中药新药临床前药效及毒理研究.ppt

中药新药临床前药效及毒理研究,总论,第一章 基本概况,1985年国家颁布中华人民共和国药品管理法新药审批办法中成药生产规范 使我国药品管理、生产、研发逐步规范科学。2001年国家颁布了新药品管理法2002年药品注册管理办法 完善与国际接轨国家实行药品质量规范化管理，具体为GMP、GLP、GCP、GAP、GSP等，包括药品生产、研发、临床（安全生产）、栽培、种植及销售各个环节。GLP.(good labortary praetice)GCP(good clinie practice)GAP(good agriculture proctice)GSP(good sale proctice)GMP(good manufactury proctice),同时加大抽查力度、月、季度公布抽查结果，药品广告，使用说明书等等方面。加强整顿、遗留品种、保健品、地标升部颁、民族药物、医院制剂。假药定义：药品成份与国家标准不符的非药品冒充药品者（另外还有：未经批准生产、进口、未经检验的、变质的、被污染的、功能主治超范围的）劣药：药品成分含量不符合国家标准的为劣药，（另外：未注明有效期、或更改不注明或更改生批号，超过有效期，包括未经批准，擅自添加辅料剂、剂）,第一节 基本概念,一、新药（新药申请）未曾在中国境内上市，销售的药品（西药以往按进口申请对等）已上市药品改剂型、给药途径、按新药管理。进口药申请，指在境外生产的药品在中国上市销售 避免在国外批准在中国生产走进品药渠道 以前指的是：我国未生产过的药品叫新药。二、药品注册 依照法定程序，对拟上市销售的药品安全性、有效性、质量可控性等进行系统评价，并做出是否同意进行药物临床研究，生产药品或者进口药品决定的审批过程。,三、国家政策导向 国家鼓励研制新药，对创制的新药及治疗疑难危重疾病的新药实行加快审批（艾滋病、癌症等）。四、药物的临床前研究 为申请药品（注册而进行的药物临床前研究、包括合成工艺，提取方法，理化性质及纯度、剂型选择、处方筛选、制备工艺、检验方法、质量标准、稳定性、药理、毒理、药代动力学、药材、炮制、加工、遗传学、免疫学等研究）。其中安全性评价必须执行药物非临床研究质量管理规范 五、非处方药 指国家药监局公布，不需凭执业医医师处方，消费者可自行判断，购买和使用的药品（OTC）九十九条。六、药品标准 国家药品标准，指国家为保证药品质量制定的质量指标，检验方法以及生产工艺等技术要求，包括中华人民共和国药典药品注册标准和其它药品标准 注册标准，国家药监局批准给申请人特定药品标准。生产企业必须执行有待转正,七：注册分类 1.未在国内上市销售的从中药，天然药物中提取的有效成分及其制剂。2.未在国内上市销售的来源于植物、动物、矿物等药用物质制成的制剂。3.中药材的代用品。4.未在国内上市销售的中药材新的药用部位。5.未在国内上市销售的从中药、天然药物中提取的有效部位制成的制剂。6.未在国内上市销售的中药、天然药物制成的复方制剂。7.未在国内上市销售的中药、天然药物制成的注射剂。8.改变国内已上市药品给药途经的制剂。9.改变国内已上市药品给药剂型的制剂。10.改变国内已上市药品给药工艺的制剂。11.已有国家标准的中成药和天然药物制剂。6中分为：传统中药复方制剂。现代中药复方制剂。天然中药复方制剂。分别按技术要求（32套资料）,第二节：目前中药形势,随着中国加入WTO，必须遵守国际标则，特别是知识产权的保护。阶段标志：仿制药物时代结束，创新药物时代开始，给我们提供了很好的机遇，但中医药也面临了严峻的挑战。有利因素：国家政策优势，（国内方面）美国FDA植物药管理办法颁布，使中药可以合法身份进入国际主流市场（国际上）。需求：回归自然。,不利因素,1、国内方面：自身技术落后，三、四、五类居多。有效成分不清，机理不清，质控手段落后。2、国际方面：市场份颁太小，多是原料药。日、韩、欧、美、高速发展。洋中药进口（10亿元左右）。3、传统药物受到的挑战。人权保护、动物保护，以及一些论理上的原因。人体器官：紫河车、血余炭等。动物保护、穿山甲等。新鲜动物脏器：来源、安全。动物粪便、五灵脂、蚕砂。教材：18,第二章 中药新药的开发研究 第一节：中药新药开发研究原则,一、中医理论为指导作用。中医理论的指导作用 处方组成、功能主治、应用范围，包括药效学研究体现出中医理论特色。二、社会效益、经济效益为前提。开发前景，充分体现其优势艰病率高，广大患者需要，市场缺乏，附加值高等。