兽医临床诊疗技术第2章实验室检验.ppt.ppt

第2章 实验室检验,实验室检验就是运用物理学、化学和生物学等实验技术和方法，对病畜的血液、尿液、粪便、体液（如胃液、脑脊髓液、胸腹腔穿刺液）、组织细胞及病理产物，在实验室特定的设备和条件下，测定其物理性状，分析其化学成分，或借助于显微镜观察其有形成分的方法，以获取反映机体功能状态，病理变化或病因等客观资料，配合临床资料进行综合分析。,实验室检验是一种复杂而细致的工作，为了得到正确的结果，必须遵守严格的操作规程和次序。采取的样本必须有代表性，检验所用的试剂与器材，应符合要求，并定期进行检查和校正。要注意消毒工作，污染的器皿应先消毒后洗涤，以防传染性物质的扩散。,血液检验尿液检验粪便检验瘤胃液的检验穿刺液的检验常见毒物的检验,第一节 血液检验,血液检验是临床医学检验中应用最广，对辅助诊断最有价值，最常用的基本内容之一。血液是由血浆和血细胞两部分组成，是通过循环系统与全身各个组织器官密切联系，参与机体呼吸、运输、防御，调节生理，维持正常新陈代谢和内外环境平衡的。,临床血液学检查内容,物理学检查：借助物理学方法测定其物理特性，如凝血时间、红细胞脆性、红细胞沉降率、红细胞压积。化学检验：即用定性或定量的化学分析方法，检测被检标本各种化学成分方面的变化，如血红蛋白的检查。显微镜检查：检查其血细胞的形态及数量的变化，如红细胞，白细胞，血小板等。,一、血液的采集与血涂片的制作,血液样本的采取与抗凝,猪的前腔静脉采血,马的颈静脉采血,兔的耳静脉采血,血液的抗凝,草酸盐 是常用的抗凝剂，每1.5-2.0mg可抗凝1.0ml血液，可用于血液常规检验。因对红细胞大小有影响，故不能用红细胞压积测定，如测定红细胞压积时，可用双草酸盐抗凝剂或乙二胺四乙酸二钠。,双草酸盐抗凝剂 草酸钾 0.8g草酸铵 1.2g蒸馏水 加至100ml 溶解后吸取0.5ml，加入供采血试管或小瓶中，置干燥箱内（温度不超过80）烘干备用，可供5ml全血抗凝。,血液检验,乙二胺四乙酸（EDTA）盐 可适用于一般的血液学检查，特别是血小板计数，但因为影响血小板聚集和白细胞吞噬功能，不适合于血象及血小板功能检查。（EDTANa2H2O）每10mg可使5ml全血抗凝；或配成10%的溶液，每2滴可使5ml全血抗凝。（EDTAK22H2O）1%溶液0.1ml可使5ml血液不凝固。全血细胞分析及血细胞比容测定。,3.8%枸橼酸钠溶液 每1ml可使4ml全血抗凝。常用于血沉、凝血因子和血小板功能检查。因其毒性小又可作为血液保养液。但不适用于血液化学检验。由于抗凝剂溶解缓慢，故只能配成溶液，不能用粉剂。,血液检验,肝素 肝素价格最贵，其优点是抗凝作用强，不影响血细胞的体积，不致溶血等，可用于多种血液生物化学分析和红细胞压积测定。但过量的肝素可引起白细胞聚集和血小板减少，故不适用于白细胞和血小板计数，也不适用于血涂片检查，因其在瑞氏染色时会出现蓝色背景，更不能用于血液学一般检查。,肝素是生理性抗凝剂,广泛存在于肺、肝、脾等几乎所有的组织和细胞周围，肥大细胞和嗜碱性粒细胞的颗粒中。它是一种含硫酸基团的黏多糖。抗凝机制较为复杂，主要是加强抗凝血酶灭活丝氨酸蛋白酶的作用，从而阻止凝血酶的形成，并有阻止血小板聚集等多种抗凝作用。通常用肝素粉剂配成1g/L水溶液。取0.5ml置小瓶内，放于3750中烘干后贮于冰箱内保存。能使5ml血液不凝固，肝素抗凝剂应及时使用，放置过久易失效。,如分离血清，应将全血采集在试管中（不加抗凝剂），在室温下或25-37温水中斜置，血清析出后即可分离。血浆应在抗凝血采集后离心分离。血液采集后应尽快送检和检测。不能立即送检的血样，血片应固定，抗凝血、血浆和血清应冷藏。送检血样应编号，并避免剧烈振摇。血液学检查项目与血样保存的期限见下表,血样的处理,注意:怀疑传染病时，采血应防止到处流散，检后残余血液及所用器皿应进行消毒处理。,红细胞背景知识,红细胞也称红血球，是血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介。在所有的脊椎动物及若干无脊椎动物，其血红素包含在特定的细胞中来进行其机能活动，这种血球称为红细胞。其它的血细胞，如白血球，则是免疫细胞。,红细胞中含有血红蛋白，因而使血液呈红色。血红蛋白能和空气中的氧结合，因此红细胞能通过血红蛋白将吸入肺泡中的氧运送给组织，而组织中新陈代谢产生的二氧化碳也通过红细胞运到肺部并被排出体外。