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第五章 基因工程疫苗 第一节 疫苗概述一、疫苗的起源与发展疫苗的起源可以追溯到我国古代。早在4世纪初，东晋葛洪所著肘后方中，已有关于防治狂犬病的记载：“杀所咬犬，取脑敷之，后不复发”。在宋真宗时代（公元1000年左右）宰相王达之子患了天花，四处请医无效，最后请来了峨眉山的道人，取其患处的结痂，处理后进行自体接种而治愈，这当是最早的自身免疫治疗（self-Vaccine）。,逐渐发展成了预防天花的人痘接种法，即从感染天花后的恢复期病人或症状比较轻的病人身上，挑取水泡、脓疱和痘痂内容物并保存1个月左右待其干燥，然后将其研磨成粉末，给健康人的鼻腔吸入，以预防天花，取得了很好的保护效果。这是人类史上最早使用疫苗来预防疾病的记录，较英国医生琴纳（Jenner）发明牛痘苗早了几百年。,15世纪中期我国的人痘苗接种法传至中东，后经改革进行皮下接种。1721年英驻土耳其的大使夫人，将此法又传至英与欧洲各国。人痘的发明是中国人民对世界医学的一大贡献。2000年，美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）出版了疫苗可预防疾病的流行病学与预防学第6版，在这本被誉为疫苗学权威手册首页的“疫苗接种的里程碑”中，第一项即是“12世纪中国开始用人痘接种预防天花”（见表6-1）。这是对中国首先开始使用人痘接种预防天花是最早的免疫接种形式的肯定。,表5-1 疫苗发展史上的里程碑事件,引自：CDC：Epidemiology and Prevention of Vaccine-preventable Disease.6 Edition，2000,17965.14英国乡村医生爱德华琴纳（Edward Jenner）进行了人类历史上的第一次疫苗接种试验。Jenner从一位感染了牛痘的年轻挤奶农妇的手上挑取了痘苗接种到一名8岁男孩的手臂上。经过几个月的严密观察，发现小男孩获得了免疫保护，一直没有感染天花。1798年9月，Jenner发表了接种“牛痘”预防天花的论文，虽然当时全然不知天花是由天花病毒感染所致，但这一划时代的发明，开创了人工自动免疫的先河。,随后，种痘技术传遍了欧洲，后又传到北美和亚洲。为纪念Jenner的这一伟大贡献，巴斯德（Pasteur）将疫苗称为Vaccine（拉丁文vacc是“牛”的意思）。由于长期和广泛地使用牛痘苗，全世界从1977年以后再也没有发现过天花病人。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）于1979年10月26日庄严宣布，天花已在全球绝迹。这是人类历史上第一个使用疫苗消灭的传染病。,19世纪70年代，法国科学家路易斯巴斯德（Louis Pasteur）有关减毒鸡霍乱菌的研究，是继琴纳之后的重大进步。他认为使用减毒的病原体来预防其导致的疾病，比使用相关的动物病原体来预防人类疾病理当更加有效。巴斯德建立了现代意义上的预防接种，即通过实验室内研制的疫苗来预防传染病。随后的羊炭疽减毒活疫苗的试验成功，尤其是1885年首次在人体使用减毒狂犬病疫苗的成功，标志人类进入了一个预防接种的科学新纪元。基于安全原因，正式生产的均为狂犬病灭活疫苗，质量上也在不断的改进。Pasteur在疫苗研制领域的先锋作用和卓越贡献引起了第一次疫苗革命。,到19世纪末，人类在疫苗学领域里已经取得了辉煌的成就，包括2个人用病毒减毒活疫苗（琴纳的牛痘，巴斯德的狂犬病），3个人用细菌灭活疫苗（美国Salmon和Smith、法国Chamberlai和Roux的伤寒、霍乱和鼠疫），以及疫苗学的一些基础概念，如Metchnikoff的的细胞免疫（1884年），Ehrlich的受体理论（1897年）及毒素-抗毒素作用。,进入20世纪前30年，疫苗学在三个方面取得了重大进展：首先，法国科学家Calmette和Guerin在1906年从牛体分离到1株结核菌，经过13年在牛胆汁中传递230代，获得1株减毒株，制成疫苗，于1927年上市，即所谓卡介苗（BCG）。其次，在20年代，巴斯德研究所的Ramon应用化学灭活方法获得白喉和破伤风类毒素并研制成疫苗。