三、以临床疗效为基准。按指导原则 四、突出创新特点。,第二节 选题,一、了解国家药品注册法规、政策。二、根据长期实践经验，选方做到有的放矢，是在大量基础研究基础之上，而进行开发研究，中医药开发与西药（化学药）的开发是不同的途径。在中医理论指导下进行。症、证明确，治则，清楚，疗效明确。科学性，可操作性，先进性，创新性。三、选题目的：临床价值，科研究价值，经济价值。四、选方途径 临床实践 选题依据：科学试验 古代文献 1.专统古方。2.民间单方、验方、租传秘方。3.现代先进科学技术筛选法。4.由已知成分筛选发现新药，（五味子丙素联苯双酯）。5.活性成分结构改造（秋水仙碱结构改造）等等。,第三节 中药新药开发研究的具体内容,一、中医理论研究 处方组成、处方来源、古籍文献、立题理论依据。条件具备：1.符合中医理论，辨证用药理论。2.君、臣、佐、使配伍合理。3.来材来源明确，标准明确。4.功能主治，适应证体现中医理论。5.病因病机理论。6.治则治法，论证逻辑性。7.从医角度：明确适应症侯。从药角度：方药分析，治则。活血化瘀医治法 药 功效,二、药学研究（一）制备工艺和研究1.提取工艺研究药材的鉴定，与前处理设计与选择技术条件（参数）的研究2.分离、纯化、浓缩、干燥、工艺研究3.剂型选择4.成型工艺研究5.中试生产（二）质量标准研究1.名称：（汉语拼音、拉丁名）按中药命名原则。2.来源：科名、中文名、拉丁名、药用部位，来源、矿 成分。3.性状：形状、颜色、味、表面特征。4.鉴别：专属、灵敏、快速、准确（显微、TLC、理化）。5.检查：杂质。6.浸出物测定。7.含测。8.炮制（药材）9.性味、归经、功能主治，用法用量，注意事项，贮藏、起草说明。,（三）质量稳定性研究二、中药新药药理研究中药药理学是以中医基本理论为指导，运用现代科学方法，研究中药对机体的作用与作用机理以及体内代谢过程，阐明方治疾病原理的科学，指导用药基本规律。中药药理研究为指中药与中药理论的现代药理学。对中药新药而言指药效，一般药理学，药代旨为申请临床提供依据。,四、中药非临床安全性研究（毒理）安全性包括临床和非临床两方面，临床期间完成的叫临床安全性研究，临床前完成的叫非临床安全性研究研究目的。1.消除不安全因素进入临床2.了解药物可能出现的毒副反应3.为临床确定治疗有效剂量和安全剂量，提供依据，参考4.为确定临床，禁忌证提供参考：GLP直译为优良实验室规范，在国外又被称作“新药非临床安全性试验规范”。,各论篇（第一章）,中药新药药效学研究的基本内容与要求一、中药新药药效学研究的意义中药新药的基本要求是安全、有效、可控和稳定，其中有效性或疗效不切是新药治病救人的首要条件，否则就不成其为药物，因此，它是研究评价新药的基础，新药有效性评价，主要包括两部分，实验部分（即主要药效学研究）和临床部分（即临床研究）。主要药效学试验是在机体（主要为动物）or其器官、组织、细胞、亚细胞、分子、基因水平等模型上，采用整体和离体的方法，进行综合和分析的实验研究，以阐明药物防治疾病的作用及其作用机制，从而为新药的有效性评价提供科学的依据。通过药效学研究，可以初步明确新药是否有效，药理作用的强弱和范围；与同类药or毒副反应上的优缺点和特色等。从而确定有无实用价值及发展前景，可否开始人体试用及进行系统的临床研究等。中药的复方药效学研究除观察药物的有关作用处，还可在更深层次上揭示方剂疗效的物质基础，作用的机制及配伍的规律等，有效地指导临床用药和中药新产品的研制。,二、中药新药药效等研究的重要性及局限性,1.发现研制新药及对进行再评价：中药大多来自古方和经验方，有长期的临床实践经验，但其用药特点强调辨证施治，随证加减；用药个体化；多为处方煎剂服用。而研制的新药，包括利用现代医学知识研制的组方，从复方or单味中药内提取的有效成分or有效部位（群），则为固定处方和剂型；工业化生产，有一定的提取工艺；其化学成分，药物性质、功能主治、剂量用法等，均会有很大的变化，特别是原有的治疗作用，毒副反应也可能有变化；应用上强调通用性和社会化。因此，必须进行药效学研究，对研究药物的有效性和安全性进行新评价，以便了解该药可能发生的变化。以及出现新的治疗作用or毒副反应等。,2.为新药的临床研究奠定基础：在不了解新药安全性、有效性的情况下，进行人体试用和临床研究，有可能对试用者造成危害，甚至发生意外。