血红蛋白更易和一氧化碳相合，当空气中一氧化碳含量增高时，可引起一氧化碳中毒。红细胞和血红蛋白的数量减少到一定程度时，称为贫血。红细胞大量被破坏可引起溶血性黄疸。红细胞描述：多，小而圆，中央着色较浅，无核。禽类称为凝血细胞，一般为卵圆形，有细胞核，比哺乳动物的大得多，数量少。,血液涂片的制备和细胞染色,、涂片的制作,选取一张边缘平滑的载玻片作为推片(最好此载玻片稍窄或磨去两角),用左手的拇指与中指夹持一张载玻片，取被检血液一滴(最好是未加抗凝剂的新鲜血)置载玻片的一端，然后右手持推片倾斜30-40角，由血滴的前方向后接触血滴，待血液扩散成线状后，立即以均等的速度轻而平稳地向前推进，即形成血膜。,涂片时，血滴越大，角度越大，推片速度越快，则血膜越厚，反之则血膜越薄。白细胞分类计数的血片宜稍厚，进行红细胞形态及血原虫检查的血片宜稍薄。一张良好的血片，要求厚薄适宜，血液分布均匀，对光观察呈霓虹色，边缘整齐，能明显分出头，体，尾三部分，两侧留有空隙(以写明畜别，编号、日期)。血膜分布不匀，主要是由于推片不齐，用力不匀，玻片不洁所致。推好的血片可在空气中挥动，使其迅速干燥，以防细胞皱缩变形，并尽快固定染色。,为了观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须进行染色。,原理,染色是染料透入被染物并留存其内部的一种过程，此过程既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同，对染料的亲和力也不一样。例如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染成红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染成紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态，与伊红和美蓝均可结合，染成紫红色，称为中性物质。,、细胞染色,瑞氏染色法姬姆萨氏染色法瑞姬氏复合染色法,（）瑞氏染色法,瑞氏染料：酸性染料伊红、碱性染料亚甲蓝瑞氏染液：瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml。将染色粉置于研钵中，加少量甲醇研磨，使其溶解，将已溶解的染液倒入洁净的棕色玻璃瓶中，剩下未溶解的染料再加少量甲醇研磨，如此继续操作，直至全部染料溶解并用完甲醇为止。在室温中保存7日，每日震摇一次，过滤后即可应用。新配的染液偏碱性，放置后可呈酸性。保存时间愈久，染色能力愈佳。涂片滴加染色液置min加磷酸盐缓冲液混合均匀5min水冲洗自然干燥镜检(所得血片呈樱红色者为佳),（）姬姆萨氏染色法,姬姆萨氏染料：酸性染料伊红、碱性染料天青姬姆萨氏染液：姬姆萨氏染粉0.5g，中性甘油33ml，中性甲醇33ml。将染色粉置于研钵中，加少量甘油，充分研磨；加入所余甘油，在5060水溶液中保温12h，并用玻棒搅拌，使染粉溶解；最后加入甲醇，混合后装入棕色瓶中，保存7日后过滤即成原液染色时取原液0.51ml，加pH6.8磷酸盐缓冲液10ml，即成应用液。涂片甲醇固定min置于染色液中染min水洗吸干镜检(玫瑰紫为佳)对细胞核与寄生虫效果好,（）瑞姬氏复合染色法,瑞姬氏复合染液：瑞氏染粉5.0g，姬姆萨氏染粉0.5g，甲醇500ml。将两种染粉置于研钵中，加少量甲醇研磨，倾入棕色瓶中，用剩余甲醇再研磨，最后一并装入瓶中保存7日后过滤即成。涂片滴加染液0.5 min后加等量缓冲液 min吸干镜检。,磷酸盐缓冲液(PH6.4-6.8)：磷酸二氢钾0.3g加磷酸氢二钠0.2g再加蒸馏水至1000ml,配制成磷酸盐缓冲液调整pH,如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。,二、血液常规检验,红细胞沉降率的测定红细胞压积容量测定红细胞渗透脆性的测定血液凝固时间测定血红蛋白(Hb)含量测定 血细胞检验 血小板计数,内容,定义:血液加入抗凝剂后，一定时间内红细胞向下沉降的毫米数，叫做红细胞沉降速度，简称血沉（ESP）。,红细胞沉降率测定,血液检验,魏氏法,先向10ml刻度试管中加入3.8%枸橼酸1ml，再自静脉采血4ml，颠倒混合数次，然后用魏氏血沉管吸取抗凝剂至刻度0处，擦去管外血液，在室温条件下，垂直放于血沉管架上，经15、30、45、60min，分别观察并记录细胞沉降数值。