梅毒的实验室诊断.ppt
梅毒的实验室诊断,梅毒概况,梅毒是由梅毒螺旋体引起的一种慢性、系统性性传播疾病。人体受感染后，螺旋体很快播散到全身，几乎可侵犯全身各组织与器官，临床表现多种多样，且时显时隐，病程较长中华人民共和国传染病防治法规定要管理的性病是艾滋病、淋病和梅毒，应加以重点防治。卫生部性病防治管理办法则规定除上述3种病以外，还有生殖器疱疹、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎（NGU）、性病淋巴肉芽肿均为监测性疾病梅毒早期主要侵犯皮肤及粘膜，晚期除侵犯皮肤、粘膜外，还可侵犯心脏血管系统及中枢神经系统等全身各个系统；另一方面，梅毒又可多年无症状而呈潜伏状态,梅毒的分期,一期梅毒：主要表现为单个、无痛性的硬下疳，通常在感染梅毒螺旋体后34周出现二期梅毒：一期梅毒不经治疗，梅毒螺旋体在几周至几个月后会播散至血液中，引起二期梅毒。二期梅毒的临床表现多种多样，常见的有发热、淋巴结病、弥漫性皮疹、生殖道或会阴湿疣等。一、二期梅毒统称为早期梅毒三期或晚期梅毒：一般在最初感染的数年至十数年后发生，可累及任何器官，常见的有梅毒瘤性梅毒、心血管梅毒及神经梅毒隐性梅毒：无症状但梅毒血清学试验呈阳性。分为早期隐性梅毒（病程一年以内）和晚期隐性梅毒（病程一年以上）,一期梅毒硬下疳皮损,二期梅毒皮损,梅毒和一些其他性病均与艾滋病密切相关，从社会学角度来看，凡人群中梅毒发病率高，意味着人群中性乱现象严重，提供了艾滋病流行的条件；从医学角度来说，患有梅毒的人，因有局部溃疡，可明显增加带有CD4受体信息的目标细胞，故对HIV感染的易感性增加2-10倍。同样，HIV感染者伴有梅毒，其生殖道排出的HIV的量要比仅有HIV感染者排出的量大得多梅毒和HIV合并感染的比例很高。就梅毒治疗而言，对HIV阳性患者需要更多地进行监测和跟踪，因为其治疗失败的可能性比较大神经梅毒在HIV感染者中出现的比例也明显增加在HIV感染者中，梅毒血清学反应有时会出现难于解释的现象，因此对于临床怀疑梅毒感染而血清学试验又表现为阴性者，建议考虑HIV检查,梅毒与HIV感染,梅毒的治疗,非口服途径的青霉素可用于各期梅毒的治疗早期梅毒的治疗首选240万单位苄星青霉素G单次肌肉注射。对青霉素过敏者，替代治疗方案有强力霉素（口服，100mg一次，每日2次，持续2周）或四环素（口服，500mg一次，每日4次，持续2周）早期隐性梅毒的治疗方案与早期梅毒相同。晚期隐性梅毒的首选治疗方案为每周一次肌肉注射240万单位苄星青霉素G，持续3周；对青霉素过敏者，替代治疗方案有强力霉素（口服，100mg一次，每日2次，持续4周）或四环素（口服，500mg一次，每日4次，持续4周）合并HIV感染者的治疗方案同晚期隐性梅毒梅毒瘤性梅毒和心血管梅毒的治疗方案与晚期隐性梅毒相同。神经梅毒的治疗只能采用青霉素，具体方案为静脉注射水溶性青霉素G（每4小时300万400万单位，持续1014天）或肌肉注射普鲁卡因青霉素G（240万单位一天，持续1014天）同时口服丙磺舒（500mg一次，每日4次，持续1014天）孕妇的治疗只能采用青霉素，青霉素过敏者需经脱敏后再进行治疗,暗视野显微镜检查法：主要的梅毒病原学诊断方法。是最特异的一期梅毒检测方法。取材部位以硬下疳为主，亦可从宫颈、阴道、淋巴结等处取材。阳性可确诊，阴性不能排除梅毒（须在3周内不同的3天采样检测，才能得出阴性结果）。暗视野显微镜法诊断的准确性受操作者的经验、病灶中活螺旋体的数量及口腔、肛门破损处存在的非致病性螺旋体等因素影响镀银染色法：与暗视野检查法的临床意义基本相同。利用梅毒螺旋体具有亲银性，可被银溶液染成棕黑色，再通过普通高倍显微镜进行观察直接免疫荧光法（DFA)：是目前国外采用较多的方法，其特异性及敏感性均优于暗视野检查法。