趋磁细菌磁小体与磁小体形成蛋白地指导应用.doc

word趋磁细菌磁小体与磁小体形成蛋白的应用摘 要：趋磁细菌的磁小体因其优良的性质，具有很大的合成和应用价值。本文在介绍趋磁细菌和磁小体形成的根底上, 重点研究磁小体和类磁小体纳米颗粒的合成。由于趋磁细菌直接培养与合成磁小体的障碍颇多，所以文章转向研究磁小体合成相关的蛋白研究，并重点考察了Mms6蛋白，对其在体外的矿化作用与合成的单分散纳米磁颗粒MNP的性质进展了探索。此外，文章还研究了Mms6蛋白合成MNP的方法，确定了较优的反响条件，具有良好的前景。关键词：趋磁细菌 磁小体 Mms6MNP1趋磁细菌与磁小体1.1 趋磁细菌趋磁细菌magnetotactic bacteria，MTB是一类胞含有可感应磁场的磁小体，在鞭毛的辅助下可沿磁场运动的革兰氏阴性细菌。这类微生物分布很广，常见于氧化复原过渡界面附近，在酸性环境、海底、热泉等特殊环境也有发现。系统发育分析明确，这类菌主要属于Proteobacteria 门的 、亚属。自养菌可以通过氧化铁等无机物获得能量，异养菌可以从酒石酸等有机酸中获得能量。1.2 磁小体的性质磁小体magnetosome，MS是指趋磁细菌细胞生成的由膜包围的磁性颗粒。每个趋磁细菌细胞可包含有1 条至多条磁小体链, 位置靠近细胞壁, 一般沿细胞的长轴方向分布。磁小体大小一般35-120 nm、强磁性、由生物膜包被、具有单磁畴、呈有序链状排列于胞。磁小体主要成分是Fe3O4magnetite或Fe3S4greigite，形态有八面体、立方体、棱柱体、球状体、牙齿状和子弹状等。1.3 磁小体的优点与应用磁小体与一般人造磁性纳米颗粒相比有许多优点：1有生物膜包被，且处于超顺磁性围，不易聚集，具有良好的分散性；2磁小体膜上带有大量生物活性基团，可用于与其他分子的共价连接，且连接其他分子后可方便地通过外加磁场别离纯化；3载药磁小体在体通过降解磁小体外膜的方式即可实现药物的释放；4生物来源使其具有良好的生物相容性和安全性。所以，磁小体在多个领域有潜在的应用价值。如细胞别离、核酸提取与别离、核酸特异识别、磁介导热疗、药物靶向传送、生物分子载体、磁性探针、医学成像和环境重金属处理等领域。尤其值得注意的是磁小体在信息存储中的应用因为磁小体具有超微性纳米级均匀性和无毒性，可生产品位高的磁性生物材料，可以进展高清晰、高保真的大容量超高密度磁记录材料的开发。2. 趋磁细菌合成磁小体的研究与主要障碍 磁小体具有极高的应用价值，故而利用趋磁细菌直接合成磁小体是一个自然的想法。事实上，有不少研究者已进展了趋磁细菌性质的探索与应用如表1。但是很少有大规模生产和商业化应用的实例。这主要由以下原因造成：（1） 生长条件苛刻由于趋磁细菌主要在氧化复原过渡界面附近，所以它们的生长需要特殊的氧化物与复原性物质的浓度梯度。大多数趋磁细菌是厌氧的，少数趋磁细菌能在较低的氧气浓度10%-12%条件下生存，但氧气浓度太高或太低都会影响其生存，为实验室大量培养造成了困难。（2） 磁小体的合成影响因素较多研究明确，营养物质铁离子浓度，碳含量和氧气浓度都会影响磁小体的产量，甚至是磁小体的大小。这就为大规模统一生产磁小体造成了很大障碍。（3） 生物安全使用细菌进展磁小体生产并从其体提取磁小体，可能携带有生物膜，蛋白质，核酸等污染，这在医药中可能引起很大问题。表1、趋磁细菌相关研究成果直接利用趋磁细菌合成磁小体受到阻碍时，下一步就是研究磁小体合成中相关基因，试图找到重要的可以在其它工程菌中表达的基因，进展大规模生产。3 磁小体合成与Mms6蛋白3.1 磁小体的合成与相关基因趋磁细菌基因组上有一段特殊的区域“磁小体岛，该基因岛与磁小体的合成密切相关，负责细胞质膜陷成为磁小体囊泡、磁小体蛋白的定位、磁小体排列成链、磁铁矿的生物矿化等步骤，每个步骤分别有独立的基因控制。研究明确，MagA 有助于趋磁细菌从外界环境中吸收铁，膜蛋白MamB，MamQ，MamI 和MamL 在细胞质膜陷成为磁小体囊泡的过程中发挥作用，磁小体可以沿着MamK 蛋白所形成的纤维结构在胞排列成链，酸性蛋白MamJ 可以控制磁小体链的形成。另外，还有一种矿化蛋白Mms6，可以辅助磁小体形成与形态调控。该蛋白在近年来研究很广，以下具体分析Mms6蛋白性质与应用。3.2 Mms6蛋白Mms6蛋白是磁小体形成中起重要作用的蛋白。最先在趋磁螺菌Magnetospirillum magneticum AMB-1中被发现，并能与AMB-1体的立方八面体MNP严密结合。