,方法 1,血液检验,“六五”型血沉管法,于血沉管中加入抗凝剂（草酸钠0.0150.02g，枸橼酸钠粉末0.040.05g）,自颈静脉直接采血至刻度“0”处，立即充分混合，于室温垂直立于试管架上，镜15、30、45、60min各观察一次，并记录红细胞沉降的数值。,方法 2,血液检验,各种动物的正常血沉值,测定血沉时必须用新配制的抗凝血；血液与抗凝剂混合要充分，柱面上不应有气泡，它可使血沉变慢；用魏氏法测定时，事先应检查血沉架是否好用，以防漏液；测定时室温以20左右为宜，温度过低可以减慢血沉。,临床意义,定义:是指压紧的红细胞在全血中所占的百分率,是鉴别贫血的一项不可缺少的指标,简称比容。,红细胞压积容量测定,红细胞压积容量测定管（温氏测定管）长约11cm,内径约2.5mm，管壁刻有0-10cm刻度，分度刻度1mm。,用毛细玻璃吸管或长针头吸满抗凝全血，将血液自上而下挤入温氏测定管内，至刻度10处；3000rpm离心30-40min。读取红细胞柱层的刻度数，即为红细胞压积容量数值，数值用百分率表示。,方法,1、压积升高2、压积降低,各种贫血,临床意义,定义:是指红细胞在低渗氯化钠溶液中的抵抗力，故又称为红细胞抵抗。,红细胞渗透脆性的测定,取10ml刻度试管22支，分别标明管号，每管分别加入个浓度低渗氯化钠溶液5ml，再加入10%红细胞生理盐水悬浮液 2滴，混匀。室温下放置10-15min，离心5min并观察结果。,溶液变为浅桃红色，管底有大量红细胞沉淀，即开始溶血，此管的盐水浓度代表红细胞的最小抵抗；溶液呈深红色，管底无红细胞沉淀，即完全溶血，此管的盐水浓度代表红细胞最大抵抗。,方法,增高,降低,临床意义,定义:是指血液自血管流出直到完全凝固所需的时间，用以测定血液的凝固能力。,血液凝固时间测定,颈静脉采血，见到出血后立即用秒表记录时间。取血一滴，滴在玻片一端，随即玻片稍稍倾斜，滴血一端向上。此时未凝固血液自上而下流动，形成一条血线，放在室温下的平皿内，防止血液中水分蒸发，静置2min，之后每隔30s用针尖跳动血线一次，待针头挑起纤维丝时，即停止秒表，记录时间，即为血凝时间。,方法,玻片法,简单易行，但不及试管法准确,试管法,采血前准备刻度小试管3支，并预先放在25-37恒温水浴箱内。颈静脉采血，剪刀出血立即开始计时。随之将血液分别加入3支试管内，每支试管各加1ml，再将试管放回水浴箱。放置3min后，先从第一管做起，每隔30s逐次倾斜试管一次，直到翻转试管血液不能流出为止，并记录时间。3支小试管的平均时间即为血凝时间。,适用于出血性疾病的研究与诊断,延长,缩短,重度贫血血斑病肝脏病炭疽病,偶见于纤维素性肺炎,临床意义,血液检验,红细胞遇酸溶解，游离出血红蛋白，并被酸化为褐色的酸性血红素，稀释后与标准色柱比色，即可求得血红蛋白的含量。,血红蛋白试纸测定法 器材应备有测定血红蛋白试纸和4g%15g%血红蛋白标准比色板。测定时，取试纸一条，吸附被检血液一小滴，待血完全浸透后，立即置于所附标准色板的小孔下，肉眼与色板色泽进行比较，选择颜色相同或近似者，即得100ml血液所含血红蛋白的克数。,血红蛋白测定,沙利氏血红蛋白测定法 沙利氏血红蛋白计由比色架、标准比色柱、血红蛋白测定管及血红蛋白吸管组成。测定管有两个刻度标志，一侧的224刻度表示100ml血液中含有的血红蛋白克数；另一侧有20160刻度，表示100ml血液中所含血红蛋白的百分数。,在血红蛋白稀释管内加入0.1mol/L盐酸溶液至刻度10%处。用血红蛋白吸管吸取血液至20mm3刻度处，拭净管外附着血液，迅速将试管内血液缓缓吹入血红蛋白洗试管内的盐酸溶液中，再吸取上层盐酸溶液反复吹洗数次，勿使产生气泡。移去血红蛋白吸管，用小玻璃棒搅拌或轻轻摇振，使血液与盐酸溶液混合而呈褐色。将测定管插入比色架内，静置10min。慢慢分次沿测定管壁滴加蒸馏水，边加边混匀，边比色，直至血红蛋白测定管液体的颜色与标准比色柱一致为止，读取测定管液体凹面最低处的刻度数，即为100ml血液内所含血红蛋白的克数或百分数。,方法,血液检验,血红蛋白增高 见于各种原因引起的血液浓缩，如腹泻、呕吐、大汗、多尿及肠梗阻等。血红蛋白减少 见于各种贫血，如马鼻疽、牛结核、牛羊肝片吸虫病、仔猪蛔虫等。