高效液相色谱检测血液CD38酶活性方法的建立.docx

高效液相色谱检测血液CD38酶活性方法的建立摘要目的建立高效液相色谱(HPLC)测定血液烟酰胺腺喋吟二核昔酸(NAD)主要消耗酶CD38酶活性的方法，检测CD38酶活性在不同年龄和健康状态人群中的差异。方法选择50PI全血作为检测样本、1501浓度为500mol/L的B-NAD为酶反应底物，全血预孵育消耗掉内源性B-NAD后，加入底物，在37OC温育40min,高氯酸(PCA)终止反应，HPLC测定酶促反应前后产物烟酰胺(NAM)变化量并计算CD38酶活性。评价方法的线性、检测限、定量限、精密度、回收率和稳定性等。用所建方法检测60名健康体检者和30名结直肠癌患者血液CD38活性。结果37预孵育20min可消除内源性B-NAD的影响。NAM在浓度为0.3.2mol/L的范围内线性良好，r=0.999,检测限为0.5nmolL,定量限为2.1nmol/Lo平均批内精密度(CV)和总CV分别为3.22%4.03%、2.91%4.70%。加样回收率在94.82%96.81%。全血在4放置48h、室温放置8h、冻存全血融化后室温放置2h以及反复冻融3次均不影响CD38酶活性。NAM、B-NAD标准品和前处理后的样本在4七放置48h、室温放置8h均可保持稳定。CD38活性随加入的CD38抑制剂4-氨基喳琳衍生物78c的浓度升高而逐渐降低。60例健康体检者结果显示，老年组CD38酶活性高于青年组(t=-2.776,P=O.007),30例结直肠癌患者CD38酶活性高于健康体检者(t=-2.572,P=O.012)。结论本研究建立的HPLC测定CD38酶活性的方法简单高效、准确性高、重复性好，为衰老及衰老相关疾病的研究提供了技术手段。CD38(EC：3.2.2.6)是具有单个跨膜结构的糖蛋白，在红细胞、免疫细胞、内皮细胞中普遍存在1,2,3,4,主要位于细胞膜上，但最新研究证实CD38也分布在细胞核和线粒体膜上，并且可能存在可溶性形式5,6,7oCD38是广泛分布于多种组织中的一种多功能酶，主要功能是消耗体内烟酰胺腺喋吟二核昔酸(nicotinamideadeninedinucleotide,NAD),在NAD分解代谢及维持体内NAD稳态中发挥重要作用。NAD是氧化还原反应的重要辅酶和能量代谢的中心，其水平变化与衰老及衰老相关疾病，如肿瘤、代谢性疾病、神经退行性病变等的发生发展密切相关8,9,10o研究报道，CD38在决定细胞内NAD水平方面起着至关重要的作用,CD38-/-小鼠的NAD水平比野生型高1020倍11。CD38酶活性在衰老和肿瘤等衰老相关疾病的人群中亦有差异5,6,7,12,NAD水平降低可能主要由于CD38活性增强所致5。因此考虑到CD38在许多疾病和临床实践中发挥的关键作用，建立CD38酶活性测定方法不仅可帮助预测机体衰老和衰老相关疾病进程，其异常变化还能够揭示疾病进展中可能涉及的机制，对于生物化学机制研究和开发衰老及衰老相关疾病的干预措施具有重要意义。相比测定CD38含量等定量方法，测定CD38酶活性能够更好地反映其生物学功能。现有的CD38酶活性测定方法包括酶循环法、薄层色谱法、荧光光度法等，具有操作繁琐、需要放射性同位素、准确度较低等缺点1,10,13o通过高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLO测定酶反应底物降低或产物生成来反映酶活性可能是更好的酶活性检测策略。但目前已有的HPLC法也存在一些问题，如样本基质多为细胞14或组织15；酶促反应时间较长（218h）14,采用多个时间点12,15来计算酶活性；以及采用梯度洗脱12,15,分离时间较长等。本研究对检测样本基质、酶反应底物和反应体系进行了仔细的研究，在此基础上建立了一种简便、可靠的HPLC测定CD38活性的方法，用此方法测定了60名健康体检者和30名结直肠癌患者的CD38活性进行初步应用。