因此，动物试验作为人的潜身，在新药用于人体之前，先进行药效及毒理试验，为临床研究提供可靠的依据，确保受试病人不致延误病情及产生不良后果。尽管人与动物有差异，但大量研究工作表明药物在人体和动物，尤其是哺乳动物，所表现的作用和毒性在大多数情况下与临床研究结果是一致的。例如，黄连的抗菌作用可用于各种感染性疾病，益母草的收缩子宫作用可用于产后子宫复旧不全，甘草的肾上腺皮质皮H样作用可用于治疗艾狄森病。再如人参、黄芪、淫羊藿等的提高免疫功能，丹参、川芎等的扩张冠脉，抗心肌缺血等作用，都可作为临床处方用药及有关药物的研制提供基础。,3.补充临床研究的不足：临床上有些疾病的发病率低，和（or）潜伏期，病程长，因素等干扰，影响研究的准确性，以及难于了解某些细节和规律。而药效学研究；可根据试验目的，严格控制试验条件和各种影响因素，以及造成群体的动物病理模型，便于在复杂因素中发现内在规律性；满足实验研究客观性、准确性、重复性及数据化等要求。再说，动物试验不存在人体试验所受的种种限制和社会道德舆论，可反复进行在人体无法进行的伤害性试验。采用动物模型作为人类疾病的“缩影”，按要求随时收集各种样品，乃至处死动物收集标本，这在临床上是很难做到的。,4.揭示中药复方药效的物质基础，开展作用机制及配伍规律的研究：中药复方是中医用药的主要形式，运用高新技术手段探讨方剂作用的物质基础及其作用机制，综合分析配伍化学成分药理效应三者之间的关系是中药复方系统研究的发展趋势。例如，对于生脉散（人参、麦冬、五味子）复方化学动态变化与药效关系研究发现，配伍后产生了新物质5-羟甲基-2-糖醛（5-HMF）。药效试验表明，5-HMF能降低心脏缺血小鼠血清乳酸脱氢酶（LDH）水平及心肌组织中丙二醛（MDA）含量，有益于全方的抗心肌缺血的作用。等量配伍的芍药甘草汤（白芍药、炙甘草），两药单用对神经肌突触无阻滞作用的浓渡，并用后则产生明显的作用。进而用它们的有效成分芍药苷（PF、25ug/ml）与甘草甜素（GLR,75ug/ml），亦能产生同类样品剂量依赖性的并用效果，最佳配比为PF：GLR=1：2。其作用机制类似于琥珀胆碱，作用点在突触后膜。此外，通过药效学研究，可以寻找能代表总体药效最佳成分及其配比的有效成分or有效部位（群），为开发研制新药奠定基础。例如，从安宫牛黄丸中化裁出清开灵注射液，从当归龙荟丸中提取出靛玉红，以及由苏合香丸化裁出冠心苏合丸等。,配伍是中医用药的特点和优势，用药理研究观察方剂配伍组成及剂量比例与药效学变化之间的关系，探讨方剂配伍的规律，仍然是复方药理研究的重要内容。许多传统处方中 君药的药理作用常是该方的主要药效的体现，如治疗胸痹的瓜蒌、薤白白酒汤（枯萎、薤白、白酒），在扩张冠状动脉，增加冠脉流量，拮抗垂体后叶素所引起的冠脉流量降低等方面，单味瓜萎均有与复方相似的作用，体现了君药的主导地位，但在有些方剂中发挥主要药效作用的药味，与原配伍关系的阐述并不一致，如正交设计研究旋覆代赭汤（旋覆花、代赭石、人参、半夏、炙甘草、生姜、大枣）对正常大鼠胃底条收缩的影响，结果表明方中主药为旋覆花、党参、与传统认为的旋覆花为君，代赭石为臣，党参、生姜、甘草为佐使药不尽相同。再如，生津止渴方剂白琥加人参汤可以降低糖尿病小鼠的血糖水平，方中人参调节血糖，知母促进唾液分泌（解除口渴），石膏对二者均有效，说明全方配伍有相辅相成关系。当归芍药汤在改善小鼠学习记障碍方面，当归和芍药两者最佳配比为1：1.35。,5.药效学研究的局限性：动物试验有一定局限性，人与动物间存在种属差异，临床疾病与动物模型的差异，以及社会因素和精神的差异等，都有可能影响试验结果；有的症状动物也无法反映现来。有些药物对人有明显作用，但对动物却无作用。例如，巴豆为峻下逐水药，使人类产生剧泻，而对小鼠却无泻下作用，反使其长肥，故俗称“肥鼠子”。雷公藤对人有毒，甚至可引起中毒死亡，但对羊无毒性。有些药物在动物实验中有效，而临床上却无效or效果不好，如丹皮中提取的丹皮酚，对实验性高血压有明显降压作用，而对人的高血压则无明显效果，甚至无效；葛根中的黄酮类化合物，对小鼠有很好的避孕效果，但对人无效；垂盆草治肝炎，总黄酮部分动物实验有效，但临床却无明显效果。因此，动物实验不能代替人体观察，中药研究结果最终要由临床来检验。药效学试验及临床研究、是新药有效性评价不可分割的两个主要组成部分的基础。后者是前者的继续与最后判定，两者相辅相成，综合判断，才能对新药的有效性及安全性作出科学、准确、全面的评价。,三、中药新药效学研究的基本要求,1.