,临床意义,红细胞计数白细胞计数白细胞分类计数,血细胞检验,血液检验,红细胞计数是将一定量的供检全血经一定倍数（200倍）稀释后，在血细胞计数板的计数室内，数一定体积的红细胞数，然后再推算出1mm3血液内的红细胞数。,红细胞计数（red blood cell count，RBC）,临床上最常用的是改良纽巴（Neubauer）氏计数板，它是由一块特制的玻璃板构成，玻璃板中间有横沟将其分为三个狭窄的平台，两边的平台较中间的平台高0.1mm。中央平台又有一纵沟相隔，其上各刻有一个计数室。每个计数室划分为9个大方格，每一大方格面积为1.0mm2，深度为0.1mm；四角每一大方格划分为16个中方格，为计数白细胞用。中央一大方格用双线划分为25个中方格，每个中方格又划分为16个小方格，共计400个小方格，此为红细胞计数之用。,血细胞计数板,用5ml吸管吸取红细胞稀释液3.98ml（或4ml亦可）置于试管中。用沙利氏吸血管吸取全血样品至20 20mm3刻度处（或吸血至刻度10处，红细胞稀释液用2ml）。擦去吸管外壁多余的血液，将此血液吹入试管底部，再吸、吹数次，以洗出沙利氏管内粘附的血细胞，然后试管口加塞，颠倒混合数次，再用毛细吸管（或玻棒）吸取已稀释好的血液，放于计数室与盖玻片接触处，即可自然流入计数室中。注意充液不可过多或过少，过多则溢出而流入两侧槽内，过少则计数池中形成气泡，致使无法计数。,计数时，先用低倍镜，光线要稍暗些，找到计数室的格后，把中央的大方格置于视野之中，然后转用高倍镜。在此中央大方格内选择四角与最中的五个中方格（或用对角线的方法数五个中方格），每个中方格有16个小方格，所以共计数80个小方格。计数时注意压在左边双线上的红细胞计在内，压在右边双线上的红细胞则不计数在内；同样，压在上线的计入，压在下线的不计入，此所谓“数左不数右，数上不数下”的计数法则。,计算,1mm3血液中红细胞个数=X/8040020010。X:5个中方格(即80个小方格)内的红细胞总数。400:一个大方格，即1mm2面积内共有400个小方格。200:稀释倍数。10:血盖片与计数板的实际高度是1/10mm，乘10后则为1.0mm。上式简化后为:1mm3红细胞数=X10，000,充液量不可过多或过少，过多可使血盖片浮起，过少则计数室中形成小的空气泡，使计数结果偏低甚至无法计数。显微镜台应保持水平，否则计数室内的液体流向一侧而计数不准。沙利氏吸血管或试管，每次用完后，先用清水吸吹数次，然后用蒸馏水、酒精、乙醚，按次序分别吸吹数次，干后备下次使用。血细胞计数板用蒸馏水冲洗后，用绒布轻轻擦干即可，切不可用粗布擦试，也不可用酒精、乙醚等溶液冲洗。,注意事项,血液检验,健康动物红细胞数（万/立方毫米）,临床意义,白细胞计数white blood cell count，WBC,一定量的血液用冰醋酸溶液稀释后，可将红细胞破坏，然后再细胞计数板的技术室内计数一定容积的白细胞数，一次推算出每立方毫米内白细胞总数。,用1ml吸管吸取白细胞稀释液0.38ml（也可吸0.4ml）置一小试管中。用沙利氏管吸取被检血至20mm3处，擦去管外粘附的血液，吹入小试管中，反复吸吹数次，以洗净管内所粘附的白细胞，充分振荡混合。再用毛细吸管或沙利氏吸血管吸取被稀释的血液，充入已盖好盖玻片的计数室内，静置12min，低倍镜检查。将计数室四角四个大方格内的全部白细胞依次数完，注意压在左线和上线的计入，压在右线和下线的不计入。,1mm3血液中白细胞数=x/42010X：四角四个大方格内的白细胞总数。x/4：一个大方格（面积为1mm2）内的白细胞数。20：稀释倍数10：血盖片与计数板的实际高度是0.1mm，乘10后则为1mm。上式简化后为1mm3血液中白细胞数=x50,计算,血液检验,健康动物白细胞数（个/立方毫米）,临床意义,白细胞分类计数differential count of white blood cell，DC,外周血液中的白细胞主要有5中，即嗜中性白细胞、嗜酸性白细胞、嗜碱性白细胞、淋巴细胞、单核细胞，它们各有其特定的生理机能，在正常时这5种白细胞之间有一定的比例。但在病理情况下，白细胞总数的变化反映机体防御机能的一般状态，各种白细胞之间百分比的变化，则反映机体防御机能的特殊状态。由于白细胞总数的增减并不一定表示各类白细胞平均增多或减少，常常仅限于某一种或两种白细胞数的变化，从而引起白细胞之间百分比的相对改变。因此，白细胞计数对疾病的诊断具有一般意义，而白细胞分类计数则具有具体意义，在分析临床意义时，必须把二者结合起来。