材料与方法一、仪器与试剂Agilent1200高效液相色谱仪；SymmetryShieldRP18色谱柱(5m,4.6mm×150mm,美国WaterS公司)；ThernIoSCientifiC恒温水浴锅(美国ThernIo公司)；国产VOrteXKylin-Bell涡旋混匀仪等。B-NAD和烟酰胺(niacinamide,NAM)标准品购自美国Sigma公司，有机溶剂乙月青为色谱纯，购自美国FisherScientific公司,化学试剂高氯酸(perchloricacid,PCA)、磷酸盐为分析纯试剂，购自上海阿拉丁试剂公司。二、实验原理与酶活性定义B-NAD为体内参与氧化还原反应重要的辅酶，可直接或间接影响许多关键的细胞功能，其含量主要受CD38酶的调节8o在CD38酶的作用下，B-NAD可被降解生成二磷酸腺昔核糖(adenosinediphosphateribose,ADPR)和NAM9,如图1所示,且上述三者均有较强的紫外吸收。用HPLC法检测产物NAM,标准曲线外标法定量，通过NAM的生成量来确定CD38酶的活性。CD38酶活性定义为每毫升全血每秒钟产生的NAM的摩尔数，单位为nmolml-1sT,简称活性单位U。-NADADPRNAM士B*Dt!K例l“a二SE在与工ADPR力二B9NAMmV图1CD38酶促反应式三、方法1.样本基质的选择和反应条件的优化：为选择合适的样本基质，分别在血浆、新鲜全血和冻存全血中加入1501浓度为500Hmol/L的反应底物B-NAD,温育0、5、10、20、40、60min后，观察底物消耗或产物生成随温育时间的变化；为排除内源性B-NAD对酶活性测定的影响,添加B-NAD前采取预孵育的方法消耗内源性底物。全血温育0、5、10、20、40、60min后测定B-NAD含量，确定内源性B-NAD消耗完全所需要的时间；为确定反应体系中酶与底物的比例，分别配制全血与500mol/LB-NAD为1：3、1：6、1：9的反应体系，温育0、5、10、20、40、60min后测定产物NAM的生成量。2.样本处理：全血室温融化15Inin后，37OC预孵育20min以消耗内源性B-NAD。同一份全血样本分别取50Pl分装于两管，均加入500Hinol/L的B-NAD标准溶液150I0用涡旋仪充分混匀后，其中一管立即加入40010.8mol/L的PCA终止反应，另一管置于37七水浴中温育40min后加入4001PCA终止反应。48000rpm离心10min,用加样器吸取上清液1501,加入600HINa2HP04,混匀、转移至进样瓶中。3.HPLC分析:采用Agilent1200系列HPLC-UV系统检测酶反应产物NAM的生成量。色谱条件为：C18反相色谱柱(WatersSymmetryShieldRP18),流动相为0.1mol/LNaH2P04水溶液和乙月青(97:3,V/V),等度洗脱，检测波长为260nm,流速1mlmin,进样体积为20口1。4.NAM的标准曲线：采用二倍数稀释法将NAM标准溶液(3.2mol/L)逐级稀释制备浓度为1.6、0.8、0.4、0.2、0.1mol/L的标准系列溶液，按照上述测定方法，以NAM的浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，计算酶反应体系中的NAM05.精密度：采用变异系数(coefficientofvariation,CV)评价精密度。测量低、中、高三个水平的质控全血批内(单日中连续检测3次)和批间(连续3日进行检测)检测结果的CV,分别计算批内CV和总CV。6.回收率：分别采用0.5、1.0、2.0IInlol/L的NAM标准品加入全血中进行回收实验，测定实际浓度，理论浓度为实际添加NAM的浓度，相对回收率计算公式为：7.稳定性：为了考察全血在不同温度下放置不同时间的稳定性，抽血后立即分装全血，分别在4P放置0、1、2、4、8、24、48h,室温放置0、0.5、1、2、4、8h,冻存全血融化后室温放置0、0.5、1、2h,到达放置时间后即贮存于-80ClC冰箱。