将特异性的抗梅毒螺旋体单克隆抗体用荧光素标记，如标本中存在梅毒螺旋体，则通过抗原抗体特异性结合，在荧光显微镜下可见到发苹果绿色的梅毒螺旋体。此法可区分梅毒螺旋体和其他非致病性或条件致病性螺旋体,梅毒的病原学检测（一）,暗视野显微镜法直接镜检图像（1000）,间接免疫荧光法镜检图像（1000）,聚合酶链反应（PCR）：PCR能对生殖器溃疡进行早期的鉴别诊断，区分梅毒、生殖器疱疹和软下疳。它又可分为PCR和RT-PCR。PCR的设计主要针对编码梅毒螺旋特异性抗原和TpN47的DNA开放编码区，常见的引物有K03A、K04、47-1、47-2、47-3、47-4等。由于在PCR中会偶然出现非特异的PCR产物而干扰结果，这就必须用特异性的DNA探针进行DNA-DNA杂交来提高PCR的特异性及敏感性。此外，由于TpN47的保守性，雅司螺旋体可产生类似的PCR产物，所以这种设计的PCR不能区分梅毒和雅司；但可以区分梅毒螺旋体和引博氏疏螺旋体，这就可以解决梅毒与莱姆病之间血清诊断中的免疫交叉问题。另一种是RT-PCR，常见的设计是针对梅毒螺旋体的16s rRNA 366bp片段，这种方法污染少，特异性敏感性高，但价格稍高。PCR在梅毒持续感染中的诊断价值目前尚无一致意见，理论上PCR可查出死亡的TP，所以治疗后PCR阳性并不意味着治疗失败，但死亡的TP从机体内清除较快（1530天），而存活的TP从机体内清除至少需120天，所以治疗数周后PCR阳性意味着持续感染的可能。此外，也有将PCR用于产前诊断和神经梅毒诊断的报道,梅毒的病原学检测（二）,人类对梅毒无先天免疫性，尚无疫苗接种进行人工免疫，仅能在受感染后产生感染性免疫。已完全治愈的早期梅毒患者仍可以再感染感染梅毒后，首先产生IgM型抗梅毒螺旋体抗体，感染2周后即可测出，早期梅毒抗梅治疗39个月后或晚期梅毒治疗2年后，大部分病人IgM可转阴性，再感染时又出现阳性，故IgM型抗体的存在是活动性梅毒的表现感染梅毒4周左右产生IgG型抗梅毒螺旋体抗体，即使经足量抗梅治疗，梅毒螺旋体抗原消失后很长时间，IgG抗体仍可通过记忆细胞的作用继续产生，甚至终生在血清中可测出,梅毒的免疫性（一）,梅毒的免疫性（二）,另一种具有抗体性质的物质叫反应素（reagin），是梅毒螺旋体破坏人体组织过程中释放出的一种抗原性心磷脂刺激机体所产生的抗体。反应素一般在感染后57周（或下疳出现后23周）产生。经正规治疗后可逐渐消失胎儿在宫内感染梅毒螺旋体后，胚胎晚期（69个月）已能合成IgM型抗体，出生后第3个月开始形成IgG型抗体；IgM抗体不能通过胎盘，而IgG抗体能通过胎盘，如在患儿血清中检侧出IgM抗梅毒螺旋体抗体是诊断先天性梅毒的有力证据（但IgM阴性并不能排除先天性梅毒）,非梅毒螺旋体抗原血清试验：是以心磷脂、卵磷脂及胆固醇作为抗原检查血清中的反应素，用于初筛试验及疗效观察。可以分为以下四种试验，原理基本相同 1、性病研究实验室玻片试验（VDRL)：试剂需现配现用，且要在显微镜下观察结果，故国内实验室很少采用。但VDRL是诊断神经性梅毒最特异的血清学方法 2、不加热血清反应素试验（USR)：试剂无需现配现用，但仍要在显微镜下观察结果，现已很少使用 3、快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)：在特制的纸片上进行，加入一定量特制的炭粉，可使抗原抗体出现凝集，用肉眼可观察结果 4、甲苯胺红不加热试验（TRUST)：在试剂中以红色的甲苯胺红颗粒代替黑色的炭粉颗粒，使结果更易于观察,非特异性梅毒血清学试验（一）,VDRL阴性（100）,VDRL弱阳性（100）,VDRL阳性（100）,RPR凝集图像,TRUST凝集图像,非梅毒螺旋体抗原血清试验的缺陷 1、特异性：在多种疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、结缔组织病、肿瘤、静脉吸毒者、老年人以及怀孕妇女中均可出现反应素，所以此类试验有时会出现假阳性反应 2、敏感性：感染梅毒后反应素的出现时间晚于特异性梅毒螺旋体抗体，因此非梅毒螺旋体抗原血清试验对一期梅毒的漏检率较高。