,镜检技术,将被检血液涂片，经瑞氏染色或姬姆萨染色，水洗，干燥后镜检。先用低倍镜全面观察血片上细胞分布情况及染色质量，然后选择染色良好，细胞分布均匀的部分，用油镜进行分类。由于比重大的细胞(粒细胞，单核细胞等)多分布在血片的边缘和尾部，比重小的细胞(如小淋巴细胞等)则多分布在血片的头部和中间。为减少这种细胞分布的固有误差并避免重复计数，血片必须按一定方向曲折移动而分类计数。,计数时，为避免重复和遗漏，可用四区、三区或中央曲折计数法推移血片，记录每一区的各种白细胞数。每张血片最少计数100个细胞(如果计数200-300个白细胞，当然其百分率更为准确)，连续观察23张血片，求出各种白细胞的百分比。记录时，可用白细胞分类计数器，也可事先设计一表格，用画“正”字的方法记录，以便于统计百分数。,各类白细胞的形态特征,在镜下辨认各种白细胞时，必须掌握其主要特征，如细胞大小，核的形状结构及染色性，胞浆颜色、有无颗粒及颗粒特点等。在同一张血片上对照比较，互相鉴别。1嗜中性白细胞。圆形，直径约1015m。胞浆淡红色，胞浆内有多量紫红色细小颗粒(染色不佳时则看不清楚)。核染成深紫色，其形状多样，核微呈肾形，染色稍淡的称幼年核，呈带形或S形，两边平行的称杆状核，分成23叶，在叶之间有细丝相连的 称分叶核。有时因核叶重叠看不到细丝，但核量较多，染色质致密，也可认为是分叶核。2嗜酸性白细胞。大小，形态与嗜中性白细胞大体相似，唯胞浆内含有粗大的鲜红色颗粒(马的这种嗜酸性颗粒明显大于其它家畜)。核多数为两叶。3嗜碱性白细胞。大小、形态与嗜中性白细胞相似，但胞浆内含有粗大的深蓝色颗粒，常遮盖在核上。核分叶不明显。4淋巴细胞。分大小两种，小淋巴细胞圆形，直径约710m，核染成深紫色，圆形或肾形。胞浆很少，常仅呈一小片月牙状，染成蓝色。大淋巴细胞直径约1019m，核圆形或肾形。胞浆相对较多，染成天蓝色，在胞浆与核之间有淡染带。有时内含少数紫红色大颗粒。5单核细胞。是外周血液中最大的细胞，直径约为1224m。核染成紫色，其染色质疏松，核形不规则，呈肾形，多角形，折叠状等。胞浆较多，染成浅灰蓝色，有时内含少量灰尘样淡红色小颗粒。,血液检验,临床意义,健康动物各类白细胞分类数值（%）,白细胞增多嗜中性白细胞增多：见于猪、牛巴氏杆菌病、马腺疫、肺炎及化脓性感染等。嗜酸性白细胞增多：见于某些蠕虫病、过敏性疾病及湿疹等。淋巴细胞增多：见于结核、鼻疽、布氏杆菌病、猪瘟及牛梨形虫病。单核细胞增多：见于败血性疾病，某些梨形虫病及李氏杆菌等。,白细胞减少嗜中性白细胞减少：见于病毒性传染病、药物中毒（如长期服用抗生素）、各种疾病的垂危期。嗜酸性白细胞减少：见于败血症、某些病毒病及牛梨形虫病等。淋巴细胞减少：多为嗜中性白细胞增多而造成的相对性变化。,血液检验,在分析嗜中性白细胞增、减变化时，还应注意嗜中性白细胞的成熟情况。若未成熟的嗜中性白细胞增多，即出现嗜中性髓样细胞、幼稚型和杆状核嗜中性白细胞的比例增多，则称为核左移。若血液内分叶核嗜中性白细胞大量增多，而且核的分叶数目也增多，则称为核右移。,白细胞总数增多的同时，出现核左移，表示骨髓造血机能加强，机体处于积极防御阶段；而白细胞总数减少时见有核左移，则表示骨髓造血机能减退，机体的抗病力降低。至于核右移，乃骨髓造血功能衰退的标志，多因机体高度衰竭而引起，常提示预后慎重。,临床意义,尿素能溶解红细胞及白细胞而保存完整形态的血小板，经稀释后再细胞计数室内直接计数，以求得1mm3血液内的血小板数。稀释液中的枸橼酸钠有抗凝作用，甲醛可以固定血小板的形态。,血小板计数(platelet count),用1ml吸管吸取稀释液0.38ml置一小试管中。用沙利氏管吸取被检血至20mm3处，擦去管外粘附的血液，吹入小试管中，吸吹数次，充分混允。静置20min以上，使红细胞溶解。充分混匀后再用毛细吸管或沙利氏吸血管吸取被稀释的血液，充入已盖好盖玻片的计数室内，静置10min，高倍镜观察。任选计数室内一个大方格，按计数法计数。血小板在高倍镜下，呈椭圆形、原形或不规则折光小体，注意切勿误将尘埃等异物计入。,1mm3血液中血小板数=x2010X：一个大方格内的白细胞总数。20：稀释倍数10：血盖片与计数板的实际高度是0.1mm，乘10后则为1mm。上式简化后为1mm3血液中血小板数=x200,计算,临床意义,光学显微镜的使用,1.物镜转换器 2.接物镜 3.游标卡尺 4.载物台 5.聚光器 6.