疫治疗效果的相关性研究，同源重组修复缺陷(homologousrecombinationdeficiency,HRD)与聚腺昔二磷酸核糖聚合酶(polyADP-ribosepolymerase,PARP)抑制剂治疗效果的研究越来越多，传统分子检测无法为这两种治疗方法提供有效的标志物信息4L与传统检测技术相比，NGS技术具有较多优势：(1)可同时检出多个变异信息，提供更全面的信息，包括肿瘤相关基因分型与预后评估、多个靶向治疗药物靶点信息、免疫治疗方案选择、预后评估等4;(2)实现患者病情发展的实时监测5；(3)单基因单变异位点平均成本较低6L然而，技术之间的优劣对比没有绝对界限，能够满足临床需要的选择才是最优的技术。NGS技术也有其自身的局限性，其对PCR的信号放大作用依赖度高，尤其在液体活检领域，低丰度变异的判别仍是考验；NGS技术目前测序读长较短，在高GC区域、同源序列区域、重复序列区域的捕获效率、覆盖程度可能出现不均一的情况7INGS检测的时间和经济成本较高、操作复杂、对实验室的硬件设施要求较高，且NGS检测结果信息量大，需要有相应专业背景的人员进行数据解读。传统PCR检测技术检测通量较小，时间和经济成本较低、操作简便、易在医院落地。因此,传统PCR检测技术与NGS技术在临床的应用仍会是互补的存在状态。二、NGS在肿瘤辅助诊断中的应用肿瘤的发生发展是基因变异与环境共同影响的长期过程，其中约有5%10%的肿瘤属于遗传性肿瘤综合征，由一个或多个基因变异导致，变异多为常染色体显性遗传，如遗传性乳腺癌、甲状腺髓样癌等80如何对高危人群筛查，进行有效的防治和干预，是遗传性肿瘤领域的重点。NGS可作为遗传性综合征相关基因变异筛查的有效手段,通过定制靶向基因包检测相关基因，在一定程度上为高危人群提供关键的信息、作出风险评估。美国国立癌症综合网络(NationalComprehensiveCancerNetwork,NCCN美国临床肿瘤学会(AmericanSocietyofClinicalOncology,ASCO)均提到，推荐符合临床指征的高危人群进行相关的基因检测9,10L如林奇综合征(Lynchsyndrome,LS)相关的高危人群建议对错配修复(mismatchrepair,MMR)相关基因如MutL同源物1基因(mutLproteinhomolog1,MLH1MutS同源物2基因(mutShomolog2,MSH2MutS同源物6基因mutShomolog6,MSH6PMS1同源物2基因(PMSlhomolog2,PMS2)等进行检测11,12,13,14;遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征(hereditarybreast-ovariancanceriHBOC)相关的高危人群建议对乳腺癌易感基因1/2(breastcancersusceptibilitygene1/2,BRCA12BRCA1相关环域蛋白1基因(BRCA1associatedRINGdomain1iBARD1BRCA2定位协作基因(partnerandIocalizerofBRCA2,PALB2I磷酸酯酶与张力蛋白同源物基因(phosphataseandtensinhomolog,PTENX细胞周期检测点激酶2基因(checkpointkinase2,CHEK2)等基因进行检测12Je然而值得注意的是，NGS检出的信息量巨大，如何评估基因与疾病的关联性、发病率、风险程度等还缺乏全面的研究和指南15,另一方面多基因包检测试剂盒的应用会导致意义未明变异(variantsofuncertainsignificance,VUS)结果出现的概率增加，在临床实践中如何对这些变异进行解读、评估与管理仍然存在极大的挑战16Je因此NGS在遗传性W瘤综合征中的应用，尤其是多基因包检测试剂盒在临床的检测仍需谨慎。基因检测在细胞病理学诊断方面也可起辅助作用，如甲状腺结节的术前细针穿刺(fine-needleaspiration,FNA)在临床上约有20%30%的病理结果为"意义不明确的结节类型"(BethesdaI11xIV)17,其中甲状腺结节的恶性率仅有15%左右，如不做明确诊断，可能会导致临床上对于甲状腺癌的过度治疗。