试验主要负责人应具有药理、毒理专业高级技术职称和有较高的理论水平，工作经验与资历。确保试验设计合理，数据可靠，结果可信，结论判断准确。试验报告应有负责人签字及单位盖章。2.研究单位应具有效高的科研水平：技术力量及组织管理能力，具有良好的客观条件，实验室、仪器设备等。从事新药安全性研究的实验室应符合国家药品监督管理局药品非临床研究质量管理规范GLP（Good Laboratory Practice）相应要求，药效学研究也可参照实行。直译为优良实验室规范，在国外又被称作“新药品临床安全性试验规范”。,3.实验记录：实验记录应符合国家药品监督管理局药品研究实验记录暂行规定要求。实验记录应真实、完整、规范，对实验中出现的新部题特殊现象均应写明情况，防止漏记和随意涂改。描记和形态学检查应有相应的记录图or照片。不得伪造，编造数据。实验记录的内容通常应包括下列几项：实验的名称：每项实验应首先注明课题各称和实验名称。实验设计or方案，这是实验研究的实施依据。各项实验的首页应有一份详细的实验设计or方案。实验时间：每次实验须按年月日顺序记录实日期和时间。实验材料：受试样品，对照样品，及其他实验材料的来源及批号；实验动物的种属，来源及合格证；菌种、瘤株、细胞株及其来源；实验仪器设备名称，型号；主要试剂的生产厂家、规格和生产批号；自制试剂的配制方法时间和保存的条件等。实验材料如有变化，应在相应的实验记录中加以说明。实验环境：根据实验的具体要求，记录实验当天的天气情况和实验微小气候，如温度湿度，光照及通风等。实验方法：常规实验方法应在首次记录时注明方法来源，并简述主要步骤。改进，创新的实验方法应详细记录实验步骤和操作细节。实验过程：详细记录操作过程，观察到的现象，异常现象的处理，影响国因素的分析等。实验结果：准确记录，计量观察指标的实验数据和定性观察指标的实验变化。结果分析：每次实验结果应做数据处理和分析，并有明确的文字小结。实验人员：应记录所有参加实验研究的人员。,四、中药新药药效学研究的步骤及其本内容,（一）试验设计在进行药效学研究工作之前，首先应该在查阅和熟悉文献的基础上，制订试验设计方案，拟定开展药效试验的范围和方法，观察指标，确定阳性对照药，选择动物模型和采用的动物，设立分组和剂量，给药途径，所需仪器设备及其他材料，安排试验进度，参加人员及分工等。这是实施的依据，当然也不是一成不变的，在实施过程中，根据具体情况，可以进一步修改、补充、完善及调整。科学和周密的设计，可以排除各种干扰or无关因素，获得正确、可靠的结果，并能节省人力，物力和时间，避免走弯路。1.试验设计的根据和原则试验设计应依据新药审批办法及有关药政法和规定；参照新药的组方剂型，给药途径，特别是功能主治；临床经验及有关科研和文献资料。其原则是要求实事求是；体现出高水平；坚持中药特点及有新意。研究工作要严格做到：“随机、对照、重复”，以及统计学处理等。,2.根据新药不同情况设计试验方案（1）以病名为主治的新药：要根据主治，参考功能选择相应的试验方法，这适合大多数中药，包括以西医病名为主治的新药。例如，主治阳痿证的药物，应首先与生殖系统（特别是性功能）有关的试验；同时参照新药的功能和（或）疾病的主要症状，以相应的试验，作为辅助药效，从多方面证实新药的药效。健脾补肾可选用一些健脾调整胃肠功能的试验。治疗急性支气管炎的药物，除了抗感染抗炎作用外，针对疾病的症状，选做镇咳、祛痰及解热试验等。有时还需做针对新药作用环节or作用机制的试验，如治疗糖尿病药物的降血糖作用是由胰脏内还是胰脏外因素发挥的机制探讨,（2）以中医证名为主治的新药：应根据该病症的现代认识设计关键主要的试验，参照新药的主要功能和病证的临床症状；设计药理试验方案，例如；治疗脾虚证的药物，根据脾虚证的表现为消化系统功能减退，副交感，神经系统功能偏亢，免疫功能和代谢能力偏低等。药效学试验应以运化水谷及健脾益气为主，故选做有关胃肠功能的试验，对脾虚模型动物的治疗作用，以及抗应做试验和免疫功能测定等。（3）缺乏适当动物模型的新药：如系统性红斑狼疮，皮肌炎、系统性硬皮病等系统疾病，精神病，以及梅核气，奔豚证等，应根据疾病因、病理变化、临床症状及及新药的主要功能等，设计药理试验方案，用间接的药效提示新药的作用。再结合临床研究，对新药的有效性作出评价。例如，银屑病的确切病因尚不明，可能与遗传、代谢障碍、感染、免疫功能紊乱等因素有关；基本病理特点为皮损部位表皮细胞过度增殖和角化不全。