彩虹光阑 7.光源 8.镜座 9.电源开关 10.光源滑动变阻器 11.粗调螺旋 12.微调螺旋 13.镜臂 14.镜筒 15.目镜 16.标本移动螺旋,操作步骤-1.观察前准备,显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。调节光照:不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。,2.低倍镜观察,镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。,3.高倍镜观察,在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，慢慢下降载物台直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察,并准备用油镜观察。,4油镜观察,用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。从目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。,5.观察完后复原,下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚乙醇混合液擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将载物台下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。,三、血液分析仪及其在兽医临床上的应用,血液分析仪是目前临床血液检验常用检测仪器。20世纪40年代后期，美国人库尔特（W.H.Coulter）发明电子血细胞计数仪并申请专利。其特点是检测速度快、精确度高、操作简便。目前，各类血液分析仪主要能完成两大功能：细胞计数功能。细胞分类功能。血液分析仪检测原理主要是电阻抗法。,电阻抗法血液分析仪器组成,信号发生器：通过小孔的各种血细胞都能产生电阻信号，信号电平的高低与细胞的大小成正比。放大器：血细胞通过小孔时产生的脉冲信号非常微弱，需通过电子放大器，将微伏级信号放大为伏级脉冲信号，才可触发电路。阈值调节：在计数不同细胞时，应调节阈值电平，以给出合适的阈值度，使计数结果尽量符合实际水平。甄别器：各种微粒(血细胞、细胞碎片、杂质等)通过小孔时均可产生相应脉冲信号；甄别器则根据阈值提供的参考电平，将低于参考电平的各种非计数目标的假信号去掉，以提高计数的准确性。整形器：经放大和甄别后的细胞脉冲信号，波形不一致，必须经过整形器调整为一致标准的平顶波形后，才可触发计数电路。计数系统：血细胞产生的脉冲信号，经过放大、甄别、整形后，送入计数系统；仪器对大小不同的脉冲进行选择，区分出不同类型的细胞并分别进行计数。,电阻抗法检测原理又称库尔特原理(Coulterprinciple),白细胞计数和分类计数原理,仪器将体积为35450fL的血细胞，分为256个通道（channel）。每个通道：1.64fl。根据细胞大小，分别置于不同的通道中，显示血细胞体积分布直方图(Histogram)。经溶血素处理脱水后，血细胞体积大小发生了变化！第一群（3590fl）小细胞区：淋巴细胞（体积最小）。第二群（90160fl）单个核细胞区，（中间细胞）：单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、原始、幼稚细胞、异常细胞等。第三群（160fl以上）大细胞区：嗜中性粒细胞（体积最大）。,正常白细胞分类模式图（直方图）,%,红细胞检测原理,红细胞计数和血细胞比容测定与白细胞计数相似,血小板检测原理,血小板计数（platelet,PLT）：随红细胞在一个系统中进行检测,直方图在228fl，主要在2 15fl（不同仪器不一）,四、血液生化检验,分光光度法原理,分光光度法，常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。,Lambert定律,一束平行单色光垂直照射于一均匀物质（溶液）时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。