用所建立的HPLC方法检测不同贮存条件下的全血CD38酶的活性。另考察全血反复冻融13次对CD38酶活性测定的影响。为了考察标准品的稳定性，分别将0.4HmoI/LNAM和15molLB-NAD标准品在4放置0、1、2、4、8、24、48h,室温放置0、0.5、1、2、4、8h后再贮存于-80OC冰箱，HPLC检测其峰面积变化。为了考察进样稳定性，在前处理后将样本在4OC放置0、1、2、4、8、24、48h,室温放置0、0.5、1、2、4、8h后再用HPLC检测NAM和酶活性。8.CD38抑制剂4-氨基喳啾78c对CD38酶活性测定的影响：配制不同浓度（0、0.73、7.3、73、365、730、3650、7300、21900、45900nmolL）CD38抑制剂78c溶液,分别测定含不同浓度78c的反应体系中CD38酶的活性。9.CD38酶活性临床样本测定：2022年11月招募北京医院年龄为<30岁（青年组）和260岁（老年组）各30名表观健康体检者和30例未行治疗的新发结直肠癌患者，采集清晨空腹静脉血2nd,-80保存，用所建方法测定样品CD38活性。本研究获得北京医院伦理委员会批准（2022BJYYEC-062-02）,受试人员均签署知情同意书。10.统计学分析：用MicrosoftOfficeExcel2021软件分析所建方法的线性、精密度等。用SPSS26.0软件分析60例健康人和30例结直肠癌患者数据，Shapiro-Wilk检验显示数据为正态分布，独立样本t检验比较两组间差异，双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果一、反应体系的选择与优化在血浆和全血中分别添加内源性底物B-NAD37t3C温育60min,测定底物B-NAD与产物ADPR和NAM水平，三者之间的相关性如表1所示。在全血中，底物B-NAD与产物ADPR和NAM的水平具有强负相关关系(相关系数r分别为-0.9916和-0.9912),产物ADPR和NAM水平呈强正相关关系(r=0.9993)；而在血浆中，产物之间具有较好的正相关关系(r=0.9302),但产物ADPR和NAM与底物之间相关性较差(r分别为-0.8944和-0.6824)O此外，如图2所示，在全血中加入底物B-NAD温育后底物B-NAD随酶促反应时间延长呈线性降低(r=0.9978),产物NAM随酶促反应时间延长呈线性升高(r=0.9995),产物ADPR随酶促反应时间延长呈线性升高(r=0.9956)o在血浆中加入底物B-NAD温育后各底物或产物随酶促反应时间变化的趋势与全血中一致，但线性较全血中差(B-NAD、NAM和ADPR的随时间变化的线性相关系数r分别为0.9897、0.7186和0.9820)。因此本研究选择全血作为样本基质，选择酶反应产物NAM进行测定，设计酶反应体系。Sl全血和血浆笃质中反应60mln后产物ADpR和NAM与底物B-NAD水平的相关性KNADADPRNAMBNAD1-0.99160.9912ACf>R-0.991610.9993NAM0.99120.99931AK-NAD10.8944-0.6824ADPR-094410.9302NM-0.68240.93021注：BNAD力»f好二瀛音第，ADK力二BWer音福.MAMR三1 OOOf=0. 997 8sv)忠R>QVNAOo 8O 10203040温育时间(min)60rR=Q. 999 5O O4 22漕)l WVN0102030405060温育时间（Inin）住：3NADM三M>Zfie.NANtnetftjK图2底物和产物峰面积随温育时间变化曲线（2A为烟酰胺腺喋吟二核昔酸温育时间变化曲线；2B为烟酰胺温育时间变化曲线）收集北京医院检验科全血样本26份，同一人的一份新鲜全血和另一份冻存复融后的全血，分别加入底物B-NAD在37温育后测定产物NAM的变化量。