药效学可选择调节表皮细胞生长，影响免疫功能，抗炎和止痒作用，以及活血化瘀等试验。,3.新药研究要求的水平：中药及其复方的药理作用广泛，常为多成分、多靶点、多系统的综合效应，故应行选择相应的方法从多方面反映新药的药效。但必须紧扣功能主治，避免“以广取胜”。主要药效学研究，应选择能够反映中药作用本质的实验方法和观察指标，首先应确定主要作用（关键性药效）。一般主要作用设1-3项，每项应选作23种实验方法，从多指标验证其药效。其他作用（辅助性药效）可酌情做25项，每项选做12种实验方法。应分清主次，突出重点。,例如：抗癌中药多从多方面进行研究。第一为抗癌作用，抑制or杀死癌细胞；第二为扶正作用：增强免疫功能，提高机体的抗病能力；第三为增效作用：对瘤动物or患者的化疗的放疗具有增效作用；第四为减毒作用：可减轻正常的荷瘤动物对化疗和效疗的毒副反应。上述四种作用中，抗癌作用是主要的，有明确的抗癌作用，可能开发为抗癌药物；抗癌作用不明显，但具有扶正，增效的减毒作用者，只能作为抗癌辅助药应用。研究抗癌药物应主要去荷瘤动物非观察其抗癌作用应选择3种or以上（包括实体瘤，腹水瘤和白血病各一种）肿瘤，重复3批实验，观察新药对肿瘤大小、重量、外观、可通过切片及荷瘤动物体重、全身症状和生存期等的影响；还要进行试管内抗癌作用研究，可选择对药物较敏感的肿癌细胞，进行试管内抗癌试验，or进行肿瘤细胞培养的抗癌试验。,新药的药效应能证实其主要的治疗作用，以较主要的其他治疗作用。主要的药效作用该应明确，并力求反映量效和（or）时效关系。有时药效不够明显，or仅见作用趋势，统计学处理无显著差异，应如实上报作为参考，但仅适用于辅助药效；药效学实验，通过体内，体外多种实验方法，从多方面、多层次、全面深入地阐明其药作用；也可只做能充分证实其主要治疗作用的药效，但应有明确的量效关系和时效关系，并有一定的作用机制研究，尽可能用实验证明其人效成分和有效部位（群）就是主要药理作用的成分。药效学试验应尽量反映出受试药的特点，包括作用强度作用时间，作用特点，避免低水平重复。对于局部用药治疗远隔部位or全身疾患的药物，如局部or穴位贴药治疗高血压，冠心病等，如有可能应进行透皮吸收实验，以了解药物吸收数量及速度等，有助于评价药效。但很多中药成分复杂，目前正难以确定有效成分，进行透皮吸收试验尚有困难。至于药物的作用机制，药代动力学及复方中药的配伍试验等，在可能的情况下适当选做，由于中药的特点及技术的困难等因素，目前不宜强求。中药材新的药用部位，以人工方法在动物体内制取物和引种（养殖）药材的药效学试验、均应与原药材作比试验。以中药疗效为主的中药和化学药品复方剂，需做该组方中的中药、化学药品，制剂三者在药效、毒理方面的对比试验，以出现组分间的任何协同or毒副反应等方面具有一定的优点，包括药效作用的增强和（or）互补，毒副反应在的降低等。,（二）药效学试验的方法,中药药效试验的方法大致分为体外实验和体内实验两类：1.体外实验：又称离体实验，是在体以进行的实验观察方法，包括离体器官、离体组织，细胞体外培养及试验等。它可以排除体内多种因素的干扰，重复性好，结果易于分析，具有省药、省动物等优点，适用于分析试验，特别是作用机制的研究。但存在一定的缺点和局限性，尤其是中药的粗制剂，直接与器官、细胞等接触，杂质和理化性质的均能影响实验的结果，如药物的溶解性、粒度、PH、无机离子及鞣质、不溶物质等。往往在试管内抗菌作用强的中药，在体内不一定出现抗菌效果。含有大量钙离子or鞣质的煎剂，尽管对离体平滑肌，有明显的兴奋作用，在口服时不一定出现相应的作用。再则，离体实验失去了机体完整统一的内环境和N体液调节，与临床状态相距较远。有些药物须经内体代谢为活性成分后才有药理作用。因此，离体实验与体内实验结果不一致的现象时有发生。例如，理气药陈皮、青皮等对胃肠边平滑肌作用表现，离体为抑制，口服煎剂一般为兴奋，主要原因是离体时为其中橙皮苷和对羟福林等成份的作用；口服时药物的所含挥发油对胃肠粘膜的刺激发挥作用。栀子苷的利胆作用很弱，在体内代谢物京尼平（genipin）作用增强；正如磺胺类药物体外的抗菌作用甚弱一样。,为了解决这个问题，血清药理学的实验方法是首先给动物服药，然后取其血清作为药物源进行药理学观察。粗制剂和复杂的成分经过消化已及吸收分布，代谢排除等体内过程，再取含药的血清进行药理实验，比较接近药物体内环境中产生药理作用的真实过程，故适用于中药，特别是复方进行药效评价及其作用机制的研究，还可进行血清药化学及药气力学的研究。