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申请代码：C140303受理部门：收件口期:受理编号：国家自然科学基金申请书（2023版）资助类别：面上工程亚类说明：附注说明：工程名称：血红素加氧酶T介导Th17细胞在哮喘气道炎症中的免疫调节作用申请者：夏振炜：021-64333414依托单位：上海交通大学通讯地址：上海市卢湾区瑞金二路197号邮政编码：200025单位：021-34206809转82电子邮件:xzw63hotmaiI申报日期：2008年1月25日国家自然科学基金委员会根本信息申请者信息t名夏振炜性别里出生力年月1963年7月民族汉族学位博士职称研究员主要研究领域气道炎症免疫调节021-64333414电子邮件xzw639hotmai1个人网页工作单位上海交通大学/医学院附属瑞金医院在研工程批准号30570798名称上海交通大学代码20003001联系人张艳电子邮件jhk-jyb0sjtu.cdu021-34206809转82网站地址sjtu.edu单位名称代码OregonHealthandScienceUniversity00000000在此录入修改项目基本信工程名称血红素加氧胸T介导Th17细胞在哮喘气道炎症中的免疫调节作用资助类别面上工程亚类说明附注说明申请代码C140303:炎症C1705:儿科学基地类别息预计研究年限2023年1月一2023年12月研究属性应用根底研究申请经费34.0000万元摘要（限400字）：目前认为支气管哮喘是以Th2分泌的细胞因子所致炎性细胞浸润为主的慢性气道炎症。近年研究发现，-类新的Th细胞亚群-ThI7,具有调控ThI和Th2的作用。Thl7主要分泌LT7,迄今发现有6种亚型（IL-17A-F）。在哮喘气道炎症中，IL77A/F可促发中性粒细胞性炎症，而ILT7E能促进Th2反响，诱导并激发嗜酸性粒细胞性慢性炎症，但具体机制尚未说明。血红素加氧酶T（HO-I）是血红素代谢的限速酶，作为保护蛋白，具有抗乳化应激和抗炎作用。课题组最近研究说明HOT高表达后可明显减轻气道炎症和气道高反响性；预实验显示：经血红素诱导Ho-I表达可影响ILT7分泌。因此本课题设想通过Thl7培养和构建小鼠哮喘模型,分析血红素干预前后Thl7及其分泌的细胞因子ILT7变化，探讨Ho-1、Thl7和哮喘三者关系，说明HO-I抗炎作用机制并提供临床防治新思路。.关键词（用分号分开，最多5个）血红素加氧酶T：Thl7s白介素-17：哮喘；炎症工程组主要成员（注：工程组主要成员不包括工程申请者，国家杰出青年科学基金类工程不填写此栏。）编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电子邮件工程分工每年工作时间月）1张自力1964-02-01男副教授博士OregonHealthandScienceUniversity(53)494-8188zhangziuhsu.edu课题设计实验指导42钟文伟1974-12-08男主治医师硕士上海交通大学021-64370045zhww1208163细胞培养细胞因子测定43苏雯1983-03-12女博士生学土上海交通大学021-6437004neptune312163动物造模细胞因子测定84王慧英1982-09-15女硕士生学士上海交通大学021-64370045huiying8l1012163细胞鉴定与功能检测85须丽清1977-06-01男博士生硕士上海交通大学021-64370045aadoctor4172126细胞培养因子汕定66李春娥1978-09-09女主治医师硕士上海交通大学021-64370045Iichee78tom实验指导47崔贻芬1957-05-29女技师其他上海交通大学021-64370045cuiyifcn163细胞培养68在此录入修改9在此录入修改总人数高级申鼓初级博士后博士生硕士生8221021说明：高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含中请者），总人数自动生成。经费申请表(金额单位：万元)科目申请经费备注(计算依据与说明)一研究经费25.90001.科研业务费7.9000(D测试/计算/分析费3.0000Westernblot、ELISA,Real-TimePCR等测试(2)能源/动力费L7000水、电、煤费用，按5%计(3)会议费/差旅费2.0000参加国际、国内会议(4)出版物/文献/信息传播费1.2000文献检索、论著发表费(5)其它2.实验材料费18.0000(1)原材料/试剂/药品购置费18.0000质粒构建，T细胞别离纯化柱、别离Kit、试剂盒、Balb/C和DoILIo小鼠(2)其它3.仪器设备费0.0000(1)购置(2)试制4.实验室改装费5.协作费-.