第三，Wilson Smith和Thomas Francis分别在禽胚中研制成功2种灭活甲型流行性感冒（流感）疫苗。,二次大战后，疫苗研究进入了突飞猛进的发展阶段。波士顿的Enders及其同事发展了病毒的体外细胞培养技术，促进了多种减毒和灭活病毒疫苗的研制。50年代，先有Salk的3价灭活脊髓灰质炎（脊灰）疫苗（IPV），后有Sabin的3价减毒脊灰疫苗（OPV），为人类渴望在地球上消灭脊灰提供了有力武器。同一时期还研制了在鸡胚细胞中培养减毒的麻疹疫苗。60年代研制了在鸡胚中减毒的流行性腮腺炎疫苗。70年代研制了在细胞中培养的风疹疫苗。细菌疫苗方面，70年代细菌夹膜多糖的纯化技术促进了多个侵袭性细菌疫苗的研制成功。同一时期的病毒蛋白纯化技术也促进了血源性乙型病毒性肝炎（乙肝）疫苗的研制成功。,20世纪80年代，现代分子技术的应用推动了又一代疫苗的研制，引发了疫苗发展史上的第二次革命，其首要成果是基因重组乙肝疫苗，为人类在地球上消除乙肝提供了希望。与此同时，化学、生物化学、遗传学和免疫学的发展在很大程度上为新疫苗的研制和旧疫苗的改进提供了新技术和新方法（表5-2）。,表 5-2 新技术对疫苗研制和开发的作用及影响,至今已有30余种疫苗成功的用于人类疾病的预防（表5-3）。其中一半以上是病毒疫苗。如天花（poxvirus）、小儿麻痹（poliovirus）、麻疹（Measles）等曾严重危害人类生命与健康的疾病的流行得到了有效的控制。其中天花已被根除，创造了使用疫苗在自然界中彻底消灭一种病原微生物的医学奇迹。人类消灭脊髓灰质炎的目标也即将实现。,表 6-3 人用疫苗发展年表,表 6-3 人用疫苗发展年表,我国自1919年开始建立专门的机构（中央防疫处，北京生物制品研究所前身）从事生物制品的研究、生产，这是我国第一所生物制品研究所。建国后，我国政府重新组建和新建了北京、上海、武汉、长春、兰州、成都等六个生物制品研究所。中国现有疫苗产品生产企业约30家，是世界上疫苗产品生产企业最多的国家（表5-4）。中国的疫苗产品年产量已经超过10亿个剂量单位，疫苗的种类和数量也达到世界之最，其中用于预防乙肝、脊髓灰质炎、麻疹、百日咳、白喉、破伤风的儿科常见病的疫苗生产量达到5亿人份，已经全部实现计划免疫接种。中国生产的疫苗产品已经能够满足防病、灭病的需要。,表 6-4 中国主要疫苗种类和生产厂家,二、疫苗与基因工程疫苗 传统疫苗（Traditional Vaccine）用人工变异或从自然界筛选获得的减毒或无毒的活的病原微生物制成的制剂或者用理化方法将病原微生物杀死制备的生物制剂，用于人工自动免疫以保护人或动物产生免疫力，这些制剂被称为疫苗（多用于预防），即疫苗是由病原体制成的。,国内常将细菌制作的人工主动免疫生物制品称为菌苗。将病毒（Virus）、立克次氏体（Rickettia）、螺旋体（Spiral coil）等微生物制成的生物制品称为疫苗。现在国际上一般将细菌性制剂、病毒性制剂以及类毒素统称为疫苗（vaccine）。,基因工程疫苗：上述狭义的疫苗被称做传统疫苗（traditional vaccine），即完整的病原体为主制成的疫苗；而基因工程疫苗则属于新一代疫苗（New generation Vaccine）或高技术疫苗范畴（High-tech Vaccine）。主要包括基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等等，广义的还包括遗传重组疫苗、合成肽疫苗、抗独特型抗体疫苗以及微胶囊可控缓释疫苗等。,现代疫苗（Modern vaccine）：是一种利用现代分子生物学技术使用Ag通过诱发机体产生特异性免疫反应以予防和治疗疾病或达到某种特定的医学目的生物制剂。,三、传统疫苗与新型疫苗的区别：传统疫苗疫苗的研制则主要是通过人体实验从经验与失败中获得。20世纪以来，随着病原学、流行病学、免疫学，特别是病毒组织培养技术的发展，大量传统疫苗相继问世。,免疫学的进展，使人们可以通过是否产生中和抗体判定疫苗成功与否。几乎所有免疫保护机制明确，可以产生中和抗体，又易于培养的疫苗都已获得成功。甚至一些新出现的疾病，主要具备上述特点，也可以使用传统疫苗技术迅速研制成功（表5-5）。