超氧阴离子Oxygenfreeradical,OFR试剂盒说明书.docx

超氧阴离子(OXygenfreeradical,C)FR)试剂盒说明书微法1T6S注意t正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定.刑定意义，生物体内超氧阴离广等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分r产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。测定原理：超氧阴离广与盐酸羟胺反应生成NoZ,NO?在对氨基苯磺酸和a-蔡胺的作用下，生成红色的偶氮化合物,在53Onm处有特征吸收峰，根据A值可以计克样品中0？含量，反应式为NH2OH+202+H÷NO2+H2O2+H2Oo自备实验用品及仪器，天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿用6孔板*氯仿和蒸谣水.试剂组成和配制：提取液：液体IlOmLXl瓶，4。保存。试剂一：液体20mLxl瓶，4e保存。试剂二：液体15mLxl瓶，4寸避光保存。试剂三：液体15mLxl瓶，4避光保存.试剂四：执仿，自备.超星阴离子提取：1.植物、动物组织：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1：510的比例(建议称取约0.1g组织，加入Imi.提取液)进行冰浴匀浆，然后，100OOg,40,离心20min,取上清置于冰上待测。2.细菌、真菌：按照细胞数量(IO4个)：提取液体积(rL)为5001000:1的比例(建议500万细胞加入ImL提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min):然后100OOg,4C,离心20min,取上清置于冰上待测.3.血清或培养液：直接测定。JM定操作表I分光光度计/酶标仪预热30min.调节波长至53Onm。1、操作表空白管测定管样本BL)200提取液(L)200试剂(L)160160混匀，37P水浴20min试剂二(L)120120试剂三(L)120120混匀，371C水浴20min试剂四<L)200200混匀，8000g,25e，离心5min,小心吸取上层水相200ULr微量石英比色皿内6孔板中，测定A530。AA=A测定A空白，空白管只要做一管。超氨阴寓子含计算公式a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线:y=0.0242x-0.0027.R2=0.99801.组织：(1)按照样本质量计算超氧阴离广含量(nmol/g鲜重)=(A+0.0027)÷0.0242V反总XV样W样总XW)X2=148.76×(A+0.27)÷W超氧阴离广产生速率(nmolgmin)=148.76×(A+0.0027)÷W÷T=7.44×(A+0.0027)÷W<2)按照蛋白质浓度计算超氧阴离广含量(nmol/mgprot)二(A+0.0027)+0.0242V反总+(V样XCPr)X2=14876(AA+0.0027)÷Cpr超氧阴离广产生速率(nmol/mgprotmin)=148.76×(A+0.0027)÷Cpr÷T=7.44×(A+0.0027)÷Cpr2.细菌，真菌：超氧阴离广含量(nmol104cell)=(A+0.0027)+0.0242V反总÷(V样+V祥总X细胞数量)x2=148.76x(A+0.0027)÷细胞数量超氧阴离广产生速率(nmol/lO,ceHmin)=148.76(A+0.0027)÷细胞数量÷T=7.44×(A+0.0027)÷细胞数量3.血清或培养液超氧阴离子含量(nmol/mL)=(A+00027)X).0242xV反总÷V样2=148.76×(A+0.27)超氧阴离子产生速率(nmolmLmin>=148.76x(A÷0.0027)÷T=7.44×(A+0.0027)V样总：加入提取液体积，1mL；V反总：反应总体积，0.36mL；V样：反应中样品体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g：T：反应时间，20min；2:2分子02参与反应生成1分子NO2b用96孔板测定的计算公式如下标准曲线：y=0.0121x-0.0027.R2=0.99801.组织：<1)按照样本质量计算超氧阴离子含量(nmol/g鲜重)=(AA+0.0027)÷0.0121xV反总÷(V样÷V样总XW)X2=297.52×(A+O.OO27)÷W超氧阴离子产生速率(nmol/gmin)=297.52×(A+0.0027)÷W÷T=14.88(A+0.0027)÷W<2)按照蛋白质浓度计算超氧阴离广含量(nmol/mgprot=(A+0.0027)÷00121V反总÷(V样XCPr)X2=297.52×(A+O.OO27)÷Cpr超氧阴离子产生速率(nmolmgprotmin)=297.52×(A+O.27)÷Cpr÷T=14.88(A+0.0027)÷Cpr2.细菌，真菌：超氧阴离子含量(nmol104cell)=(AA+0.0027)+0.012IXV反总+(V样+V样总X细胞数量)x2=297.52×(AA+O.O027)+细胞数量超l阴离子产生速率(nmol/lO"ceMmin)=297.52*(AA+O.OO27)+细胞数量+T=14.88×(A+0Q027)+细胞数量3.血清或培养液超虱阴离子含量(nmol/mL)=(AA+0.0027)+0.0121“V反总+V样*2=297.52x(AA+0.0027)超l阴离子产生速率(nmol/mL-min)=297.52×(A+O0027)÷T=14.88x(A+0.27)V样总：加入提取液体积，1mL：V反总：反应总体积，0.36mL:V样:反应中样品体积，0.2mL：Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL:W：样品殖量，g：T：反应时间，20min:2：2分子Oz-参与反应生成1分子NO2>注意事项：1、OD值大于1,样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。2、样品制备好后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。3,试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。