国际合作与交流费3.00001工程组成员出国合作交流2.境外专家来华合作交流3.0000邀请协作者来华交流路费和住宿费三劳务费3.4000研究生劳务费四管理费1.7000组织实施费，按5%计合计34.0000与本工程相关的其他经费来源国家其他方案资助经费其他经费资助(含部门匹配)5.0000其他经费来源合计5.0000查看报告正文撰写提纲报告正文一立项依据与研究内容：1.工程的立项依据支气管哮喘是最常见的呼吸道慢性炎症性疾病之一，随着生活水平不断提高及生活方式西方化，该病呈不断上升趋势，成为危害人类身体健康的主要疾病之一，给社会带来巨大的经济负担。支气管哮喘因长期、反复慢性炎症可导致气道重塑，严重影响肺功能，因此说明其发病机制井早期、有效的控制哮喘气道炎症是临床与科研丞待解决的问题。支气管哮喘发病机制十分复杂，涉及肺组织中抗原递呈细胞、树突状细胞、T辅助细胞(Thelpcells,Th)和调节性T淋巴细胞(regulatoryTcells,Treg)及其相互作用。目前认为过敏原促进初始ThO细胞向抗原特异性Th2细胞定向分化，建立以Th2细胞占优势的T细胞免疫应答反响，导致ThIZTh2比例失衡。Th2分泌细胞因子如白介素CinterleukinJD-4、-5和-13等，一方面进一步促进ThO细胞向Th2细胞分化，另一方面作用于B淋巴细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞(eosinophil,EOS),诱发以EoS浸润为主的慢性气道炎症和气道高反响性(哮喘的两个重要特征)。在慢性气道炎症的根底上，又因过敏原暴露及感染等诱因导致中性粒细胞和单核细胞在肺部大量募集，产生大量氧自由基，引起哮喘急性加重M3。而哮喘的反复急性发作和气道慢性炎症持续状态那么导致气道结构破坏与修复交替反复，引起平滑肌增生，最终导致气道重塑。但研究发现，一类新的Th细胞亚群一ThI7细胞，在哮喘气道炎症的发生开展中起重要作用。Thl7细胞是新近提出的一类独立的Th细胞亚群，不同于Thl(分泌IFN-Y和TNF-)和Th2(分泌IL-4、IL-5和IL-13)细胞，因分泌IL-17而命名，又称为产生1L.17的效应性T淋巴细胞(IL-ITproducingefTectorTceIls)该类细胞分泌的细胞因子能够趋化中性粒细胞、单核细胞等，促进炎症的发生，在自身免疫性疾病中起着主导作用，故成为目前研究的热点伊旬。关于Thl7细胞的起源、分化尚未明确，目前认为Th17起源于初始Tho细胞，在TGF-13、IL-6的协同作用下分化为Thl7细胞17倒，其中IL-23对维持并扩增该细胞亚群具有重要作用，而IL-4和IFN-Y协同作用可抑制Thl7分化(图1),新近研究说明1L-27亦可抑制ThI7分化口叫图IThl7细胞分化示意图Thl7细胞以CD4+T细胞为主，又称为细胞毒性T细胞抗原8(CTLA-8)U",主要通过分泌1L-7发挥作用，其中人1L-17为同源二聚体蛋白，其氨基酸序列与松鼠猴疱疹病毒的开放阅读框(HSVS13)有58%的同源性。迄今IL-17家族已发现6种亚型(IL-17A-F),分泌的IL-17由2个32kDa同源二聚体构成。Thl7细胞分泌的IL-17主要为1L/7A和IL17F(1L-17A/F).体内1L17通过与细胞膜上IL-17受体(IL-17R)结合而发挥作用。IL-17R是一种I型跨膜蛋白，含864个氨基酸，在气道上皮细胞、人表皮成纤维细胞、人胚肾细胞、B细胞、髓单核细胞、CD56+外周血NK细胞、外周血单个核细胞上均有表达，而1L-17A/F主要与IL-17RA受体结合，可激活3条经典MAP激酶信号传导途径，包括ERK1、ERK2、JNK和P38,引起IL-6和IL-8的分泌，从而导致中性粒细胞在局部的募集，包括浸润气道引发哮喘。IL-17还可触发NF-KB,导致T细胞增殖，并上调众多炎症介质基因如NoS和IL-IB等的表达，亦可促进粒细胞生成因子分泌，导致骨髓、脾脏中粒细胞数量增加4】2-"1。因而在众多炎症如哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎及实验性自身免疫性脑炎等，IL-17表达显著升高B)进一步研究发现，先前认为由Thl细胞造成的免疫性疾病实际由IL-17所致，而且IL17在过敏性疾病中的作用亦逐渐被认识。因此，IL-17在哮喘中的作用愈来愈受到重视。一方面，IL-17可协同趋化中性粒细胞和单核细胞募集的细胞因子IL-8、GRoa、GCP-2和刺激骨髓粒细胞增生的细胞因子IL-6、GSF、GM-CSF和诱导单核细胞的IL-IP和TNF-a等作用，促进中性粒细胞、单核细胞生成并在肺部募集，增强其功能和生存时间，引起肺部炎症(图2)。研究发现在图2Th17细胞在气道炎症中的作用哮喘急性发作和哮喘职业病，中性粒细胞起了重要作用。