对于免疫保护机制不明确，有潜在致癌性或免疫病理作用，以及病原不能或难于培养的疫苗，使用传统疫苗技术就很难研制成功。,新型疫苗新型疫苗则是在分子生物、分子免疫学、蛋白化学以及相应的生物高技术基础上发展起来的（Woodrow，1997）。重组DNA技术包括促进了疫苗生产技术的发展。,从现代的观点来看，我们可以把疫苗定义为：一种使用抗原通过诱发机体产生特异免疫反应以预防和治疗疾病或达到特定医学目的的生物制剂。目前新型疫苗的研究主要集中在改进传统疫苗和研制传统技术不能解决的新疫苗两个方面，包括肿瘤疫苗、避孕疫苗及其它非感染性疾病疫苗的研究，其中发展治疗性疫苗已成为新型疫苗研究的重要组成部分。,注：“+”为已投入生产，“-”为未生产，“*”为已停止生产,第二节 病毒疫苗的种类一、传统病毒疫苗 又称常规疫苗或第一代疫苗，是长期以来用于传染病预防的主要生物制品。1、灭活疫苗（dead Vaccine）灭活疫苗又称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养的完整的病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持其免疫原性，并结合相应的佐剂而制成的疫苗。疫苗液中除含有灭活的病毒颗粒外，还含有细胞成分和培养病毒时加入的牛血清等蛋白类物质，多次接种疫苗容易发生过敏反应。,优点制造工艺简单免疫原性的稳定性高易于制备多价疫苗,缺点：1）需要严格的灭活操作，保证疫苗中不含有灭活不完全的颗粒。2）灭活疫苗所提供的免疫力较短暂，为完成免疫程序，需要进行多次接种，由于机体反复接受疫苗中的异性蛋白质的刺激，而可能出现不良的过敏反应。3）有些灭活疫苗，如早年制备的麻疹灭活疫苗，可使有些受接种者在以后自然接触麻疹病毒时，引起严重的麻疹感染过敏性反应。4）灭活疫苗虽可刺激机体产生IgM和IgG抗体，但有时却得不到满意的保护效果。,2、减毒活疫苗（attenuated vaccine）减毒活疫苗又称弱毒疫苗，是指将微生物的自然强毒株通过物理、化学和生物学的方法，连续传代，使其对原宿主丧失致病力，或只引起亚临床感染，但仍保持良好的免疫原性、遗传特性，用这种毒株制备的疫苗就叫减毒活疫苗。当前使用的病毒疫苗多数是减毒活疫苗。活疫苗具有可诱发全面的免疫应答反应（体液免疫和细胞免疫）、免疫力持久等优点。,常用的减毒方法有以下几种：1）体外减毒 即体外连续传代减毒。在异源宿主中连续传代；在单一宿主中反复连续传代。2）冷适应筛选温度可以改变病毒的特性，得到冷适应株。病毒冷适应株常伴有毒力减弱和各种特征性标志。冷适应筛选稳定的减毒突变株是在传统疫苗设计中较早采用的方法，而且也是最为行之有效的思路。,减毒活疫苗与灭活疫苗各有优缺点。前者优于后者。减毒活疫苗可使机体产生亚临床感染，特别当以自然途径，如口服或喷鼻免疫时，可产生广谱的免疫应答，即除循环性抗体IgM和IgG外，在病毒侵入的门户如呼吸道和消化道也可诱生局部抗体IgA。,3、亚单位疫苗（subunit vaccine）亚单位疫苗是指提取或合成细菌、病毒外壳的特殊蛋白结构，即抗原决定簇制成的疫苗，这类疫苗不是完整的病毒，是病毒的一部分物质，故称亚单位疫苗。亚单位疫苗仅有几种主要表面蛋白，因而能消除病毒（或细菌）的许多无关抗原决定簇和粗制或半提纯的病毒（或细菌）制剂诱发的不良反应。,表 5-6 灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗三类疫苗的比较,二、新一代病毒疫苗新一代病毒疫苗（新型疫苗）主要指利用基因工程技术研制的疫苗。基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基缺失活疫苗，通常也习惯地将遗传重组疫苗、合成肽疫苗和抗独特型抗体疫苗包括在新型疫苗范畴。,1.New Generation vaccine or High-tech Vaccine（高技术疫苗）基因工程亚单位疫苗（gene engineering subunit vaccine)基因工程载体疫苗(gene engineering vector vaccine)核酸疫苗(nucleic acid vaccine)基因缺失活疫苗(gene deleted live vaccine)蛋白工程疫苗(protein engineering vaccine)2.