V-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1基因(v-rafmurinesarcomaviraloncogenehomologueB1,BRAF)等基因的突变可以协助判断，但BRAFV600E单位点无法全面评估，NGS多基因的检测可辅助临床细胞学判断意义不明确的甲状腺结节的良恶性18L此外，骨与软组织肿瘤类别繁杂、病理形态多样,临床病理诊断难度较大，而不同类型的软组织肿瘤具有特异的基因融合/重排或拷贝数变异等分子标志物，如尤文肉瘤断裂区域1基因(EWSRNAbindingprotein1,EWSR1>SMAD家侬员3基西SMADfamilymember35MAD3GRB2关联结合蛋白1基因(GRB2-associatedbindingprotein1,GAB1)-ABL-1非受体酪氨酸激酶基因(ABLproto-oncogene1,non-receptortyrosinekinase,ABL1)等基因融合的检出可协助纤维母细胞性瘤的诊断。NCCN指南已将NGS检测推荐用于肉瘤的辅助诊断中19L三、NGS在肿瘤靶向治疗和免疫治疗中的应用靶向治疗药物可在分子水平上特异作用于相关基因靶点，通过阻止信号分子与受体的结合、抑制激酶的活化等机制精准抑制目信田胞增殖、诱导凋亡等，已成为临床肿瘤治疗中非常重要的方式20L截至2023年2月，我国国家药品监督管理局(NationalMedicalProductsAdministration,NMPA)已批准了17款基于NGS的检测试剂盒。这些检测试剂盒多为小基因包靶向测序试剂盒，通过定向相关基因组区域进行测序获得变异信息，与非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)相关的获批试剂盒最多21J5随着分子靶点的研究,截至2023年初，在NSCLC中多个耐药靶点、难治靶点、罕见靶点获得了突破性进展。目前埃万妥单抗、莫博赛替尼、舒沃替尼已获FDA批准可用于晚期EGFR基因第20号外显子插入变异的NCLSC中，填补了EGFR基因20号外显子插入变异对一代、二代表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermalgrowthfactorreceptor-tyrosinekinaseinhibitor,EGFR-TKI)(如吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼等)不敏感22,缺乏有效药物的空白；如2021年，首款针对Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因(KirstenratsarcomaviraloncogenehomologKRAS)基因p.G12C变异的靶向药索托拉西布获批上市，弥补了KRAS基因变异靶向药缺乏的空白23;2022年FDA批准T-DXd(DS-8201)用于HER2(erb-b2receptortyrosinekinase2)基因变异的转移性NSCLC患者，是NSCLC的首款HER2靶向药物，具有里程碑意义。而随着PARP抑制剂的疗效研究在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤中取得的进展川缶床对于同源重组修复(homologousrecombinationrepair,HRR)基因检测及HRD检测的需求也逐渐增大，其中HRD检测中阴阳性的判定需结合BRCA基因变异状态和基因组瘢痕(genomicscar,GS)标志物的综合评分240除了BRCAl/2基因以外，其他HRR基因的变异同样也会导致HRD状态，如共济失调毛细血管扩张突变基因(ATMserine/threoninekinase,ATM),共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶基因(ATRserine/threoninekinase,ATR),BARD1,布鲁姆综合征蛋白基因(BLMRecQlikehelicase,BLMBRIP1、CHEK2、MREll减数分裂重组11同源物A基因(MREllAhomOlOgA,doublestrandbrrepairnuclease,MRE11A),PALB2,RAD51同源物基因C/D(RAD51paralogC/DiRAD51CD),SLX4结构特异性核酸内切酶亚基基因(SLX4structure-specificendonucleasesubunit,SLX4),X射线修复补缺陷修复2基因(X-rayrepaircrosscomplementing2XRCC2)等基因。