受试动物多用大鼠，豚鼠、家兔等。每日服药1次或2次（间隔24h），连用3日，亦可每日1次，连续7日。给药剂量可参考公式：剂量=在体实验的给药量反应系统中被稀释的倍数。但可能因血药浓度不完全随给药剂量相应增加，以及受灌骨浓度和容量的限制等，不可能达到公制成的血清冻干粉，加入反应系统，使之达到需要的浓度。给药后采血的参考时间，如每日给药2次，连续3日，为末次给药后的30mim至1h。血清药理实验，虽然可以克服离体实验中存在的某些缺点，但尚未完全成熟，还存在着一定的问题。例如，血清的来源和含药浓度、加药剂量（不能添加100%浓度的血清），以及动物给药的剂量、给药方式、采血时间、血清处理等诸多因素，需要进一步完善和确定，故影响其推广应用。另外，对不通血液而起的作用，尤其是中药对整体的调节功能，便不能反映和观察。因此，不能完全取代体内实验。,2.体内实验 又称在体实验，是用整体动物进行药理实验的方法。根据试验需要可以选用正常动物或病理模型动物，按照试验的周期可以分为急性实验和慢性实验。前者一般指观察一次给药后机体在短时间内出现的反应，如麻醉动物血压实验、急性毒性试验等。但中药往往起效较慢，作用较温和，即使急性实验，有时也需持续多次给药，如37日甚至更长时间后才能出现效应。慢性实验指观察机体在较长时间内多次给药出现的反应，如寿命试验、慢性造瘘（胃肠瘘、子宫瘘等）、长期毒性试验等。在体实验比较接近临床状态，尤其符合中药多成分、多靶点、多系统的调节整体作用，并可弥补离体实验的不足和局限性，故中药的药效学试验以体内实验为主，体外实验为辅。结合中医临床用药的实践，以消化道给药为主，其他给药途径为辅。尚若为中药有效成分或有效部位（群）、制剂较纯者，或临床为注射给药者，可用体外实验或注射给药进行主要药学试验。,（二）药效学试验的动物模型,研究和评价新药的防治作用需要建立动物模型，20世纪以来，新药研究发展较快的原因之一是成功建立了很多病理模型，从而开辟了实验治疗的广阔领域。1.药效学研究中动物病理模型的基本要求：理想的动物模型应与人类疾病的临床相似，特别是中医“病”或“证”的动物模型应具有中医特点，与临床辨证相似。但要求一个动物模具型完全与人类疾病及临床表现相似，这几乎是不可能的。因为许多人类疾病的病因和病理变化尚未阐明，除传染病以外，大多来类推于基因的异常和缺陷。中医的“病”、“证”尤为复杂，例如，脾虚证可见消化道吸收、分泌、自主神经功能紊乱，体温调节中枢和血管运运中枢失常，内分泌和免疫功能变化等系统的异常。某些动物模型往往侧重于体现有关“病”、“证”的一定阶段，某一证型，某些主要症状或病理变化。,动物模型有自发性动物模型及诱发性或实验两大类。前者包括突变系的遗传疾病和近交系的肿瘤模型，如高血压大鼠、高血糖小鼠、肥胖症小鼠、无胸腺裸鼠、青光眼兔等。其最大优点是疾病的发生发展类似于人类，但这些模型来源困难，不可能大量使用。近代医学常用的是实验性动物模型，即通过物理、化学和生物等致病因素，人工诱发动物某些组织器官或全身的损伤，在功能、代谢和（或）形态学上出现与人类相应疾病类似的病变。这类模型可以在短期内大量复制及适应研究目的等特点，但其与自然发生的疾病模型毕竟存在一定差异性。为此，在设计制造该类模型时，应尽可能克服其不足之处，发挥特点。评价模型的好坏、成功与否，关键是看能否反映防治对象的本质。只要能反映事物的本质，模型的设计越简单好。例如，抗毒药的模型，只要给动物攻毒就行；药物的抗菌、抗病毒作用常用体内保护试验可做常规的抗菌谱，观察指标合理，效率也高。至于技术的先进性，方法的难易固然能反映研究的水平，但不是主要的。如果模型选择不当，再高的水平只是花架子，不可能得到正确的结果。,动物模型选择标准应尽可能符合中医临床证或病的要求，以整体模型为主。例如，根据“虚则补之”的辨证施治原则，研究补益药最好采用虚证模型，因为正常动物属阴阳平衡，正气不虚的机体，故对许多临床患者有效的补益药用正常动物往往看不到补益的效果。研究证明，在“气虚证”动物模型上，免疫指标比正常动物普遍低下，给予参芪注射液后，多项免疫指标明显回升，而对正常动物则不如虚证模型升高明显。正如解热药只降低发热者的体温，对正常体温却无降温作用，解痉药则对痉挛情况下的器官作用强而显著一样。,2.动物模型的意义 动物病理模型是具有人类疾病模拟性表现的实验对象和材料，它是探索人类疾病本质及新药有效性评价的一个重要方法和手段。