遗传重组疫苗(genetic recombinant vaccine)3.合成肽疫苗(synthtic peptide vaccine)4.抗独特型Ab疫苗(anti-idiotype Ab vaccine)5.微胶囊可控缓释疫苗(controllable released micro-capsule vaccine),（一）基因工程疫苗 gene engineering vaccine基因工程疫苗，也称遗传工程疫苗（genetic engineering vaccine），指使用重组DNA技术克隆并表达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物，或重组体本身制成的疫苗。主要包括基因工程亚单位疫苗，基因工程载体疫苗，核酸疫苗，基因缺失活疫苗，及蛋白工程疫苗等五种。,1、基因工程亚单位疫苗(gene engineering subunit vaccine)基因工程亚单位疫苗，主要是指将基因工程表达的蛋白抗原纯化后制成的疫苗。优点：产量高；纯度高；安全性高；用于病原体难于培养或有潜在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗研究。,缺点：与传统亚单位疫苗相比，免疫效果较差。增强其免疫原性的方法：调整基因组合使之表达成颗粒性结构 是在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球 加入有免疫增强作用的化合物作为佐剂（adjuvant）。,2、基因工程载体疫苗（gene engineering vector vaccine）基因工程载体疫苗是指利用微生物做载体，将保护性抗原基因重组到微生物体中，使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗。优点：疫苗多为活疫苗，重组体用量少，抗原不需纯化，载体本身可发挥佐剂效应增强免疫效果缺点：曾感染过腺病毒或者接种过痘苗的人，对载体微生物已具有免疫力，使之接种后不易繁殖，因而影响免疫效果。,3、核酸疫苗（nucleic acid vaccine）核酸疫苗或称基因疫苗（gene vaccine），指使用能够表达抗原的基因本身，即核酸制成的疫苗。,优点：易于制备；便于保存；可多次免疫并且容易制成多联多价疫苗。缺点：外源核酸是否会整合到染色体中引起癌变；能否引起免疫病理作用，如自身抗核酸抗体的产生，免疫耐受等。,4、基因缺失活疫苗（gene deleted live vaccine）基因缺失活疫苗使用分子生物学技术去除与毒力有关的基因获得的缺失突变毒株制成的疫苗。优点：有突变性状明确、稳定；不易返祖、毒力恢复；是研究安全有效的新型疫苗的重要途径。,5、蛋白工程疫苗（protein engineering vaccine）蛋白工程疫苗是指将抗原基因加以改造，使之发生点突变、插入、缺失、构型改变，甚至进行不同基因或部分结构域的人工组合，以期达到增强其产物的免疫原性，扩大反应谱，去除有害作用或副反应的一类疫苗。,（二）遗传重组疫苗（genetic recombinant vaccine）遗传重组疫苗是指使用经遗传重组方法（genetic recombination）获得的重组微生物制成的疫苗。通常是将对人体无致病性的弱毒株与强毒株（野毒株）混合感染，弱毒株与野毒株间发生基因组片段交换造成重组，然后使用特异方法筛选出对人体不致病的但又含有野毒株强免疫原性基因片段的重组毒株。,（三）合成肽疫苗（Synthetic peptide vaccine）合成肽疫苗是指使用化学方法合成能够诱发机体产生免疫保护的多肽制成的疫苗。优点：纯度和安全性高；副作用小；可长期在常温下保存；缺点：其抗原性单一；免疫原性弱。因此须用几种合成肽抗原联合使用，还须用多种方法提高合成肽的免疫原性。,（四）抗独特型抗体疫苗（anti-idiotype vaccine）抗独特型抗体疫苗是指使用与特定抗原的免疫原性相近的抗体（ab2）做抗原制成的疫苗。目前此疫苗尚处于理论性研究阶段。