新鲜全血与冻存全血的酶温育后产生NAM差异无统计学意义（t=0.722,P=O.477）（图3A）；Bland-AItnlan图示大部分点位于一致性界限内,表明新鲜全血与冻存全血测定结果具有较好的一致性（图3B）,且全血样本冻存后不会影响CD38酶活性的检测结果。OO22Vm)IM三WVNOOO新鲜全血冻存全血40肩4H爆目4HO2OO2一O4新鲜全血冻存全血26.3一二71.96SD-30.5-1.96SD100125150新鲜全血与冻存全血的均值)注：中司"力两备的IM.中闻曰伏虔06为过。点改上下两条虚统分眺T.96SDKM.96SD区间E图326例体检者的新鲜全血和冻存全血酶促反瓜后产物NAM生成比较（3A为新鲜全血和冻存全血检测产物NAM结果的箱式图；3B为新鲜全血和冻存全血检测产物NAM结果的Bland-Altman图）为排除内源性B-NAD对酶活性测定的影响，添加底物B-NAD前采取预孵育的方法消耗内源性底物。如图4所示，随着温育时间的延长，B-NAD水平迅速下降，20min后血B-NAD几乎消耗完全，且不再随温育时间延长继续变化，故全血样本测定前预孵育20min09音)®E< QVNIGQ'Ooooooo7 6 5 4 3 2 112 3 本本本 L样样样BF .5060010203040温育时间（Inin）注：BNAD力酷装S图岭二修有酸图4内源性B-NAD随温育时间变化曲线考察不同比例的酶与底物的反应体系，对酶活性测定的影响。结果如图5所示，随着底物比例的升高（酶与底物比1：3、1：6、1：9）,产物NAM的增加量逐渐降低，全血与底物B-NAD为1：3时NAM的生成量最高；但若继续增大体系中全血比例，则反应体系不稳定，综合考量反应体系的稳定性和NAM的生成量确定酶与底物的比例为1：3。O4O3<.>全全全-NAD, 1:3 -NAD, 1:6 -NAD, 1:9O204060温育时间（Inin）3：NAM力断岐图5全血/底物体积比与NAM变化量的关系二、HPLC测定CD38酶活性方法建立NAM最大紫外吸收波长为260nm,用HPLC外标法可直接测定NAM的水平。按照最优条件测定B-NAD添加至全血温育0和40min的色谱图如图6所示，NAM与其他类似物的分离于8min内完成。峰面积（mAU）525图6B-NAD添加至全血不同温育时间色谱图(6A为温育Omin；6B为温育40min)三、NAM的标准曲线及检测限、定量限如图7所示，在0.3.2mol/L浓度范围内，NAM的浓度和峰面积线性关系良好，以NAM的浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)计算标准曲线的回归方程为Y=268.56X-3.9403,R2=0.999。将NAM的信噪比(Signaltonoiseratio,SN)3时对应的浓度定为检测限(limitsofdetection,LOD),S/N10时对应的浓度为定量限(IimitSofquantitaton,LOQ),LOD为0.5nmolL,LOQ为2.1nmolLoy=268. 56X-3. 940 3产=0. 9991OOO(nv)三mvN80060040020000.51.01.5NAM浓度注：NAM力烟酰胺图7烟酰胺的标准曲线四、精密度为了评价所建立方法的精密度，用所建立的HPLC方法测定低、中、高3份不同水平的全血中CD38酶活性，每份全血设立3个平行管，分别计算批内CV和总CV,结果如表2所示，平均批内CV为3.22%4.03%,总CV为2.91%4.70%,提示所建立方法的精密度良好。表2HPLC测定全血CD38酶活性B<全血CD38(U)批内CV低浓度30.12±1.413J中浓度46.64±1.374.1高浓度57.31±1.673.：五、回收率为考察方法的提取效果，分别将0.50、1.00、2.00mol/L的NAM标准品加入全血进行回收率实验，每个浓度设置3份平行样本，相对回收率的计算公式为：（实测浓度-内源浓度）/理论浓度X100%公式（2）"结果如表3所示，回收率在94.82%96.81%范围内，说明方法具有良好的准确度。