Mms6的N端疏水，可能与磁小体的脂膜结合有关；其C端可能与铁离子，磁小体前体或形成过程中的晶体外表结合羧基的酸性，从而辅助了体MNP立方八面体性态的形成。3.3 Mms6蛋白在体外的矿化作用Arakaki 【2】等人发现Mms6在体外同样可以辅助立方磁颗粒的形成，且这种体外形成的磁铁矿呈现出立方八面体的晶体形态，晶体颗粒尺寸均匀，超顺磁性，与AMB-1 中的磁小体非常相似，该发现就引发了后续对Mms6合成类磁小体的单分散纳米磁颗粒MNP的研究。4. Mms6蛋白体外合成单分散纳米磁颗粒MNPTanya Prozorov 【3】等研究者对Mms6在体外的矿化作用做了比照验证。通过将Mms6，铁结合蛋白，脂笼蛋白L2和BSA放入FeIII和FeII1：2的溶液，在室温下进展共沉淀实验 (RTCP)，可以观察到Mms6矿化效果的明显优势纳米颗粒形态规如此，统一，大小适宜30nm(图 1B.)。而其他铁结合蛋白形成的纳米颗粒形态不一且大小偏小。图1图 1. TEM images of magnetite nanoparticles obtained by co-precipitation of FeCl2 and FeCl3:A) without protein, B) with Mms6, C) with ferritin (Note that ca 5 nm iron oxide nanoparticlesseen as darker small dots appear embedded in surrounding globular bodies, most likely protein),D) with Lnc2, and E) with BSA此外，Mms6合成的MNP还具有良好的磁学性质。比拟不同铁结合蛋白形成的纳米颗粒的磁滞回线，可得Mms6合成的MNP的优势：（1） 易磁化，易退磁 由Mms6合成的纳米磁颗粒磁滞回线狭长，包围面积小，磁滞损耗小，矫顽力小，说明其易磁化，退磁。 (2)超顺磁性 由Mms6合成的纳米磁颗粒在较低磁场时较快达到饱和，说明其磁矩较大，呈现强磁性。在阻隔温度TB之上，磁滞现象几乎消失，曲线都符合Langevin 方程, 说明其在阻隔温度TB之上的超顺磁性。图22所以，Mms6在体外合成MNP的可行性与优越性已被证明。4.2 Mms6在体外合成MNP的方法研究在Tanya Prozorov的研究中，磁纳米颗粒分散在溶液中，收集和应用有一定困难。而现今科技尤其是高通量的数据存储急需的是能结合在固定相上的单分散的MNP。所以，在2012年Johanna M Galloway等人对Mms6在体外合成纳米磁颗粒的实验方法进展了研究与优化，完成了对Mms6表达，固定，与矿化这一系列的操作。(1) Mms6表达与纯化在2007年，Tanya Prozorov等研究者已经成功表达与提取了Mms6蛋白。他们通过选用AMB-1 趋磁细菌，设计Mms6基因编码区的引物，用PCR法成功克隆出Mms6基因。将基因转入pTrcHis TOPO质粒，在Mms6的N端加上多组氨酸标签并选用大肠杆菌作为载体，成功表达并提取了His-tagged Mms6。相关序列如图3图3、Mms6重组蛋白序列与碱基序列Johanna M Galloway等人在此根底上进展了优化。为了提高产率，研究者在蛋白后参加了N端麦芽糖结合蛋白MBP，以提高重组蛋白的溶解度。His-tag也被插入N端，使得提纯更为方便。用固定化金属离子亲和层析(IMAC)进展提纯。在Mms6序列和N端还参加了一个蛋白酶切位点，使得在参加His6-TEV 蛋白酶的情况下可以切去Mms6后的His8-MBP tag。图4图4、Mms6重组蛋白构建(2)固定相的构建与Mms6蛋白附着研究人员使用了自组装单分子层 (SAM)进展操作，具体而言，在金外表加上烷硫醇构建SAM。实验使用了两种SAM，分别为四乙二醇烷基硫醇PEG和一端含羧基的烷硫醇PEG-COOH，PEG主要解决生物污损问题，即抵抗蛋白的结合；而PEG-COOH在碳化亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS存在的条件下可以形成酯键，能与蛋白的N端高效连接。所以，在参加Mms6后，即可进展蛋白的固定相附着。