因而认为IL-17A/F参与了以中性粒细胞浸润为主的哮喘发生21。在过敏性哮喘动物模型中，NarUhilO等采用分子克隆技术，体外构建小鼠PCDNAmlL-17F质粒，并将其导入OVA致敏小鼠肺组织中，结果发现在OVA激发后支气管肺泡灌洗液(bronchialalveolarlavagefluid,BALF)内中性粒细胞和单核细胞显著增加，小鼠对乙酰胆碱的气道反响性明显增高，粘蛋白基因表达增强；Peter等网对OVA致敏小鼠经IL-17抗体干预后发现BALF内中性粒细胞显著减少，提示IL-I7A/F参与了由过敏原诱导的气道高反响性。但IL-17A/F对引起气道慢性炎症的主要炎症细胞一EOS那么具有相反的作用。研究发现，通过质粒转染诱导/L-/7基因在局部高表达或局部给予重组IL-17蛋白后，随着中性粒细胞的增加，EoS并未增加甚至减少，而给予1L-17单克隆抗体后随着局部中性粒细胞的减少，BALF及骨髓中EoS却显著增加，血清及BALF中IL-5显著升高回。最新研究报道：IL-17E能促进Th2反响，诱导并激发EOS性慢性炎症，因此IL-17E与以EoS浸润为主的气道炎症和气道高反响性密切相关,但Th17是否分泌IL-17E有待进一步明确。在过敏性哮喘患者和动物模型的血、痰液和BALF中，IL-17mRNA与蛋白含量均显著升高。SilVia等M采用-/?基因剔除小鼠建立哮喘模型，发现IL-17R缺陷小鼠气道炎症明显减轻，BALF中EOS减少，血清抗原特异性IgE水平降低，体外肠系膜淋巴细胞培养并经特异性抗原刺激后IL-5产生减少，提示IL-17又与哮喘严重程度呈正相关""血红素加氧酶(hemeoxygenase,HO)是哺乳动物和人体内血红素代谢途径中的限速酶，将血红素四毗咯环上的甲基桥裂解，最终形成等量的胆绿素及CO并释放铁原子。随之，胆绿素经胆绿素复原酶作用形成胆红素。目前发现HO有三种同工酶，为不同基因产物：即诱导型HeM,组成型HO-2及新近发现的异构体HO-3。三种同工酶的氨基酸序列和诱导性各异，但具有共同的催化底物反响机制和反响产物。HO-I分子量为33kDa,由288个氨基酸构成，为热休克蛋白32(HSP32)。血红素，金属元素，氧化应激，紫外照射，化合物，高温，某类药物，复原型谷胱甘肽等均能诱导HO-I,分布在肝脏、脾脏、肺脏等组织。HO-2由361个氨基酸构成，分子量为36kDa,Ho-2不受外因诱导，在脑和睾丸中浓度最高。Ho-3是一个约2.4kb的单一转录产物，分子量约33kDa,分布在脾脏、肝脏、胸腺、前列腺、心脏、肾脏、大脑和睾丸组织中。HO-3类似于HO-2,但催化活性极低。与Ho-1、Ho-2相比，HO-3代谢血红素的能力较弱，推测可能对血红素依赖性的反响过程有调节作用。至今HO-3生理功能尚未明确,相关的研究报道亦甚少。大量根底和临床实验证明HO.1作为保护蛋白，表达后具有抗氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡和抗平滑肌增生等重要功能上。-2叫，在许多疾病如支气管哮喘122E等中发挥其保护作用，其在多种疾病中的潜在治疗意义也越来越受到重视因。新近研究发现Ho-I抗哮喘气道炎症作用主要表现为：减少炎症细胞在局部的浸润。研究说明，上调Ho-I表达可以抑制单核细胞浸润。抑制促炎因子如TNF-a、IL-10、MlP-10、GM-CSF的产生BN叫此类因子相互作用，募集众多炎性细胞，进而又促使各种炎性介质、细胞因子释放，使气道炎症加剧，触发并放大炎症效应；而Ho-I通过抑制前炎症因子释放从而阻断这一重要环节，起到抗炎作用。促进抗炎细胞因子IL-IO的释放，抑制Th2细胞因子的分泌和IgE的产生，促进EOS凋亡和减轻抗体介导的EoS炎症2叫稳定肥大细胞，抑制肥大细胞脱颗粒及白细胞粘附于血管内皮上。抑制粘附分子在血管内皮细胞上的表达。AImolki发现在卵清蛋白(OValbUmin,OVA)诱导的豚鼠哮喘模型经血红素(hemin)上调"CM基因表达那么明显减轻气道炎症反响；反之，用HO-I抑制剂锡-原口卜琳(Sn-PrOtoPOrPhyrin,SnPP)后那么逆转该反响内。另有报道显示HC)-I和Ce)能抑制平滑肌增生，阻止气道重塑。但Ho-I通过何种细胞发挥免疫调节作用至今未见确切的报道。课题组近期的研究结果显示:在OVA致敏、激发的哮喘小鼠,经Hemin上调HO-I表达后，肺脏和脾脏中foxp3表达及蛋白量增加，血清IL-Io增高，而OVA特异性IgE水平降低，肺脏病理组织学检测、BALF中细胞总数和EoS计数均显示炎性细胞尤其是EOS浸润减少；CD4+CD25+Treg功能抑制试验发现，OVA致敏、激发Balb/C小鼠经Hemin干预后，抑制作用显著增加；SnPP能逆转HO-I作用。