人类各种疾病的发生发展极为复杂，要深入研究其发病机 机和病理变化，以及观察和评价药物的疗效，不能也不应该在病人身上进行。例如，放射病、毒气中毒、烈性传染病等平时很难见到，急性白血病、血友病及自身免疫性疾病等收集亦较困难。有的疾病潜伏期及病程较长，如肿瘤、慢性气管炎、肺心病等，要几年、几十年，有些致病因素需要隔代乃至几代才能显示。即使病种病情相同，因病人的性别、年龄、体质、遗传及社会因素等不同，也会影响疾病的病理过程。利用动物，可以在控制实验条件下，用单一或特定的病因，短期或较短时间内复制出典型的病理模型，不但在群体上容易得到满足，并且可以避免在人身上进行实验的危险性。正确制作或选择一个合理的动物模型，可以增加药效学研究的真实性、可信性、成功率，提高研究的设计水平和科学性。相反，使用一个不合理的模型，则会使实验结果失去准确性，甚至与原设计完全相反。即使得出实验者满意的结果，也会因动物模型选择不当而得不到认可。,3.中医证的动物模型“证”是中医在长期临床实践中对某些症候群的概括，对诊断和治疗等十分重要，辨证才能施治。可见，建立证的动物模型，一方面可提供该证的研究对象，探索其病因、病机、证候及病理变化等，以便了解疾病的本质；另一方面则用于观察和评价新药的疗效。在中药药理研究中，目前应用较多的动物模型主要有两类：一类是拟“病”的模型，另一类是拟“证”的模型。后者如“血瘀”、“阴虚”、“阳虚”、“气虚”、“血虚”、“脾虚”、“肾虚”、“厥脱证”等动物模型。但由于目前对各种“证”的病因病机和生理生化变化等本质远未彻底阐明，故很难复制与临床有关“证”相符的动物模型。为检验所制“证”模型的可靠性，目前常从两个方面加以衡量，一是用比较法，将动物模型的症状与中医临床症状加以比较。由于中医辨证是从人体出发，采用望、闻、问、切的诊断方法很难在动物身上进行，所以要用要模型动物上所测得的生理生化指标、组织形态变化与临床患难与共者情况进行比较。另一是用药物反证法，即用中药代表方（药）对所建立病理模型进行治疗，根据有无疗效来判断模型的可靠与否，同时也可以观察中药的作用。例如，模拟血瘀证的病理模型能被活血瘀方（药）所逆转；血虚证动物模型，用养血药治疗，应产生预期的治疗作用。为使动物模型尽量接近中医的“证”，应采用多种病因，不同动物，以及多方法，多指标地进行研究。,4.模型的相对性 动物模型虽然在人类疾病及药物的研究中，发挥了不可抹抹灭的作用，但由于种属差异，造模方法，机体反应性的不同，特别社会因素和环境因素等，很难与人类疾病及证候的临床表现完全相同。尽管人们建立了一些病（证）的动物模型，但尚处于探索阶段，有的仅用于病因病机证候的研究，不适宜药理学试。比较成熟、科学合理的中医病（证）动物模型甚少，无论是数量或是质量均与目前要求相差甚远。在不同模型上，药物疗效的差异给新药的研制工作带来较大的困难。为此，研究中应尽量选择与人体反应比较接近的动物模型，发现矛盾时应深入分析原因，从中找出比较合理的模型。一个药物往往需要用几个模型（一般为2个或以上），从不同侧面证实其药效。有的要在研制工作中反复进行，切忌单凭个别动物指标就作绝对的肯定或否定。,在实际评价具体的模型时，仍然存在很多分岐，即使像病因已明的病毒性乙型肝炎，至今仍无大家能接受的模型，有的认为鸭肝炎可以作为模型，但有人认为鸭肝炎与人的乙型肝炎相差较大。对中医“证”的动物模型争议更大，如20纪纪60年代的糖皮激素“阳虚”模型，至今仍持有不同见解。有些疾病的模型本身就不大好建立，如高血压、冠心病、风湿病等，虽相应地建了许多模型，亦成功的评选过一些新药，但与人体比较，在病因和病理上还有相当的距离。有的疾病现在还缺乏模型，如神经性皮炎、鳞屑病、酒查鼻等。有些药物剂型也难以在动物上实施，如脐敷、坐敷及肛门栓剂等。由上可见，很多动物模型尚有待改进、完善和积累经验，更多的则有待于创新建立。应该支持和鼓励人员努力探索，在充分实验基础上，创建新的动物模型。由于中药与化学药品药效学研究的基本原则、主要内容和技术要求，有很多相同之处，故亦可借鉴现代药理学的理论、方法和手段，以补充中药药理学研究工作方法的不足。例如，结扎冠状动脉造成“心肌缺血”的动物模型，用醋酸刺激制造“溃疡病”动物模型等。只有这样，才能促进药效学评价的发展。另外，每一种动物模型，常常对某些药效反液压较敏感和准确，而对其他方面则较差，在选用动物模型时，应充分权衡其优缺点，用其所长，以取得理想的结果。,（四）药效学试验指标的选择,药效学试验选用的指标应能准确无误地反映药物对机体的影响，所以要注意以下几项要求。