线粒体复合体Ⅰ试剂盒说明书.docx

线粒体复合体I试剂盒说明书微法100*96祥注意，正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义，复合体1(EC1.6.5.3)又称NADH-CoQ还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该旅催化一对电子从NADH传递给CoQ,同时可使Oz还原生成0匕是呼吸电子传递链上产生O2的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递桂(ETC)状态，而且可以反映活性氧(ROS)生成状态。刑定原理t复合体I能够催化NADH脱氢生成NAD-,在340nm卜.测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小Il需自备的仪器和用品I紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸t水。试剂的组成和配制，试剂一：液体100mLXI瓶，-2(TC保存：试剂二：液体20mLxl瓶，-20C保存：试剂三：液体5mL*l瓶一2MC保存I试剂四：液体25mLxl瓶，-20C保存；试剂五：液体ImLXl支，-2(TC保存；试剂六：粉剂Xl支，-2(TC保存，用时加入2mL蒸慎!水；用不完的试剂分装后.20寸保存，禁止反复冻融。工作液的配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解;用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融。样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入ImL试剂一和IOUL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。将匀浆600g,4寸离心5min。弃沉淀，将上清液移至另一寓心管中，IlOOOg,4"C离心IOmin。上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体I(此步可选做)。步骤中的沉淀即为线粒体，加入200UL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒，重复30次)，用于复合体I酶活性测定.湖定步事：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm,蒸情水调零。2、样本测定<1)工作液于37P(哺乳动物)或251C(其它物种)孵育5min。(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入IoUL样本、200IlL工作液和15IIL试剂六，混匀，记录34Onm处初始吸光值Al和2min后的吸光值A2,计算AA=Al-A2。重合体I活力单位的计)t1.使用雄石英比色皿测定的计算公式如下：(1)按蛋白浓度计尊单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。复合体I活力(nmol/minmgprot)=AV反总÷<d)×109÷(V×Cpr)÷T=1808xA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。<2)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。复合体1活力(nmoVmin/g鲜垂)=AA><V反总+(×d)xl(÷(WxV样÷V样总)+T=365><A÷W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。复合体I活力(nmolminK)"cen)=AV反总÷(×d)xl09÷(500xV样÷V样总)=O.73*AV反总：反应体系总体积，2.25x10*L；:NADH摩尔消光系数，6.22×ia,L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL：V样总：加入提取液体积，0.202mL：T：反应时间，2min：W：样本质量，g：500：细胞或细菌总数，500万。b.使用96孔板溺定的计算公式如下：(1)按蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。复合体1活力(nmol/min/mgprot)=AA*V反总+(e×d)×109÷(Vt×Cpr)÷T=3616xA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。(2)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。复合体I活力(nmol/min/g鲜重)=AA*V反总+(×d)xl()9÷<WxV样+V样总)+T=730A+W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。复合体I活力<nmolmin104cell)=AAV反总÷(×d)×109÷(500×V样+V样总)÷T=I.46><AAV反总：反应体系总体积，2.25x10-,L；:NADH摩尔消光系数，6.22×10jL/mol/cm:d：96孔板光径,0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，2min；W：样本质量，g;500：细胞或细菌总数，500万。