设：入射光强度为I0 L表示溶液的厚度（即光程）出射光（透过光）强度为I根据辐射能理论推导，I0与I之间关系为lg（I0/I）=K1L（1）K1是常数，受光线波长、溶液性质、溶液浓度的影响。,Beer定律,当一束单色光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若溶液的厚度不变，则溶液浓度C愈大，光吸收愈大，透射光线强度的减弱也愈显著，光强度减弱的量与溶液浓度增加量成正比 lg（I0/I）=K2C（2）K2为吸收系数，是常数，溶液对光吸收的大小与溶液浓度C成正比。,Lambert-Beer定律（又称吸收定律）,上二式合并（即（l）与（2）合并）lg（I0/I）=CL 令A=lg（I0/I），T=I/I0；则 A=CL，A=-lgT。T为透光率，A为吸光度（光密度、消光度）。其中为常数，又称消光系数（extinction coefficient），表示物质对光线吸收的能力，其值因物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波长的单色光则消光系数不变。,分光光度计的结构,光源：钨灯和氢灯（或氘灯）单色器：分解为单一波长光的装置 狭缝：调节入射单色光的强度，形成平行光 线 吸收池：又称比色杯、比色皿、比色池，装待测溶液用 检测系统：感受光能，转化为电能，输出A值、T值。,几类分光光度计,22PC型可见光分光光度计 UNICO2000型,S54型紫外分光光度计 UV8500型紫外分光光度计,比色杯（比色皿）,玻璃比色杯 石英比色杯 荧光比色杯,比色杯使用注意事项,1、拿取比色皿时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，避免接触光学面,光玻璃面对着光路。2、不得将光学面与硬物或脏物接触。盛装溶液时，液面高于光路,高度为比色皿的2/3处即可，光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用檫镜纸擦拭。3、测定时浓度由低到高，进行润洗。比色皿在使用后，应立即用水冲洗干净。必要时可用1：1的盐酸浸泡，然后用水冲洗干净。4、不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤；5、在测量时如对比色皿有怀疑，可自行检测。,微量移液器,吸嘴装在吸液杆上，应套牢避免间隙。依据所需容量旋转手轮，使数轮显示所需值。轻轻地将推动按钮下压，使推动按钮推移至第一停点位置。手持取液器垂直浸入溶液中，吸嘴浸入深度为2-4mm，停留2-3秒后缓慢放松按钮，即回到原来位置，溶液吸入后稍停即可将吸嘴移出液面。将取液器吸嘴置于排液容器内。使吸嘴尖紧贴容器内壁，按压推动按钮至第二停点位置，使溶液排尽，松开按钮。移液完毕，按压卸嘴按钮，将吸嘴脱卸。,分光光度计的使用,722型分光光度计,样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热20分钟 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 打开样品室盖，将参比溶液倒入比色皿中放入比色皿架靠近测定者一端位置，并将样品溶液倒入比色皿中放入比色皿架的其它位置，盖好样品室盖。拉动比色皿架拉杆一小格使比色皿架挡住光路，按“0%T”键调透射比零 推入比色皿架使参比溶液位于光路中，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A)打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调A零 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。,血液葡萄糖测定(费吴氏法)血液非蛋白氮测定血清总蛋白、白蛋白及球蛋白测定（双缩脲法）血清尿素测定（二乙酰-肟法）,(一)血液葡萄糖测定(费吴氏法),原理无蛋白血滤液中的葡萄糖，具有还原性，与碱性高铜混合加热后，将高铜还原成氧化低铜而呈红色沉淀，此沉淀物再被磷钼酸氧化成蓝色物质。与同样处理的标准葡萄糖管比色，而求得血糖含量。试剂 0.25苯甲酸溶液 葡萄糖贮存标准液(1ml含10mg葡萄糖)葡萄糖应用标准液(1ml0.1毫克葡萄糖)碱性铜溶液 磷钼酸试剂 10钨酸钠溶液 1/3molL硫酸溶液,操作方法,钨酸钠法制备无蛋白血滤液50ml：取小烧杯或大试管一支，先加入蒸馏水7ml，再加入新鲜抗凝血1ml，充分混匀，使之溶血。