该检测涉及的基因数、变异类型、检测区域都比较大，NGS技术可通过定制的基因包靶向测序、全外显子测序或全基因组测序的方法达到目的。另一方面，肿瘤免疫治疗也已批准用于治疗高度微卫星不稳定、错配修复缺陷或者TMB高的不可切除或转移性实体瘤。TMB检测比单一的变异检测更为复杂，全外显子组测序(wholeexonsequencing,WES)是行业内公认的TMB检测金标准，但WES检测的成本较高，在临床的应用受到了一定限制。而靶向定制基因包可通过捕获与肿瘤相关的大量基因，结合生物信息学算法高效地检出靶基因组的改变，在降低了检测成本的同时还能分析TMB和MSI状态,且已有多个研究表明经过验证的基因包与WES的结果一致性较好，更加适合应用于临床检测。靶向治疗、免疫治疗的发展为肿瘤的精准治疗提供了新的方向，而基因检测在其中也起到了重要作用。不同的驱动基因变异，选择不同的治疗方案。而在临床实践中，是否选择进行基因检测，如何选择合适的检测标本、检测方法、检测范围是关键所在。以肺癌为例，不同病理类型的肺癌在选择基因检测时有不同的方案。如病理诊断为小细胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)或术后标本诊断为单纯肺鳞癌时，基因检测对于治疗的获益并不大，暂无适用于指导临床治疗的基因检测方案选择251,若病理诊断为肺腺癌或含有腺癌成分的NSCLC时，推荐进行基因检测。在肿瘤标本可及的情况下，优先选择肿瘤细胞含量高的病理石蜡标本进行检测，一定程度上可保证结果的可靠性。对于检测方法和检测套餐的选择,可结合患者本身经济情况、肿瘤病理分期等诸多因素综合考虑，如经济条件欠佳的初诊患者，在选择指导靶向药物的检测方法时，优先考虑经济实惠的检测方法，例如免疫组化方法检测间变性淋巴瘤激酶基因(ALKreceptortyrosinekinase,ALKXROS受体酪氨酸激酶基因1(ROSproto-oncogene1,receptortyrosinekinase,ROSIX细胞程序性死亡-受体1基因(programmedcelldeath1,PD-1)/细胞程序性死亡-配体1基因(programmedcelldeath1ligand1,PD-L1)蛋白的表达；PCR方法检测EGFR/ALK/R0S1等基因热点区域是否存在变异；若患者条件允许且传统分子检测结果为阴性时，则可选择基于NGS技术包含EGFR、ALK、RoS1、RET受体酪氨酸激酶基因(retproto-oncogene,RET)、KRAS、成神经细胞瘤RAS病毒(v-ras)癌基因同源物基因neuroblastomaRASviral(v-ras)oncogenehomolog,NRAS磷脂酰肌醇3激酶催化亚基基因(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate3-kinasecatalyticsubunitalpha,PIK3CABRAF、HER2、MET受体酪氨酸激酶基因(METproto-oncogene,receptortyrosinekinase,MET)、神经营养因子受体络氨酸激酶基因1/2/3(neurotrophicreceptortyrosinekinase1/2/3,NTRK123)基因在内的基因包进行大范围的检测。而对于晚期或治疗后复发的患者，选择包含TMB、MSI等复杂标志物在内的更大范围的基因包检测显然获益更大。