,（五）微胶囊可控缓释疫苗(controllable released micro-capsule vaccine)微胶囊可控缓释疫苗，指使用微胶囊技术将特定抗原包裹后制成的疫苗。,特点小于10m的微胶囊在注射部位可被巨噬细胞吞噬并携带至淋巴结附近和免疫系统其他部位，具有更强的免疫效果。大于30m的微胶囊，更适于做可控缓释。由于微胶囊的保护作用，母体抗体不能使抗原失活，可用于婴幼儿免疫接种。微胶囊在肠道内不受酸或酶的影响，可用于口服。,第三节 基因工程病毒疫苗的开发现状一、急需研制的基因工程病毒疫苗急需研制的基因工程病毒疫苗主要有十几种,表 4-2 需要研制的基因工程病毒疫苗,注：“+”表示需要，“-”表示不需要,二、值得使用基因工程技术进行改造的传统病毒疫苗对那些免疫保护效果差，或副反应较大，或成本较高，或使用不方便的传统疫苗，使用基因工程技术对其改造，或用基因工程疫苗取而代之，将具有极大的市场前景。,表5-3 值得使用基因工程技术进行改造的传统病毒疫苗,三、重要病毒性疾病基因工程疫苗研究进展目前，病毒基因工程疫苗主要集中在研制常规技术不能或很难解决的新疫苗和改造免疫保护效果差，负反应较大，或成本较高，或使用不方便的传统疫苗上，有的疫苗兼有预防和治疗两种功能现将我国重要的病毒病基因工程疫苗研究状况概述如下（参见表5-4）。,表5-4我国重要病毒病基因工程疫苗研究开发状况,艾滋病（AIDS）疫苗HIV共有9个基因：3个结构基因：gag、pol、env；6个调节基因：tat、rev、nef、vif、vpu/vpx、vpr,1、艾滋病（AIDS）疫苗（1）研究的三阶段：最早使用其膜抗原gp120（Glucose protein 120）膜抗原加其他能诱发细胞免疫抗原的多抗原疫苗的复杂设计；在泰国使用gp120亚单位疫苗数千人免疫接苗无效后，改为先用重组痘病毒ALVA（疫苗注射后），再使用gp120亚单位疫苗加强，80%以上的人产生了特异的体液和细胞免疫反应。,（2）HIV感染特点：HIV直接感染破坏免疫细胞；HIV变异极快。,（3）AIDS疫苗研究方向：能诱发有效的中和抗体，阻止或大部阻止HIV感染免疫细胞；能诱发强细胞免疫；中和抗体屏障被部分突破时能有效清除被感染细胞，是研究中应统筹考虑的。,2、乙型肝炎病毒（HBV）疫苗,乙型肝炎病毒（HEPATITIS B VIRUS）,形态结构：乙肝患者血清中发现3种相关颗粒小球形颗粒：HBsAg 不含核酸管形颗粒：小球形颗粒串连成 大球形颗粒：为完整的病毒颗粒，具传染性（DANE颗粒）:DNA、逆转录酶,HBV,HBV形态结构,大球形颗粒（Dane颗粒）,小球形颗粒,管形颗粒,HBV的小球形颗粒,HBV的管形颗粒,Dane 颗粒,HBV的抗原组成,表面抗原HBsAg核心抗原HBcAg e抗原HBeAg,表面抗原HBsAg,存在于三型颗粒中是HBV感染的主要标志分亚型（a,d/y,w/r,adr）产生抗-HBs具有免疫保护作用疫苗接种成功,HBcAg,乙 肝,HBcAg主要存在于HBV感染的肝细胞内或DANE颗粒 核心中，到血液中即被降解为HBeAg。,一般血清学方法检测不到HBcAg，而只能检测到抗-HBc,（6）抗-HBc,抗HBc-IgM：是HBV近期感染或慢性感染者病毒活动的标志,病毒在复制,抗HBc-IgG：凡“有过”HBV感染者均可阳性,HBcAg的免疫原性最强,持续时间：618个月,可终身阳性,e抗原HBeAg,仅存在于Dane颗粒中游离存在于血液中为病毒复制及强传染性的指标产生抗HBe，是预后良好的征象,乙肝血源性疫苗，基因工程疫苗（酵母系统、哺乳动物细胞系统）,（1）目前存在的问题：人群中约10%左右对现有乙肝疫苗（仅含S抗原的疫苗）无反应；（2）研制方向：使用含前S（主要是前SI）的新一代乙肝基因工程疫苗，可使对现有S乙肝疫苗无反应的人群产生良好的免疫反应。目前，含前S的疫苗，新佐剂乙肝疫苗，乙肝抗原抗体复合物疫苗，治疗性乙肝研究的热点。,（3）丙型肝炎病毒（HCV）疫苗 丙型肝炎感染约占人群2%左右，也就是有2000多万感染者，大部分都会转为慢性，并导致肝硬化和肝癌，危害远大于乙肝。研究方向；多数实验集中于使用病毒外膜蛋白E1+E2研制病毒样颗粒的亚单位疫苗和使用载体进行重组活疫苗研究。