RPR或TRUST有时出现弱阳性或阴性结果，而临床上又像二期梅毒，此时应将此血清稀释后做定量试验，如出现阳性结果，则为抗体过量引起的“钩状效应”，12的二期梅毒病人可出现此现象而发生假阴性反应。此外，晚期梅毒反应素转阴率高，再加上这类试验对隐性梅毒也不太敏感，因此用此类试验进行梅毒筛查时，存在着相当数量的漏检非梅毒螺旋体抗原血清试验的优点 1、非梅毒螺旋体抗原血清试验阳性的患者往往是梅毒现症感染者，临床上即可开展治疗 2、非梅毒螺旋体抗原血清试验表现为滴度随成功的治疗而逐渐下降，故可以作为疗效观察的指标 3、此类方法价格低廉,非特异性梅毒血清学试验（二）,测定非梅毒螺旋体抗原血清试验的滴度进行疗效观察 1、治疗成功：早期梅毒患者在治疗后6个月内症状消失且非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度有至少4倍的下降。晚期梅毒或隐性梅毒患者在治疗后1224个月内非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度有至少4倍的下降 2、治疗失败：治疗后症状持续或重新出现；治疗后非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度反而上升了4倍或以上；非梅毒螺旋体抗原血清试验初始滴度较高（1:32或以上）但在六个月内没有达到4倍的下降。抗梅毒治疗失败的病人应考虑合并HIV感染及神经梅毒的可能性 3、血清固定：经正规治疗后，梅毒患者非梅毒螺旋体抗原血清试验一般都会转为阴性，但有13%的病人即使经足量抗梅治疗，非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度仍持续呈低滴度阳性，这种现象称为血清固定，其原因尚不明了。血清固定患者的滴度重又上升则提示再次感染梅毒,非特异性梅毒血清学试验（三）,梅毒螺旋体抗原血清试验：用梅毒螺旋体作为抗原检测血清中的抗螺旋体IgM和/或IgG抗体，其敏感性和特异性均高于非梅毒螺旋体抗原血清试验，但不能用作疗效观察的指标。常用的有以下五种方法：1、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS)2、梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）3、梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA)4、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）5、梅毒螺旋体快速诊断试验（TP-RT）,特异性梅毒血清学试验（一）,荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS)FTA-ABS是所有螺旋体试验中最敏感的方法，特异性也很高，被认为是检测梅毒的“金标准”。且该试验可分开检测IgM和IgG 但是，该方法在技术操作上也是最困难的，试验的操作以及结果的判读都必须加以核实。试验可靠性的关键是标准化的结果判断、高质量的荧光标记抗体以及适当的稀释度。