表3HPLC测定NAM的相对回收立函忌（“mol/Da（moll）0.500.501.0.982.001.96六、稳定性全血在不同条件下的稳定性如图8所示,CD38酶活性在4C至少稳定48h,在室温可至少稳定8h,冻存血融化后在室温放置2h不会影响酶活性，反复冻融3次后CD38酶活性无明显变化。综上，全血中CD38酶活性CV在2.50%5.99%,稳定性较好。标准品在不同条件下储存的稳定性如图9A、B所示，0.4UlnOI/LNAM和15mol/LB-NAD标准品在4七至少稳定48h,在室温可至少稳定8h时,CV在0.71%3.53%。样本前处理后进样稳定性如图9C、D所示，处理后的样本在4OC放置48h,在室温放置8h均不影响酶活性测定结果，CV在5.31%6.09%内，CD38酶活性测定稳定性良好。60.CV=3.40*60F5=5.99%20eteso40Swteso合)»§O4OO)3hO40246室温(h)02融化后室卷图8全血CD38活性在不同条件下的稳定性（8A为全血样本4OC下的稳定性，8B为全血样本室温下的稳定性，8C为全血样本融化后在室温放置不同时间的稳定性，8D为全血样本反复冻融后的稳定性）O C * C 2 9 6 3 (nv) HCV(NAD) = L 90%CV(NAM) =0.71%OooSo 53 2-NAM-NADOoo0 5 0 01- s30Cy(NAD)=3. 53%Cy(NAM)=O.77、-NADO1020 30 40 50、O246 °1041C (h)书4C(h)图9标准品及样本处理后在不同条件下的稳定性（9A和9B分别为NAD和NAM标准品在4和室温下的稳定性，9C为4。C下的进样稳定性，9D为室温下的进样稳定性）七、4-氨基喳琳衍生物78c对CD38酶活性测定的影响4-氨基喳琳衍生物78c是CD38的特异性抑制剂，不同浓度的78c对CD38酶活性的抑制如图10所示，78c浓度增加至7.3nmol/L后，CD38酶活性开始随78c浓度增加逐渐降低,当78c浓度增至7300nmol/L时几乎完全抑制CD38的酶活性，78c浓度继续升高酶活性基本不再变化。提示本方法能够有效反应CD38酶活性变化。OoooooO654321s)878c浓度（nmol图10添加不同浓度抑制剂（78C）对CD38酶活性的影响八、CD38酶活性临床样本测定60名健康体检者CD38活性为(42.59±5.32)U,其中男性为(42.72±5.87)U,女性为(42.46±4.80)U,差异无统计学意义(t=0.185,P>0.05)o老年组CD38活性明显高于青年组(44.40±5.43)U比(40.79±4.61)U,t=-2.776,P=O.007。结直肠癌患者CD38活性为45.42±6.76U,与健康人差异有统计学意义(t=-2.572,P=O.012)。讨论CD38使用B-NAD作为底物有3种催化活性，其中最重要的是发挥NAD糖水解酶活性产生ADPR和NAM090%)6,8,另外两种是发挥ADP-核糖环化酶活性生成cADPR(cyclicADPribose)和NAM(<1%),以及催化B-NAD和烟酸(NA)间进行碱基交换反应生成烟酸腺喋吟二核昔酸(NAAD)和NAM(<10%)o本研究通过使用B-NAD作为底物对CD38催化后的产物NAM进行定量反映酶活性具有可靠的理论依据。酶促反应结果取决于反应体系和反应过程。本研究所建立测定CD38活性方法根据酶促反应产物的增加量计算酶的活性，因此测定结果与反应体系和反应过程密切相关。酶活性受环境温度、PH值、底物浓度等多种因素的调节，反应体系环境应尽量保证与内环境一致。相较之前Kirchberger和Guse14使用室温振摇的方式进行酶促反应，37t水浴更能保证反应环境稳定可控，这一条件与Polzonetti等12,13,16的研究一致。