由于丙肝病毒变异快，极易冲破已有中和抗体的屏障，选择变异不大且能诱发细胞免疫的抗原是目前研究的重要的方向之一。,4、戊型肝炎病毒（HEV）疫苗戊型肝炎病毒属杯状病毒科，单股正链RNA病毒，基因组全长约7.4kb。经消化道传播，暴发流行和散发两种，戊型肝炎的临床表现比甲型肝炎重。选择基因工程的手段研制戊型肝炎疫苗唯一的方法。基因工程疫苗主要采用原核细胞、酵母细胞和昆虫细胞三种表达体系。,我国目前以原核细胞和酵母细胞对戊型肝炎病毒结构蛋白均表达成功（张明程，1999）抗原性在世界范围内稳定，表明戊型肝炎病毒基因工程疫苗将对该病的预防具有良好的效果。,包括正粘病毒科 流行性感冒病毒 副粘病毒科 呼吸道合胞病毒、麻疹病毒 其他呼吸道病毒 腺病毒,主要以呼吸道为侵入门户,5、呼吸道感染病毒,对粘蛋白具有特殊亲和力的一类RNA病毒,1918-1919第一次世界大战期间，发生一次大流行，当时全世界20亿人口，10亿被感染死亡人数2000万，超过一战中死亡人数的总和,最严重的一次流行,20世纪5次大流行：1900、1918、1957、1968、1977,核心：负单股RNA、78个节段（易变异原因）内层：核衣壳 核蛋白（NP）RNA多聚酶,中层：内膜蛋白（M蛋白）外层：包膜，双层脂质 其上有刺突：血凝素HA 神经氨酸酶NA,流感病毒的结构组成,生物学性状,（二）抗原性与分型,1、内部抗原（核蛋白和内膜蛋白）抗原性稳定，分甲A、乙B、丙C三型 2、表面抗原：HA、NA 分亚型(subtype)依据 易变异,生物学性状,流感病毒的表示方法,A/Bangkok/1/79(H3N2),最先分离的地区,最先分离的日期,抗原,（三）变异性与流感流行抗原性易变异是流感V最突出的特性,1、抗原漂移antigen drift：抗原变异幅度小，属于量变，中小型流行，每年有发生。变异机理：编码血凝素基因发生一系列点突变，（某一核苷酸的碱基发生改变）导致氨基酸序列改变。,生物学性状,2、抗原性转变antigen shift：变异幅度大，质变，大流行。每10-40年出现一次。变异机理：基因重组(交换核酸片断）,生物学性状,5.呼吸道合胞病毒（RSV,Respiratory syncytial virus）疫苗 呼吸道合胞病毒属单股副链RNA病毒，是引起婴幼儿肺炎的主要病因。RSV保护性抗原主要是其糖蛋白F和G，高度糖化蛋白，抗原结构复杂，属结构依赖性抗原，产生中和抗体的能力都很差，给研制RSV蛋白亚单位疫苗带来了一定困难。,研制方向：目前研制的高度减毒的非复制型载体是研制该疫苗的重要途径；制备减毒活疫苗是RSV疫苗研制的另一个重要途径;负链RNA病毒cDNA转染技术的成功给使用现代分子生物学技术制备RSV的分子减毒活疫苗带来了希望，也是目前RSV疫苗研制重要途径。,6、人巨细胞病毒（HMV）疫苗（1）危害：HMV 属疱疹病毒科，通常为隐性感染，无明显临床症状。然而 HMV的潜伏感染将对人体健康造成极大威胁。（2）问题：该疫苗株虽能诱发体液和细胞免疫，但保护作用不强，且其潜在的致癌性，以及尚未能最终排除的潜伏感染性，使该类活疫苗尚未能广泛使用。,（3）研制方向：目前使用分子生物学技术，有目的地去除与与毒力、潜伏及肿瘤相关基因的分子减毒疫苗株正在研制中。基因工程技术表达的gB做亚单位疫苗或重组活疫苗的研究已成为目前HMV疫苗研究的一个重要方向。,7、单纯疱疹病毒（HSV）疫苗（1）危害：单纯疱疹病毒有两种类型（HSVI和HSVII），在人群中感染相当广泛。HSV I人群感染率高到50%-90%，多为隐性潜伏性感染。母婴传播中疱疹性角膜炎视力障碍新生儿死亡率高达60%。在病毒性脑炎中，HSV I型感染引起的占10%。HSV II主要经过性传播，病毒检出率可达5%-12%。HSV II感染是宫颈癌的重要诱因之一。,（2）方向：病毒糖蛋白gD和gB是主要的保护性抗原，与gC、gE、gI联合使用可诱生体液和细胞免疫，在动物实验中，HSV II gD 的核酸疫苗可以保护动物免受感染及随后的潜伏感染，这些研究为单纯疱疹病毒疫苗的研究提供了有力的证据。,8、登革热病毒疫苗（Dengue fever virus vaccine）（1）危害：登革热病毒属黄病毒科，为单股正链RNA病毒，有4个血清型，蚊子叮咬传播给人，在我国南方热带亚热带地区发生过多次登革热流行。