IL-IO剔除的B6.129P2-10""Cg"/j小鼠Treg抑制作用经Hemin干预后仍未改善。研究说明：HO-I可能经诱导CD4+CD25+Treg特异性转录因子foxp3表达，激活CD4+CD25+Treg,促进IL-IO分泌，以拮抗哮喘气道炎症3.24；预初实验同时显示：体内经Hemin诱导HO-I高表达后能明显降低由抗CD3/CD28抗体刺激后脾细胞分泌IL-17,而单独或加用SnPP后IL-17分泌增加，提示Ho-I在体内具有先前未知的抑制IL-17的免疫调节作用(图3),但具体机制尚需进一步探讨。此外我们已建立了小鼠哮喘动物模型，免疫斑联(ELISPOt)方法测定IL-17表达，掌握了应用OVA多抗原肽(Hiultipleantigenicpeptide,MAP)免疫小鼠来获得大量OVA特异性Thl7细胞，并通过尾静脉注射进行细胞移植，结果详见工作根底。为本工程的开展奠定了根底。图3Hemin抑制体内抗原非特异性IL-17分泌鉴于Ho-I和Thl7细胞在支气管哮喘中的作用，结合我们前期工作根底，我们认为HO1可能介导了Thl7细胞分泌不同IL-17亚型，并在哮喘发生、开展中发挥作用。本工程拟在HeM表达干预前后，通过体外别离、培养OVA抗原特异性Th17细胞，观察HO-I对Thl7细胞和IL-17等细胞因子的影响；并建立OVA致敏、激发的Babl/C小鼠哮喘模型，采用细胞荧光标记技术标记Thl7细胞，Thl7细胞回输OVA致敏后的Babl/C小鼠，通过免疫荧光、流式细胞分析技术研究ThI7细胞在哮喘动物模型中的作用，探讨HO-1、Thl7细胞和哮喘气道炎症三者关系，说明HO-I抗炎作用机制并提供临床防治新思路(图4)。图4HO-I与Thl7细胞作用示意图参考文献IRiChardM,Effrosa,HariNagarajb.Asthma:newdevelopmentsconcerningimmunemechanisms,diagnosisandtreatment.CurrentOpinioninPulmonaryMedicine2007,13:37-432JohanssonSGO,HourihaneJ0,B,BousquetJ,etal.Arevisednomenclatureforallergy.AnEAACIpositionstatementfromtheEAACInomenclaturetaskforce.Allergy2(X)1,56:813-8243LindA,AdachiM.NeutrophilicairwayinflammationandIL-17.Allergy2002,57:769-7754WeaverCT,HattonRD,ManganPR,etal.IL-17FamilyCytokinesandtheExpandingDiversityofEffectorTCellLineages.AnnuRevImmunol2007,25:821-525HarringtonLE,HattonRD,ManganPR,etal.Interleukin17-producingCD4÷effectorTcellsdevelopviaalineagedistinctfromtheThelpertypeIand2lineages.NatImmunol2(X)5,6:1123-326ParkH,LiZ,YangXO,etal.AdistinctlineageofCD4Tcellsregulatestissueinflammationbyproducinginterleukin17.NatImmunol2005,6:1133-417VeldhoenM,HockingRJ,AtkinsCJ,etal.TGF-inthecontextofaninflammatorycytokinemilieusupportsdenovodifferentiationofIL-17-producingTcells.Immunity2006,24:179-898ManganPR,HarringtonLE,O,QuinnDB,etal.Transforminggrowthfactor-inducesdevelopmentoftheTH17lineage.Nature2006,441:231-349BettelliE,CarrierY,GaoW,etal.ReciprcaldevelopmentalpathwaysforthegenerationofpathogeniceffectorTH17andregulatoryTcells.Nature2006,441:235-3810KasteleinRO,HunterCA,CuaDJ.DiscoveryandbiologyofIL-23andIL-27:relatedbutfunctionallydistinctregulatorsofinflammation.AnnuRevImmunol2007,25:221-4211RouvierE,LucianiMF,MatteiMG,etal.CTLA-8,clonedfromanactivatedTcell,bearingAU-richmessengerRNAinstabilitysequences,andhomologoustoaherpesvirussaimirigene.JImmunol1993,150:544512JSarahLG,JillMK,JeffreyJY,etal.TheIL-17CytokineFamily.VitaminsandHormones2006,74:255-28213LaanM,LotvallJ,ChungKF,etal.IL-17-inducedcytokinereleaseinhumanbronchialepithelialcellsinvitro:roleofmitogen-activatedprotein(MAP)kinases.BrJPharmacol2001,133:200114KaikoGE,HorvatJC,BeagleyKW,etal.Immunologicaldecision-making:howdoestheimmunesystemdecidetomountahelperT-cellresponse?Immunology2007,123:26-33815AfzaliB,LombardiG,LechlerRI,etal.TheroleofThelper17(Th17)andregulatoryTcells(Treg)inhumanorgantransplantationandautoimmunedisease.ClinicalandExperimentalImmunology2007,148:32-4616JNaruhitoOda,PaolaBC,DavidME,etal.Interleukin-17FInducesPulmonaryNeutrophiliaandAmplifiesAntigen-inducedAllergicResponse.AmJRespirCritCareMed2005,171:12-1817PeterWH,KasranA,LiuZJ,etal.Interleukin-17OrchestratestheGranulocyteInfluxintoAirwaysafterAllergenInhalationinaMouseModelofAllergicAsthma.AmJRespirCellMolBiol2003,28:42-5018SilviaSC,TogbeD,CouillinI,etal.Interleukin-17isanegativeregulatorofestablishedallergicasthma.TheJournalofExperimentalMedicine2006,203(12):2715-272519WongCK,HoCY,KoFW,etal.Proinflammatorycytokines(IL-17,IL-6,IL-18andIL-12)andThcytokines(IFN-g,IL-4,IL-IOandIL-13)inpatientswithallergicasthma.ClinExpImmunol2001,125:177-18320RyterSW,ChoiAM.Hemeoxygenase-1:redoxregulationofastressproteininlungandcellculturemodels.AntioxidRedoxSignal2005,7:80-9121SongR,MahidharaRS,LiuF,etal.CarbonMonoxideInhibitsHumanAirwaySmoothMuscleCellProliferationviaMitogen-ActivatedProteinKinasePathway.AmJRespirCellMolBiol2002,27:603-61022AlmolkiA,TailleC,MartinGF,etal.Hemeoxygenaseattenuatesallergen-inducedairwayinflammationandhyperreactivityinguineapigs.AmJPhysiolLungCellMolPhysiol2004,287:L26-3423XiaZW,ZhongWW,XuLQ,etal.Hemeoxygenase-1-mediatedCD4+CD25highregulatoryTcellssuppressallergicairwayinfl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