由于实验室操作繁琐以及主观判读经常产生错误结果，因此增加标记荧光标记染料的复染可以减低标准化过程中的错误并增加其可读性及重复性 由于该试验需有优质的荧光显微镜和技术熟练的操作人员才能得到准确的结果，故常不被临床实验室作为常规方法开展,特异性梅毒血清学试验（二）,FTA-ABS IgG抗体阳性（400）,FTA-ABS IgM抗体阳性（400）,梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）原理：用超声裂解的梅毒螺旋体为抗原，致敏经醛化、鞣化的羊或禽类红细胞，此致敏红细胞与人血清 或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可观 察的凝集反应优点：该方法比FTA-ABS易操作且稳定性好，它的敏感 性除早期梅毒外与FTA-ABS相似，对大样本进行 批量检测时，TPHA也比FTA-ABS易操作不足：由于红细胞具有生物活性，可能产生非特异性凝 集，且保存时间较短，批间差较大，故实际使用中 也存在一些问题,特异性梅毒血清学试验（三）,TPHA凝集图像,梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）原理：TPPA的原理与TPHA基本相同，但它以人工合 成的惰性明胶颗粒代替TPHA中的红细胞作为载 体，是TPHA的升级产品 优点：1、试剂稳定，批间差小 2、结果判读更为清晰明确 3、敏感性和特异性较TPHA进一步提高 不足：结果判定主观，较难实现自动化,特异性梅毒血清学试验（四）,明胶颗粒的制备,特异性梅毒血清学试验（五）,TPPA凝集图像,梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）原理：以梅毒螺旋体抗原包被聚丙乙烯板，再加入待检 血清以及酶标记抗原，形成双抗原夹心，同时检 测 IgG和IgM抗体。少数试剂采用间接法，使用 酶标记抗人IgG或IgM，分开检测IgG或IgM 优点：1、敏感性和特异性较高 2、价格较低，适合于对大量样品的筛查 3、可实现操作的自动化、客观化 不足：ELISA试剂盒品牌众多，各家采用的抗原和工艺 不同，使敏感性和特异性产生较大的差异，临床 实验室在选用ELISA试剂前应认真进行评估,特异性梅毒血清学试验（六）,酶联免疫吸附试验检测梅毒螺旋体IgM抗体 原理：ELISA间接法或捕获法，以捕获法的敏感性和特 异性为佳。由于血液中 IgG 的量大大高于 IgM，为避免交叉反应所引起的假阳性，一般须对样本 进行预处理，先去除其中的 IgG 然后再进行IgM 测定。分离去除 IgG 的常用方法为柱层析法或免 疫沉淀法（沉淀剂为抗人IgG等）用途：1、先天性梅毒的诊断 2、活动性梅毒（新近感染）的诊断及疗效观察 3、梅毒再感染的诊断 结果解释：IgM阳性是先天性梅毒或活动性梅毒的重要证 据，但阴性结果并不能排除感染的可能性,特异性梅毒血清学试验（七）,梅毒螺旋体快速检测试验（TP-RT）原理：双抗原夹心免疫层析试验或间接法免疫渗滤试验，多采用胶体金进行标记，同时检测IgG、IgM抗体（双抗原夹心法）或单测IgG抗体（间接法）优点：1、简便、快速，不需要特殊的仪器 2、适合于单人份操作，可用于较紧急和实验室条 件差的场合 不足：1、临床评估资料不多，敏感性、特异性尚有待进 一步考查 2、无法实现自动化，结果判断主观 3、测定结果受温度和时间的影响较大 4、价格较高,特异性梅毒血清学试验（八）,免疫印迹试验,梅毒的免疫印迹试验（Western blot）与作为HIV抗体确认的免疫印迹试验采用相同的原理和技术既可检测IgG抗体，也可检测IgM抗体目前已有商品化的试剂盒供应，但价格高昂检测特异性的梅毒抗体条带，其分子量分别为15.5、17、45.5和47kd梅毒IgG免疫印迹试验的敏感性和特异性均可达到甚至超过FTA-ABS的水平有文献报道，梅毒IgM免疫印迹试验对先天性梅毒的诊断可能很有意义，其特异性至少达到90%，而敏感性达83%以上，高于FTA-ABS 