TGXAS-家蚕核型多角体病毒(BmNPV)制备技术规程.docx

ICS65.020.30CCSB47T/GXAS团体标准TGXASXXXXXXXX家蚕核型多角体病毒(BmNPV)制备技术规程TechnicalcodeofpracticeforpreparationofBmNPV（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上.XXXX -XX-XX 发布XXXX-XX-XX实施广西标准化协会发布前言本文件参照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西壮族自治区蚕业技术推广站提出、归口并宣贯。本文件起草单位：广西壮族自治区蚕业技术推广站、河池市蚕业技术推广站、广西农业工程职业技术学院。本文件主要起草人：安春梅、黄文功、闭立辉、黄扬玉、吴静颜、刘艳伟、浦月霞、莫嘉凌、黄康东、黄玲莉、李枫烽、覃龙伟、韦博尤、苏红梅、强艳芳、兰艳妮、黄凌、李嘉。家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术规程1范围本文件确立了家蚕核型多角体病毒（BrnNPV）制备技术的程序，界定了制备技术涉及的术语和定义，规定了设施设备、核型多角体病毒制备的原则，以及家蚕核型多角体病毒复壮、扩繁、收集、提取、清洗、保存等操作指示。本文件适用于广西行政区域家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的制备。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB45/T83种茧育养蚕技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。31复壮rejuveation将致病力下降的家蚕核型多角体病毒用经口添食的方法感染家蚕，使其致病力恢复的过程。a5扩繁proliferationandreplication家蚕核型多角体病毒进入宿主，在宿主体内产生大量子代病毒的过程。4设施设备设复壮扩繁房间、病毒提取房间.复壮扩繁房间应配备配置蚕架、蚕匾等附属蚕具，温湿度调控设备、消毒机具。病毒提取房间配备光学显微镜、低速离心机、血球计数器、纯水机、冰箱、移液枪等。5家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备原则病毒制备过程中产生的可能含病毒的废渣废液在病毒灭活后作无害化处理，严防病毒扩散到环境中。图1家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术流程7技术要求71病原复壮家蚕核型多角体病毒配制成高浓度（IX10"PIBsZml以上）的病毒悬液，取桑叶在病毒悬液中浸泡，捞起晾干表面水分后添食BmNPv敏感品系的5龄起蚕，第2餐开始普通桑叶饲养，5d6d后收集出现典型病症还未皮肤破裂的活蚕，用75%的酒精消毒蚕体，晾干后剪尾角收集血液备用。取血后的蚕体经破碎过源离心后收集多角体病毒。75扩繁增殖扩繁采用注射活蛹和添食5龄起蚕2种方式进行。7.2.1活蛹注射选择化蛹后24h48h的BmNPV敏感品系健康蚕蛹，用注射器将病复壮后取得的病蚕血液斜刺入蛹体皮下，将病原接种到蚕蛹中。接种后的蚕蛹置于25C29C的条件下发育96h120h,收集发病症状明显的病蛹。收集的病蛹于T8P冰箱保存。7.2.2经口添食5龄起蚕经复壮的多角体病毒加入超纯水，配置成较高浓度（IXlORPIBS/ml以上）的病毒悬液备用。取桑叶在病毒悬液中浸泡，捞起晾干表面水分后喂食BmNPV敏感品系的5龄起蚕，第2餐开始改喂新鲜普通桑叶正常饲养，5d6d后收集出现典型病症的病蚕，收集的病蚕于T8C冰箱保存。71病毒的提取纯化与保存7.3.1组织破碎将收集到的病蚕或病蛹，加入适量超纯水破碎组织。7.3.2过滤加入超纯水搅拌均匀，用80Fl滤网过滤，滤渣再加入超纯水搅拌再过滤，重复2次，收集滤液。7.3.3离心收集的滤液50OrPm离心IoInin,收集上层悬浮液，反复多次，直到50OrPm离心IOmin后底部无大颖粒沉淀。将收集的悬浮液3000rpm4000rpm离心10min,留沉淀。7.3.4清洗在收集的沉淀中加入超纯水，重悬成悬浮液，3000rpm4000rpm离心IOnlin,留沉淀。多次重复此步骤，宜至沉淀呈现出灰白色7.3.5保存病毒沉淀等量加入50%甘油，用移液枪吹打，将甘油与病毒沉淀混合均匀，封口贴标签于T8C冰箱中保存。74消毒清洗按照DB45/T83种茧育养蚕技术规程的规定执行。