1.特异性 所选指标应该针对性强、专属性好，能够反映变化本质。例如，要观察药物的降压或升压作用，检测血压是特异性的关键指标；如要说明药物对急性肾炎的治疗作用，尽管血压升高也是急性肾炎常见症状，但并非特异的关键指标。因为急性肾炎并不一定会有血压升高，血压变化也不能代表药物对急性肾炎的疗效；而应选择肾功能检查、尿液检查或肾形态学检查等作为关键指标。在中药药理研究中，有时确定特异性指标还存在困难。例如，要说明中药的解表、开窍、助阳、滋阴等，难以找到单一的特异性指标。对此，在一个指标不够时，可以用一组指标来弥补。如解表药可选用发汗解热、镇静、镇咳、祛痰、平喘、抗炎、抗敏及免疫功能等药效学试验指标。,2.敏感性 指标要敏感，能准确反映病情、证候的变化及药物的防治作用。敏感性差或迟钝的指标，会遗漏某些阳性变化，造成假阴性。有的指标，由于弥散度大，标准差大，而导致统计学无显著性意义。3.重视性 指标要稳定，重现性好，结果才可靠。如发现重复性差，应及时排除种种干扰因素，纠正对检测指标的影响，重新实验。否则重复性差的结果不可信，不能作为新药疗效评价的依据。4.客观性 主观检测的指标，不够准确。例如，肉眼观察动物自发活动的影响，可带有很大的主观性。如果用光电计数仪，计算动物活动的次数，或用记录仪记录小鼠在一定时间内活动或行走的轨迹，那就是客观的量化指标。肉眼测量血压计水银柱，亦有很大误差，而用描记仪直接描记血压曲线，动态的记录血压的变化，则更为客观。,5.指标的量化 为了判断和比较药物的作用，便于统计学处理，检测指标应有量的概念。但是指标本身并不都是有数量的。量反应指标有数量可表示，而质反应指标则没有。后者只反映现象的出现与否，如死与不死、掠厥与不惊厥等。这类指标只能通过累计现象出现的频率来达到数量化（如阳性反应的百分率）。也可采用计分法，接阳性反应的程度人为地区分为若干级。例如，S.Irwin介绍的动物行为观察法，把小鼠的行为分解为40多个指标，每个指标都区分为8级，以反映给药后行为变化的程度。形态学（如组织、病理）指标亦难于定量、常需采用定量组织学方法，如根据病理改变的范围程度等，人为地进行定量或半定量。各种指标均有其优缺点，例如生理、生化指标可以定性定量及动态观察，但有时定位欠佳，可受多种因素干扰，稳定性较差；而形态学指标可定性、定位，但难于定量及动态观察。如果一项指标难于满足要求，可综合选用生理、生化、形态学等多方面的指标，使试验结果更为全面和准确。但若单一指标已能达到要求，则不必为了多和全而勉强采用多指标的检测。,（五）药效学研究中的动物选择,动物的选择，首先应根据试验目的和要求，以及动物本身的特点，再参考是否容易获得、经济、饲养和管理等情况。尤其要注意动物的种类、品系及质量、健康状态等。,1.种类 动物的类别和种属不同对药物的反应存在很大差异，有时对药效试验的成败起着关键的作用。选择动物既要考虚对药效学设置检测指标的敏感性，更要注意与临床病人反应的一致性。在可能条件下，尽量选择功能、代谢、结构与人类相似的实验动物，使用期对药物的反应接近人类。灵长类（猴、猩猩等）是最近似于人类的理想动物，但价贵、难得，又需特殊饲养条件，所以选择动物时亦不能盲目追求。例如，药理实验最常用小鼠，因其有易繁殖和饲养，价廉，消耗药量少等优点。家兔对体温变化十分灵敏，常用于观察药物解热作用及检查热源。豚鼠易于致敏，适用于做过敏实验。猫、狗和大鼠血压稳定，适宜观察药物对血压的影响。狗具有发达的血液循环和神经系统，以及与人相似的消化过程，在毒理方面的反应与人比较接近，常选用于药理和毒性学研究。猪在解剖和生理上与人相似，近年来选用猪做实验动物的日见增多；尤其是它的皮肤组织结构与人近似，选用小猪作烧伤实验研究是较理想的动物。,2.品系 不同系列的动物对药物的敏感性不一，这也是普遍存在的现象。例如，C57BL小鼠对肾上腺皮质激素的敏感性比DBA和BALB/C小鼠高12倍。DBA小鼠对音响刺激非常敏感，电铃声可引起性痉挛，甚至死亡，而C57BL小鼠却根本不会出现此反应。DBA/2与DBA/1小鼠对同一病毒（如new castle 病毒）的反应完全不同，前者引起肺炎，而后者引起脑炎。A、C3H、津白等品系小鼠易致癌，AKR、DBA/2、L615等易致白血病。C3H雌鼠乳腺癌自发率达90%，AKR小鼠白血病自发率达65%。这些均可选作有关实验的动物。目前国内外使用的实验动物，以小鼠为例，大部分是近交