当客观条件下患者无法取得肿瘤标本时，可选择液体活检标本，如血浆、胸腔积液、脑脊液等检测循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,CtDNA、但值得注意的是，CtDNA的检测存在假阴性的可能，因此建议基因检测的标本首选肿瘤标本，液体活检作为补充手段25J,四、NGS在肿瘤预后评估中的应用肿瘤基因组中某些特异的基因变异可以作为预后评估的标志物，如2013年癌症基因组图谱(TheCancerGenomeAtlas,TCGA)多组学提出的子宫内膜癌的分子分型策略，其中以DNA聚合酶epsilon的催化亚基基因(DNApolymeraseepsilon,catalyticsubunit,POLE)变异为特征的超突变型提示预后较好，MSl型和低拷贝型预后居中，而携带肿瘤蛋白P53(tumorproteinp53,TP53)基因变异为特征的高拷贝型预后最差。该分型策略可以协助评估患者预后和复发风险，指导是否需要使用术后辅助治疗260如在甲状腺癌中，BRAFV600E可联合端粒酶逆转录酶基因(telomerasereversetranscriptase,TERTITP53、PIK3CAxKRASxNRAS等基因的变异情况判断肿瘤转移的风险程度，协助临床决定是否手术或手术方式等18o如急性髓性白血病(acutemyeloidleukemia,AML冲,TP53、附力口性梳样1S0(AsXLtranscriptionaIregulator1,ASXL1X矮小相关转录因子1基因(RUNXfamilytranscriptionfactor1,RUNX1)等基因变异和肌球蛋白重链11基因(myosinheavychain11,MYH11XfmS-样酪氨酸激酶-3基因(fmsrelatedreceptortyrosinekinase3,FLT3核孔复合蛋白214基因(nucleoporin214,NUP214)等基因融合可作为预后分层体系的依据27L五、NGS在肿瘤复发监测中的应用肿瘤患者经手术和药物治疗后，选择有效的复发监测方式至关重要。目前传统的肿瘤标志物监测及影像学检查的灵敏度和特异性偏低，无法早期监测到肿瘤的进展。NGS技术对CtDNA的检测可实现肿瘤动态变化的早期实时监测。患者在体内的残留恶性肿瘤细胞，即微小残留病灶(minimalresidualdisease,MRD)会不断向血液中释放CtDNA,NGS通过高深度的测序以及与之前的组织基线检测结果对比，可实现对这些CtDNA的检测，捕捉肿瘤进展的早期信号，提示临床需密切关注患者的复杳结果,为临床治疗方案的调整提供警示和参考信息。但MRD结果要结合组织基线结果，且阴性结果的解读需要更加谨慎，因此MRD在临床的应用仍有较多限制。六、NGS在临床应用中的局限性和解决方法NGS技术还处于不断发展的阶段，在临床的应用也存在许多挑战。目前国内NMPA获批的NGS检测试剂盒数量有限，无法满足临床的全部需求，且暂无包含TMB、MSI等复杂生物标志物的基因包试剂获批。大多数临床检测项目都是基于实验室自建方法(IabOratOrydevelopedtest,LDT)建立的，验证过程复杂，试剂种类、探针设计、测序平台的选择繁多，对于临床实验室而言是一项具有挑战性的工作。NGS结果解读需要有相应的临床生物信息分析和解读人员来完成，要求具备生物信息学、分子生物学、病理学和临床肿瘤学等专业背景。因此,NGS的临床应用在医院端落地时,实验室的硬件设施和人才配备等方面都还有不少困难。随着生物学、基础医学、肿瘤分子学等研究的不断深入，肿瘤的诊疗方式对基因检测的依赖度会不断提高，而对于分子检测技术的要求也会不断提高，以此推动各种技术的不断革新和完善。各种政策将会Jl质应临床需求而出台，如LDT管理细则等；检测的成本也将随着技术的改进而不断下降,生信人员的培训工作目前也在广泛开展，同时相应规范、指南也在逐步确立，NGS技术在肿瘤临床诊疗中的应用会日益广泛，从而能造福更多的患者.七、问题与展望现阶段的测序技术仍在不断发展，许多前沿学科也在不断向临床应用方向探索,如基于CtDNA测序的基因变异信息、甲基化检测等遗传特征分析，但如何降低克隆性造血细胞等背景噪音的干扰，保证检测结果的准确性非常关键；如利用单细胞测序技术分析、解读肿瘤亚克隆演化与疾病进展的关系，但如何保证高质量捕获效率以及低脱落率的扩增技术仍是亟待解决的问题；如利用转录组测序技术在更为精细的层面揭示肿瘤细胞在诊疗过程中驱动基因的时空变化，对于数据分析和解读能力的要求非常严格。这些测序方法虽然仍在探索的道路上，但是相信随着技术的革新、流程的标准化以及成本的下降，将会在临床应用中提供更丰富、更精准的信息，指导疾病的诊疗.