,（2）方向：通过表达prM-E形成病毒样颗粒的亚单位疫苗显示了较好安全性和免疫保护性，是该疫苗研究的重要方向。使用该病毒感染性cDNA进行的分子减毒活疫及多种亚型嵌合的减毒活疫苗研究也取得了较好效果，是另一个重要途径。,9、人乳头瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）疫苗人乳头瘤病毒是环型双链dsDNA病毒，其中与宫颈癌密切相关的有HPV16、18、33、58等亚型。外壳蛋白L1和L2能诱发机体产生体液和细胞免疫，预防乳头瘤病毒感染；E6和E7是与细胞转化有关的蛋白，表达E6和E7的重组痘病毒疫苗能有效阻止HPV阳性的宫颈癌细胞生长和转移。表达HPV16和HPV18两型E6和E7的重组痘苗病毒已进行了小量人体观察，证明产生了部分抑制肿瘤生长的结果（1996）。L1和L2可在细菌、酵母及痘苗病毒载体中很好表达，并形成病毒样颗粒，有很好的安全性和免疫效果。治疗性疫苗以E6和E7为主，加上L1和L2可增强治疗性疫苗免疫效果。,10、Epstein-Barr病毒（EB）疫苗（1）危害：EB病毒为疱疹病毒科，嗜淋巴细胞病 毒属，感染广泛，90%以上成人都感染过此病毒。（2）方向：阻断其原发感染；清除鼻咽癌细胞。,（3）方法：前者主要以EBV的MA（如gp350）为免疫原，gp350亚单位疫苗和表达gp350的重组痘苗病毒活疫苗显示了一定抗瘤作用；后者主要以EBV的潜伏膜蛋白LMP1和LMP2为免疫原，进行了多肽、重组活疫苗、DNA疫苗免疫细胞疫苗等多种尝试。,11、埃博拉病毒（EBV）疫苗vaccine）埃博拉病毒是单股负链RNA病毒，属丝状病毒，致死率极高。致病机制尚不清楚，曾试用过灭活疫苗，效果不好，减毒疫苗存在危险性，至今尚未成功。,第四节 我国基因工程病毒疫苗的开发战略研究（Development strategy of gene engineering vaccine in china)一、首先要明确基因工程病毒疫苗在整个病毒疫苗研究开发中的地位和任务(Status and task)1 主要常规技术不能或很难解决的新疫苗(New generation vaccine)不能或难于培养的病原体；有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体。,2、传统疫苗的改造（(Reconstruction of traditional vaccine）主要针对免疫效果差，负反应大，成本较高和使用不方便的传统疫苗进行改造（如流感、乙脑等）。3、加强治疗性疫苗研究（Intensification of cure vaccine research)近年来，使用疫苗进行疾病治疗的研究发展迅速，对引起慢性或持续性感染或与诱发肿瘤十分相关的病毒病，治疗性疫苗的研究将具有重要性。,4、发展多价疫苗 多价疫苗成本低，免疫程序简单，是疫苗研究的发展方向。其发展方向为：使用基因工程技术对传统疫苗进行改造，获得联合疫苗；发展具有高导入、高表达、强免疫、可加强的新型载体。,二、目标的选择要以社会和市场需求为导向 1、研制预防我国严重病毒病的疫苗放在重点位置2、大力发展有市场前景新型疫苗,三、加强新型疫苗的基础研究 1、加强疾病免疫保护机制的研究（Intensify the research of immunity protection mechanism）(1)选取病原体的某些抗原或某些抗原表位，或删除某些无用甚至有害的组分而构成的，因而必须了解这些抗原、表位或组分在病原体致病和免疫中的作用和机体对它们的应答。,(2)一些发病和免疫机制比较简单的疾病已用常规疫苗解决了，留下的是一些比较复杂和较难解决的疾病或问题，例如呼吸道、肠道和生殖系统黏膜感染，其病原体常多型善变；易于产生持续感染基因整合的病毒；免疫病理机制不清的病毒；病原体结构复杂，发育阶段多，免疫保护作用不强；常规疫苗由于反应大，效果差或引起个别严重并发症，需用新型疫苗来代替。,2、加强新型疫苗的免疫保护机制的研究（Intensify the research of immunity protection mechanism of novel vaccine）新型疫苗抗原的免疫保护效果是新型疫苗研究的首要问题。