如图5(注：图5中聚二甲硅氧烷PDMS主要作为stamp起隔绝作用，与PEG一起构建SAM的pattern) 图5、SAM固定相的构建与蛋白附着3Mms6矿化方法 回顾2007年已使用的RTCP法，发现MNP难以结合在固定相上，这主要由于溶液中存在可移动的Mms6，在温和条件下一旦滴入碱性液体，可以很快催化矿化反响，在液相外表就形成MNP，而在底部的固定相与碱性液体接触较晚，矿化效果不佳。 所以研究者研究了氢氧化物法POFHK。该方法先用氢氧化钾对铁的氢氧化物进展了局部氧化，再利用Mms6进展矿化，原理图如图6。图6、POFHK原理图该方法的特点是氢氧化物反响较慢，且需加热，所以在反响过程中所有反响物都能进展充分混合和反响，这使得在固定相上的Mms6蛋白能与反响物充分反响，控制一定实验条件，可达到较好的矿化效果。(图7)图7、POFHK法Mms6矿化效果图在不同实验条件下操作，得到图8所示各图，可见图8a效果最优，对应条件为80°C ，2小时，试剂：共 10 mL: 50 mMFeSO4, 40 L 50-60% N2H4, 200 mL 26% NH4OH, 100 mM KNO3。图8、不同方法下Mms6矿化效果图通过研究，使用生物方法Mms6蛋白进展固定相上纳米颗粒MNP的合成已有了较为完善的方案。4.3 Mms6蛋白合成MNP的优缺点 (1)优点：相比化学方法如己烷，甲苯，氯仿，290°C反响在试剂上更易获得，且生物方法可以持续生产。反响条件上相对温和80°C (2) 缺点：实验试剂的用量比例需严风格控，且仍有一些MNP附着在了PEG上(PEG应该是防止附着的)，使得形成的pattern并不很理想。5、展望与设想 第一，从目前得到的研究成果看，关于趋磁细菌的研究还存在着巨大的挑战，尤其是趋磁细菌的培养和利用，还亟待进一步研究。下一步的研究重点应是筛选较易培养的趋磁细菌并对其培养条件进展优化。可以通过研究趋磁菌原始生活环境的理化参数来进展实验室模拟培养或通过对其原始生境的改良以开展固体平板培养获得单菌落，尤其可以改造现已研究较多的MSR-1、AMB-1 等大规模培养和生产磁小体。第二，可以考虑将趋磁细菌磁小体合成的相关基因磁小体岛转入其他工程菌如大肠杆菌，进展磁小体的大规模生产。不过磁小体合成的相关基因研究尚不完全，整个基因岛的异源表达也未有研究，进展较为缓慢。第三，可以考虑重点利用Mms6蛋白合成类似磁小体的MNP，而且该方面已有较为深入的研究。Mms6蛋白的表达与体外矿化方法已较为成熟，且表现出生物方法的独特优势。不过Mms6矿化还需在实验条件上做进一步优化，相信利用趋磁细菌磁小体合成的Mms6蛋白进展MNP合成前景光明。参考文献1、Magnetotactic Bacteria: Performances andChallengesAbhilasha Singh Mathuriya, Kratika Yadav & B. D. KaushikGeomicrobiology Journal (2015) 32, 7807882、A Novel Protein Tightly Bound to Bacterial MagneticParticles in Magnetospirillum magneticum Strain AMB-1, A. Arakaki, J. Webb, T. Matsunaga, J. Biol. Chem., 278 (2003) 8745-8750.3、Protein-Mediated Synthesis of UniformSuperparamagneticMagnetite Nanocrystals ，Tanya Prozorov, Surya K. Mallapragada,Adv. Funct. Mater. 2007, 17, 9519574、Nanomagnetic Arrays Formed With theBiomineralization Protein Mms6,Gavin Burnell, Stephen D Evans and Sarah S. Staniland Journal of Nano Research February 20125、Integrated Self-Assembly of the Mms6 Magnetosome Protein toForm an Iron-Responsive Structure，Shuren Feng, Lijun Wang, Pierre Palo ，Molecular Sciences 20136、磁小体形成过程相关基因和蛋白的研究进展，新星，云慧，建平 生物技术通报 2013年第8期16 / 16