流式细胞仪原理.ppt
流式细胞仪原理与应用,提 要,流式细胞仪简介流式细胞仪工作原理流式实验流程流式细胞术的应用,流式细胞术的发展史,1930s1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器。）1960s晚期发展：荧光检测细胞计、细胞分选器检测细胞的荧光信号、单克隆抗体技术 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。,什么是流式细胞仪？,在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器仪器特点：单个细胞通过狭窄激光束，产生能够反映细胞大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标记的细胞成分能发射出不同的荧光。,流式细胞仪的检测对象,藻类细胞,染色体,血细胞,原生动物细胞,任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米的粒子或细胞都适用于流式分析,流式细胞仪工作原理示意图,流式的基本组成：1.流动室和 液流系统2.光路系统3.电系统,流式细胞仪可提供的信息,物理信息：通过散射光信号反映相对细胞大小相对细胞颗粒密度和内部复杂度荧光信息：通过荧光强度反映,散射光信号的产生,488nm激光产生散射光,1.散射光信号,前向角散射光（FSC,Forward Scatter）入射激光的同向散射光信号 反映细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC,Side Scatter）入射激光90角的散射光信号 反映细胞粒度及细胞内相对复杂性,散射光,散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异通常使用“散点图”来看散射光信号散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据,利用散射光信号对混合细胞分群,2.荧光信号,荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强,荧光信号的表示方法,双参数点图,单参数直方图,一个完整流式实验的组成,样品的处理调整仪器条件数据处理,1.样品处理,单细胞悬液的制备浓度51051 106/mL外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤)制成单细胞悬液选择合适的荧光染料染色必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内荧光素光谱的重叠应当尽量减少,2.仪器条件的确定,电压阈值荧光补偿（多色分析）,处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通过光电探测器转换成电信号（电压）。调整电压，可使信号强度改变。BD流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极管和光电倍增管（PMTs）。PMT用于检测较弱的SSC信号和荧光信号，光电二极管用于检测较强的FSC信号,电压,阈值,阈值：信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。,荧光补偿,采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差,荧光补偿,补偿调整的实验过程,样本准备：阴性样本，单阳性样本调整：第一步：阴性样本调整所有PMT 第二步：单阳性样本调整补偿判断标准：,补偿模型,PE-X%FITC,补偿前,补偿后,FITC单染,数据分析,设门设定阴性与阳性群体的界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数,设门,设门的意义：选定要分析的目标细胞,设门,如何设定阴性与阳性的界限,流式检测结果的表示方法,百分率绝对计数平均荧光强度图形：直方图、散点图,流式细胞仪可以告诉我们什么？,流式细胞术的细胞学应用,细胞结构细胞大小细胞流式细胞术的细胞学应用粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量染色体分析,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体细胞凋亡,流式细胞仪在微生物研究中的应用,DNA蛋白过氧化物生成胞内pH鉴别死/活细菌和酵母菌并计数区分革兰氏阳/阴性细菌研究酵母菌细胞器基因表达-绿色荧光蛋白病原菌与吞噬细胞的关系-吞噬引起的呼吸爆发病毒-细胞相互作用：病毒感染导致细胞蛋白表达的改变，对细胞周期的干扰，对细胞内钙离子水平的影响病毒引起的凋亡,流式细胞仪的临床应用,HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病,补偿调整实验,藻类细胞绝对计数,细胞周期分析,DNA含量分析-PI染色,细胞凋亡,细胞膜分析-PS外翻 PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-V可与PS结合,细胞凋亡,细胞生理学研究,Ca2+流动性检测Ca2+是非常重要的细胞内离子，在胞膜到胞浆的信号转导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内Ca2+浓度会发生改变。最常用的染料Indo-1 excited at UVFluo-3 excited at 488nmFura red excited at 488nm,细胞生理学研究,细胞活性分析 Fluorescein Diacetate进入活细胞后,被胞内酯酶降解,生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光,细胞生理学研究,细胞膜电位的改变超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总的荧光强度减少。染料和试剂DiOC6(3)DiOC5(3)DiOC1(3)DiOC1(5)Valinomycin Gramicidin D CCCP,细胞内标记,胞内多种肽类已被成功标记，包括病毒颗粒、免疫球蛋白、雌激素受体、细胞因子、特殊蛋白如Bcl-2和cyclooxygenase.胞内细胞因子磷酸化蛋白,