然后，加入10钨酸钠溶液1.0ml，混匀。最后，徐徐加入23N硫酸溶液1ml，随加随摇，充分混匀。放置510min后，用优质滤纸过滤或离心沉淀，即可获得无色清亮无蛋白血滤液以供备用。此法所得无蛋白血滤液近中性，不仅适用于葡萄糖的测定，还可用于非蛋白氮、尿素氮，肌酐等的测定。,取血糖测定管3支，分别标明测定管、标准管及空白管，按表操作。,全血血糖含量（mg/100ml）测定管光密度/标准管光密度0.2100/0.2,临床意义,(二)血液非蛋白氮测定,原理血中的非蛋白氮物质主要有尿素、尿酸、肌酸和肌醇等，均为蛋白质代谢中间产物或最终产物。由于这些化合物不被蛋白沉淀，故测定无蛋白血滤液的含氮量即为非蛋白氮含量。试剂 硫酸铵贮存标准液(1ml1mg氮)硫酸铵应用标准液(1ml0.03 mg氮)50%硫酸溶液 碘化汞钾试剂贮存液 碘化汞钾试剂应用液,操作方法 取草酸钾抗凝全血（不能用双草酸盐抗凝血），以钨酸钠法制备无蛋白血滤液后，按表操作。,全血非蛋白氮含量（mg/100ml）测定管光密度/标准管光密度0.03100/0.1,降低,增高,急、慢性肾炎 尿毒症 肾盂积水 泌尿系结核、结石阻塞 严重烧伤 大量呕吐 腹泻 肠梗阻 血红蛋白尿 甲状腺机能亢进末期肾上腺机能不全 重金属中毒等,中毒性肝炎胆道术后妊娠晚期,临床意义,(三)血清总蛋白、白蛋白及球蛋白测定,原理 蛋白质中的肽键，与碱性酒石酸钾/纳/铜作用，产生紫色反应，成为双缩脲反应。根据颜色的深浅，与经同样处理的蛋白标准溶液比色，即可求得血液蛋白质含量。试剂 27.8%硫酸钠-亚硫酸钠混合液 双缩脲试剂,原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围1-10mg。,双缩脲法测定蛋白质浓度,操作方法,1、制备标准血清及测定其总蛋白量 若无已备标准血清时，可收集多份健畜血清混合而成标准血清，并用微量定氮法测其总蛋白量。微量定氮法 取血清1ml置于50ml量瓶中，用生理盐水做50倍稀释，混匀，供测总蛋白。另用血清制备无蛋白血滤液（同全血制备无蛋白血滤液法），供测非蛋白氮。然后按后表操作：,血清氮含量（mg/100ml）总蛋白测定管光密度/标准管光密度0.031000/0.004血清非蛋白氮含量（mg/100ml）非蛋白测定管光密度/标准管光密度0.031000/0.1血清总蛋白质含量（g/100ml）（含氮量非蛋白氮）6.25/1000,2、制备标准血清应用液 未经稀释标准血清0.2ml，加27.8%硫酸钠-亚硫酸钠混合液3.8ml，混匀，备用。3、制备被检血清总蛋白混悬液和白蛋白澄清液 被检血清0.2ml置试管中加入27.8%硫酸钠-亚硫酸钠混合液3.8ml，混匀即得总蛋白混悬液。放置片刻，待气泡上升后，取此混悬液1ml，做总蛋白测定。想剩余部分内加入乙醚2.5ml，振摇混匀，2500rpm离心5min。后斜执试管，用1ml吸管小心吸取下层澄清的白蛋白液1ml，供测白蛋白用。,被检血清总蛋白含量（g/100ml）总蛋白测定管光密度/标准管光密度 标准血清总蛋白被检血清白蛋白含量（g/100ml）白蛋白测定管光密度/标准管光密度 标准血清总蛋白被检血清球蛋白含量（g/100ml）被检血清总蛋白量被检血清白蛋白量,总蛋白升高 重症脱水、水分摄入障碍的失水、糖尿病、酸中毒、休克总蛋白减低 长时间中毒蛋白尿的各种肾病、肝硬化腹水、营养不良、重度甲状腺功能亢进、中毒、大量出血、贫血白蛋白增高 严重腹泻、呕吐、饮水不足、烧伤造成脱水及大出血，致使血浆浓缩而白蛋白相对增高白蛋白减少 白蛋白丢失过多 肾病综合征、严重出血、大面积烧伤、胸腹腔积水 白蛋白合成功能不全 慢性肝脏疾病、恶性贫血和感染 蛋白质摄入量不足 营养不良、消化吸收功能不良、蛋白摄入不足 蛋白质消耗过大 甲状腺功能亢进、各种慢性消耗性疾病、感染、外伤球蛋白增高 肝硬化、丝虫病、肺炎、细菌性心内膜炎、结合活动期,临床意义,(四)血清尿素测定（二乙酰-肟法）,原理在酸性反应环境中加热，二乙酰-肟分解二乙酰和羟胺，二乙酰与样品中的尿素反应，缩合成红色的二嗪衍生物，成为Fearon反应。反应中加入硫胺脲和硫酸镉，可提高反应的灵敏度和显色的稳定性 试剂 酸性试剂 二乙酰-肟溶液 50%硫酸溶液 尿素标准贮存液 尿素标准应用液