活疫苗（包括基因工程活疫苗）最近似地模拟了感染后免疫，因而基因工程多肽疫苗和合成寡肽往往是用单一或少数几种保护性抗原，甚至单一个主要抗原表位代替完整的菌体或病毒颗粒。,产生的两个问题：第一，分子越小，其免疫原性越弱。因此多肽疫苗常需要用强有力的佐剂，以增强其免疫原性，合成寡肽则除了强佐剂以外，还要求偶联于一种载体蛋白上。第二，产生的免疫仅针对一种抗原，甚至一个抗原表位，在免疫的综合性方面就与感染后免疫相差甚远，其有效保护程度和时间还需通过实践加以检验。,基因工程疫苗类型和表达系统的选择对获得有效的免疫保护常用关键性意义。新型疫苗的作用方式对机体的免疫系统产生重要影响。任何疫苗的作用机体的方式都不会与病原自然作用方式完全相同，因此必然产生新的免疫特点。在载体疫苗，特别是核酸疫苗中，这个问题尤为明显。在甲型流感的自然感染中，不同亚型间的共同抗原核蛋白无中和活性，也不能产生亚型间交叉保护。,3、提高新型疫苗免疫效果(Enhance the immune effect of new vaccine)基因工程多肽或寡肽疫苗成败的关键是如何克服免疫原性弱、免疫综合性差的问题。,（1）多抗原表达（Multi-antigen expression)新型疫苗的一个趋向是应用二个以上抗原。第一类都是表面抗原（2种以上）；第二类是同时用表面与内部抗原诱生中和抗体；第三类是用表面抗原与非结构蛋白。,（2）颗粒性抗原(Granular antigen)在体外将多肽聚团化可形成100nm左右颗粒，如加入皂角糖苷（Quil A）可形成“免疫刺激复合物”（Immunostimulating complex，ISCOM）；将抗原包入脂质体内可形成免疫脂质体。,应用基因工程或化学交联方法将B细胞表位结合到HbsAg,核心Ag或轮状病毒核心表面，以增强免疫原性，特别是HbcAg具有T细胞依赖性和非依赖性免疫作用，是较为理想的颗粒型载体。有些病原结构基因的表达可产生不含核酸的病毒样颗粒，人类细小病毒B19株的壳蛋白可形成空心外壳；在痘苗中同时表达HIV的gag和env基因可形成类似病毒的颗粒。,（3）蛋白质工程抗原 多个寡肽串联成“鸡尾酒式疫苗”是首先针对恶性疟原虫而提出的，是将多个不同的B细胞表位和多个TH细胞表位串联起来，同时删除可能存在的抑制性T细胞（suppressor T cell，Ts）表位。另一个也属于蛋白质工程范畴，是将本来在细胞内表达的抗原加以改造，使之表达于细胞膜表面，以增强其免疫原性。此外，将RSV的两个表面抗原G和F组合成一个蛋白质的研究也相当深入，组合似不影响到它们各自的抗原特异性。,（4）载体疫苗系统(Vector vaccine system)基于病毒的载体活疫苗；基于质粒DNA的非病毒载体疫苗。前者方向是“非复制型”载体，需克服不安全性和不易加强使用的缺点；后者方向是改进导入效率、提高抗原表达、增强免疫反应强度、克服潜在的致癌及免疫病理作用。,其优点是：廉价、高效、易于组合成多价疫苗，是新型疫苗的重要组成部分。其缺点是：尽管用于载体研究的这些微生物都是疫苗株，但做为活疫苗载体，可能产生接种副反应。机体内针对载体的抗体，不论是免疫前存在的，或是免疫后产生的，都会对相应载体疫苗的再次使用产生一定影响，从而影响其免疫效果。,（5）免疫佐剂与联合免疫 强有力的合成佐剂大都是胞壁二肽的衍化物，如Syntex佐剂对多肽和寡肽都有很强的佐剂作用，能诱生抗体和细胞介导免疫，甚至超过了福氏完全佐剂，且无热源性，不引起肉芽肿、关节炎或其他组织损害。在用HCG-的37肽作为避孕疫苗进行人体实验时使用了这类佐剂。淋巴因子如胸腺肽、白细胞介素-2、-干扰素等均曾用于免疫增强目的。IL-2似乎只对某些抗原有佐剂作用，且须每天注射。,缓慢释放抗原的微胶囊（microsphere），虽不是佐剂，却能增强免疫效果。例如丙交酯与乙交酯共聚物，颗粒可达至3mm，小至1m。Al（OH）3依然独占鳌头。佐剂不但是亚单位疫苗成功的关键，而且还可通过选择不同的佐剂改变疫苗免疫反应类型，增加疫苗用途，提高新的免疫接种途径。不同类型疫苗联合应用，以达互补效果，是近年一些难度较大疫苗研制的新途径。,