细胞死亡与心衰及中医药干预.ppt
心肌细胞死亡与心力衰竭发病及中医药干预,心肌兴奋收缩耦联障碍,心肌收缩相关蛋白破坏,心肌能量代谢紊乱,钙离子复位延缓,肌球肌动蛋白复合体解离障碍,心肌顺应性降低,心室舒张势能减弱,心律失常,心肌收缩性减弱,心肌舒张功能异常,心肌各部位舒缩活动不协调性,心力衰竭,心力衰竭的发生机制,心肌不平衡生长,一、心肌细胞死亡的形式（一）凋亡（apoptosis）（二）自噬（autophagy）（三）胀亡（oncosis）二、心肌细胞不同死亡形式与心衰的关系的研究进展（一）心肌细胞凋亡与心力衰竭（二）心肌细胞自噬与心力衰竭（三）心肌细胞胀亡与心力衰竭三、防治心肌细胞死亡在心衰防治中的作用与前景（一）干预细胞死亡在防治心力衰竭中的研究进展（二）单味中药抗心肌细胞死亡研究进展（三）中药复方合剂抗心肌细胞死亡研究进展,一、心肌细胞死亡的形式,（一）凋亡（apoptosis）（二）自噬（autophagy）（三）胀亡（oncosis）程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）,（一）凋亡,主动死亡 受基因控制形态特征:染色质固缩、边集；胞质浓缩；凋亡小体；细胞器保存完好生化表现：DNA电泳呈现特征性的“梯”状条带,凋亡小体,（a,c）:正常胸腺细胞；(b,d)凋亡胸腺细胞（注意凋亡小体）,电镜图,Hoechst染色-核碎裂,左图：正常Hela细胞,细胞核蓝染右图：凋亡的Hela细胞，核碎裂(细小不规则颗粒状),DNA电泳呈现特征性的“梯”状条带,（二）自噬,双层膜结构 自噬前体 自噬体 自噬溶酶体 降解双层膜：来源不明。粗面内质网？高尔基体？作用：自噬程度总是保持在一个稳定的水平 适度增强：利于细胞蛋白质回收和消除受损细胞器。过度增强：可能造成过度的自我消化，最终使细胞死亡。,自噬的三种类型,自噬前体,巨自噬的过程,自噬的分子机制,自噬的检测,透射电镜自噬泡,Western blot-LC3,免疫荧光 GFP-LC3,单丹磺酰尸胺(MDC)染色,（三）胀亡（oncosis）,1995年 Majno 首次提出胀亡的概念Oncosis 源于希腊文onkos 意为肿胀表现 细胞肿胀 胞浆空泡化 最终细胞和细胞核溶解 细胞内容物外溢 局部炎症反应,Typical appearance of different types of cell death.A,C,and E,Confocal micrographs:counterstaining for actin,red;nuclei,blue;specific fluorescence,green.B,D,and F,Electronmicroscopic pictures(all bars2 m).A and B,Apoptotic cell death.A,Nuclei with DNA fragmentation are green.B,Nuclei show condensed chromatin.C and D,Oncotic cell death.C,Single cell oncosis labeled with C9.D,Nuclei are electronlucentwith clumped chromatin,mitochondria are damaged with flocculent densities.E and F,Autophagic cell death.E,Ubiquitin deposition and loss of nuclei.F,Ultrastructural appearance with numerous autophagic vacuoles.,自噬细胞,凋亡细胞,胀亡细胞,正常细胞,二、心肌细胞不同死亡形式与 心衰关系的研究进展,（一）心肌细胞凋亡与心力衰竭,研究者：Olivetti等病例：难治性心衰36例（心脏移植术后及AMI死后心脏标本），正常对照3例方法：组化、生化法检测心肌细胞凋亡率；Western Blot检测Bax和Bcl-2表达结果：心衰组细胞凋亡率是对照组的232倍，Bcl-2是对照组的1.8倍，Bax未见显著差异,研究者：Yamamura等病例：糖尿病心肌病（DCM）16例（心内膜活检标本），正常对照 3例方法：TUNEL法检测心肌细胞凋亡率；组化检测Fas表达结果：Anti-Fas-Ab：DCM组显著升高(P0.05)TUNEL(+)细胞数：DCM组显著升高(P0.05)且左室收缩功能严重紊乱者显著高于轻微损伤者,Li A等报道，自发性高血压大鼠在向心力衰竭转变过程中，细胞凋亡的数目较非心力衰竭的自发性高血压大鼠高4倍，而较对照组的WKY鼠高17倍。