线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书.docx

线粒体复合体II试剂盒说明书微法lo0*/96样注*:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义，线粒体复合体II又称琥珀酸-辅酶Q还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸朝化生成延胡索酸，同时辅基FAD还原为FADHa后者进一步还原氧化型辅旅Q生成还原型辅酶Q,是呼吸电子传递桂的支路。刑定原理：复合体Il的催化产物还原型辅SSQ可进一步还原2,6二氯呷|跺酚，2.6-二氯呀噪酚在605nm有特征吸收峰，通过检测2.6-二氯呻味酚的减少速率来计尊该酶活性.需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸憎水。试剂组成和配制：试剂一：液体100mLxl瓶，-2（TC保存：试剂二.：液体20mLkl瓶,-201C保存；试剂三：液体.5mLkl支，-20IC保存；试剂四:液体25mLxl瓶，4t保存；试剂五:粉剂I支，-2（C保存；试剂六：液体25mLxl瓶，4寸保存;样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入ImL试剂一和IoUL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。2、将匀浆600g,4寸离心5min。3、弃沉淀，将上清液移至另一寓心管中，IlOOOg,4X：离心IOmin（I4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体II（此步可选做）。5、步骤中的沉淀即为线粒体，加入200UL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒，重复30次），用于复合体II酶活性测定.湖定步事：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至6O5nm,蒸情水调零。2、样本测定<1）工作液的配制：临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于37P（哺乳动物）或25P（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-2（TC保存，禁止反复冻融。（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入K）UL样本、251IL试剂六和200UL工作液，立即混匀，记录6O5m处初始吸光值Al和2min后的吸光值A2,计算AA=Al-A2.重合体II活力单位的计算：a.使用雄石英比色Hl测定的计算公式如下：(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol26二氯¢引咪酚定义为一个Sl活力单位。复合体11活力(nmol/minmgprot)=(AV反总+<d)×109÷(Vt×Cpr)÷T=559×A÷Cpr此法需要自行测定样本蛋Fl质浓度。(2)按样本鲜而.计算单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmo)2.6-二氯弓1喙酚定义为一个酶活力单位。复合体11活力(nmol/min/g鲜sft)=AA*V反总÷SXd)xKT÷(WxV样÷V样总)+T=113*A÷W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol2.6-二氯呼I咪酚定义为一个酶活力单位。复合体11活力(nmolmin104ceD=A×V反总+(×d)×109÷(500×V样÷V样总)+T=0.226*AAV反总：反应体系总体积，2.35xlO4L:2.6-二氯31噪酚摩尔消光系数，2.1×104Lmol/cm:d：比色皿光径，1cm：V样：加入样本体积，OOlmL:V样总：加入提取液体积，0.202mL:T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mgmLiW：样本质量，g:500：细胞或细菌总数，500万。b.使用96孔板海定的计算公式如下：(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol2,6二氯丐I咪酚定义为一个酶活力单位复合体II活力(nmol/min/mgprot)=AAV反总+(cxd)×10,÷(Cpr×V样)+T=Il18*AA-CPr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。<2)按样本鲜市计算单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol2,6-二氯解味酚定义为一个酶活力单位。复合体11活力(nmol/min/g鲜垂网AAXV反总+(×d)×109÷(W×VW÷V.½)÷T=226×A÷W<3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol2,6-二氯阿咪酚定义为一个酶活力单位。复合体H活力(nmolmin104CellHAAXV反总+(×d)×109÷(500×V样+V样总)=O.452MAV反总：反应体系总体积，2,35×1(HL:2,6-二氯喷噪酚摩尔消光系数，ZlxlO4L/molcmsd：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mb；V样总：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。