19S IgM 73%的水平,梅毒螺旋体抗体免疫印迹试验（IgG）,关于梅毒血清学试验程序的探讨（一）,先以非梅毒螺旋体抗原血清试验（RPR、TRUST等）进行初筛，再以梅毒螺旋体抗原血清试验（TPPA、TPHA、ELISA等）进行确认 优点：非梅毒螺旋体抗原血清试验价格低廉，使梅 毒检测的成本可以保持在低水平 缺点：非梅毒螺旋体抗原血清试验的敏感性较差，导致临床上易出现漏检的情况同时进行梅毒螺旋体抗原血清试验和非梅毒螺旋体抗原血清试验 优点：这是从技术上而言的最佳方案 缺点：人力和试剂成本较高先进行梅毒螺旋体抗原血清试验，阳性时再进行非梅毒螺旋体抗原血清试验,关于梅毒血清学试验程序的探讨（二）,梅毒螺旋体抗原血清试验（TPPA等）,关于梅毒血清学试验程序的探讨（三）,一些适合使用梅毒螺旋体抗原血清试验(TPPA等)进行筛查的情况：皮肤、性病门诊 输血前检查 手术前检查 入院检查 产前检查 检验检疫,先天性梅毒的诊断,先天性梅毒的诊断要结合临床表现、物理检查、影像检查、血清学检查和直接显微镜检查进行综合判断先天性梅毒的临床症状主要包括鼻音、肝脾肿大、皮损、骨软骨炎等，50%的梅毒患儿出生时无异常表现，多数在3周至6个月时出现上述症状中的一项或几项。可能更晚出现（2年以后出现）的其它特征有畸型、耳聋、失明、弱智等由于母体的螺旋体直接进入胎儿的血循环，因此先天性梅毒均直接表现为二期梅毒从脐带、胎盘、新生儿皮损处采样，在显微镜下直接检查到梅毒螺旋体可确诊断先天性梅毒新生儿的梅毒抗体滴度若高于母亲，可诊断先天性梅毒（此种情况约占22%），但相反的情况却不能排除新生儿梅毒特异性IgM抗体检测阳性可诊断先天性梅毒，但阴性则不能排除从母体被动获得的梅毒IgG抗体在新生儿体内代谢、清除需要1218个月时间，因此通过随访排除或确诊先天性梅毒的时间为1年半左右新生儿梅毒特异性抗体检查阳性，同时脑脊液VDRL呈阳性或在物理检查中发现有先天性梅毒的体征，也可推断先天性梅毒,先天性梅毒患儿,先天性梅毒新生儿脐带切片DFA图像,神经梅毒的诊断,神经梅毒的发生率在未经治疗的梅毒病人中约为10%。早期梅毒出现神经症状（痴呆、精神抑郁、共济失调、失语症、局部麻痹、反向亢进、人格和认知障碍、失聪、视力改变等）或晚期梅毒即使没有出现神经症状，都应该考虑神经梅毒的可能性单单依靠实验室检测的结果在很多情况下难以明确诊断神经梅毒，必须将临床表现和实验室检测结果结合起来，进行综合判断梅毒螺旋体抗原血清试验阴性可排除神经梅毒，但阳性不能确诊，须进一步进行脑脊液检查。TPHA指数（脑脊液与血清TPHA的比值）可能对诊断有所帮助脑脊液VDRL结果阳性对神经梅毒的特异性高，但阴性时不能排除，须进行重复检测脑脊液白细胞计数超过10个/mm3，且脑脊液VDRL阳性（或VDRL阴性但有神经症状）可诊断神经梅毒脑脊液蛋白水平高于50mg/dl，或脑脊液螺旋体DNA PCR阳性也有助于神经梅毒的诊断治疗后每6个月应检查一次脊液白细胞计数直至该指标恢复正常。若治疗后6个月脑脊液白细胞计数仍不下降或2年后仍未降至正常水平，则应考虑重新治疗,两个特殊人群的梅毒诊断,老年人:老年人群（特别是80岁以上）的梅毒抗体阳性率要高于其他人群，但许多梅毒螺旋体抗原血清试验和/或非梅毒螺旋体抗原血清试验呈阳性的老年病例并没有明显的临床症状。这可能是既往感染或隐性感染的情况，也可能是检测方法的假阳性所致，但一般情况下很难明确区分。实验室应明确记录检测结果，并建议临床根据实际情况进行处理孕妇 晚期妊娠时，少数情况下可突然出现梅毒特异性抗体和/或反应素阳性，应提醒临床注意既往梅毒感染复发或假阳性的可能性，并进行随访观察,谢 谢！,