PoIZonettiV定量ADPR产物反应CD38酶活性，但由于CD38也有ADP-核糖环化酶活性，其中间产物CADPR又可产生ADPR,增加了计算的复杂性，且会大大增加检测时间12,15。由于底物B-NAD和产物NAM均为内源性代谢物，不同年龄和健康状态的个体体内含量有很大差异9,10,势必会对酶测定的结果产生影响。本研究中使用预孵育耗尽内源性B-NAD,再额外添加B-NAD底物，分别定量酶促反应前后体系中NAM的含量，使用NAM的变化量反应酶活性，消除了个体内源性B-NAD和NAM差异对酶活性测定的影响。在先前的文献报道中，PoIZonetti等15使用牛肺组织微粒体膜悬液,Kirchberger和Guse14使用细胞，Korkut等13,17使用血清分别建立了HPLC测定CD38酶活性的方法。本研究中使用全血样本，减少了组织研磨、细胞培养等步骤，操作简便、省时，通量更高，更利于大样本人群测定。且由于CD38主要位于细胞膜、细胞核和线粒体膜上的特性5,6,7,相较于血清，全血中的CD38随酶促反应时间延长底物和产物的相关性更佳，线性更好，更能反映个体中CD38活性情况。经反应体系优化及方法学验证，所建方法操作简便、准确精密、通量较高，能够满足临床应用的要求。CD38酶活性受抑制剂调节。多种细胞毒性抗体、酶阻断抗体和小分子抑制剂都被证实可抑制CD38活性，其中4-氨基喳琳衍生物78c中的C4基团可与酶催化位点中的色氨酸和2-酮基与天冬氨酸之间的氢键相互作用，进而达到抑制CD38活性的效果18,19。本研究使用78c作为抑制剂,有效反映了CD38活性受78c抑制情况。同时也提示CD38可作为潜在的治疗靶点，为进一步研究CD38相关疾病的靶向治疗提供了理论依据。CD38在衰老和衰老相关疾病的临床实践中发挥关键作用。有研究发现，在衰老细胞中有CD38表达细胞的聚集，如Ml样巨噬细胞、T细胞和NK细胞等，且在每个细胞中CD38表达量增加。CD38高表达可能主要是由于在衰老及相关疾病进展过程中，Ml样巨噬细胞在白色脂肪组织中积累，且衰老细胞分泌的炎性细胞因子诱导巨噬细胞增殖。Covarrubias等20已证实这些由衰老相关表型诱导的增殖巨噬细胞中CD38表达量增加，从而降低NAD水平。本研究用所建方法分别测定了60名表观健康体检者全血CD38活性，结果发现老年组CD38活性显著高于青年组，与PoIZonetti等7,12的研究结果一致，CD38水平与年龄呈显著正相关，以上结果提示CD38可能是增龄相关的生物标志物。近年老龄科学研究显示，衰老是所有慢性和代谢性疾病的共同危险因素，因此CD38可能在衰老相关疾病的发生发展中发挥重要作用。研究表明，作为重要的衰老相关疾病，肿瘤的生长需依赖周围环境包括内皮细胞和免疫细胞的支持，肿瘤微环境中代谢的调整会影响基因的表观遗传调节并影响细胞增殖和分化,CD38/NAD轴通过CADPR和ADPR等参与Ca2+信号传导进而调节T细胞表型21。CD38功能的丧失与骨髓瘤、2型糖尿病、白血病等密切相关12,癌症患者的血液中CD38活性显著高于健康人，在肺癌、胃癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌和恶性血液肿瘤中分别观察到CD38水平升高，且与肿瘤标记物CEA呈显著正相关1,13,17,22。本研究测定30名结直肠癌患者全血CD38活性，结果表明结直肠癌患者全血CD38活性明显高于健康人，也提示CD38作为肿瘤潜在生物学标志物的可能性。CD38与衰老及衰老相关疾病的关系未来有待在更多的健康和疾病人群中进行验证。综上，本研究建立的HPLC测定CD38酶活性的方法简单高效、准确性高、重复性好，可以满足同时准确测定大量样品的要求，为CD38功能研究、衰老和衰老相关疾病机制的分析提供可靠的方法学手段。本研究仍有不足之处，测定酶促反应前后两个时间点的NAM浓度，增加了检测时间和试剂消耗，仍需深入研究更合适的反应底物，如采用外源性底物等。