,早期出现心力衰竭的临床症状与细胞凋亡的程度呈正相关。心力衰竭自然历程的各个阶段均可发现有细胞凋亡,Leri A等在快速心室起搏造成的犬心力衰竭模型中发现，心力衰竭组较对照组p53蛋白表达增强4.8倍，p53与Bax启动子的结合活性升高；,（二）心肌细胞自噬与心力衰竭,自噬参与心力衰竭的发病,Autophagic vacuole in electronograph of model group（15000）,Control group ADR group 3MA group,肌纤维结构模糊，电子密度增大；线粒体明显肿胀，内外膜模糊，嵴紊乱，崩解，散开游离于心肌间质内；可见早、晚期的自噬体。,Effect of 3MA on Perim/area of myocardial mitochondrion,Effect of 3MA on Density of myocardial mitochondrion,Counting of autophagic vacules,*,*#,自噬可能损伤心肌细胞,我们的研究工作证明：心肌细胞自噬参与了高血压和阿霉素性心力衰竭的发病自噬的特异性抑制剂3MA可有效防治大鼠高血压和阿霉素性心力衰竭。,Hongxin Z等用主动脉缩窄法建立心力衰竭的模型心衰组中可检测到心肌细胞自噬的程度增加,（三）心肌细胞胀亡与心力衰竭,Kostin S 等对特发性扩张型心肌病19例和7例正常对照者的心脏进行了分析，结果发现在人类衰竭的心脏中心肌细胞的凋亡、胀亡和自噬的程度大致相当。胀亡在心肌病者和正常对照组的发生率分别为0.06%和0.001，两组间有统计学差异。Arbustini E 观察到心肌细胞的胀亡有特定的形态学特征，它可以与细胞凋亡、自噬在同一时间共存于同一心脏，而这些细胞死亡方式可发生在缺血性和非缺血性心脏衰竭。,心肌细胞的胀亡在心力衰竭的过程中参与了心肌细胞进行性减少的过程。它与凋亡和自噬等心肌细胞死亡形式一并发生。,细胞凋亡还是胀亡，取决于细胞内有无一定量ATP的存在，能量不能满足，凋亡无法完成其程序时，细胞转向发生坏死样改变，影响到胞内ATP 水平的因素因而影响到细胞死亡方式的选择。在ATP 不足的情况下予以补充细胞ATP 后，细胞可转为凋亡形式的死亡。,细胞ATP缺乏,细胞ATP足量,细胞胀亡,细胞凋亡,细胞凋亡,补充ATP,细胞自噬,心肌细胞消亡-数量减少-收缩力下降,心力衰竭,凋亡,自噬,胀亡,三、挽救濒死心肌、防治心肌细胞死亡在心衰防治中的作用与前景,（一）干预细胞死亡在防治心力衰竭中的研究进展,我们的研究发现：ghrelin可以通过抑制心肌细胞凋亡，改善阿霉素性心衰大鼠的心功能我们的研究发现：自噬抑制剂3MA可以通过抑制心肌细胞自噬，明显改善高血压性和阿霉素性心衰大鼠的心功能,Zhiwei Xu;Shiqing Lin;Wu weikang;et al.Toxicology.2008;21:247(2-3):133-138.Lihe Lu,Weikang Wu,Jianyun Yan et al.International Journal of Cardiology 2008：7：,Autophagic vacuole in electronograph of model group（15000）,Control group ADR group 3MA group,Effect of 3MA on Perim/area of myocardial mitochondrion,Effect of 3MA on Density of myocardial mitochondrion,（二）单味中药抗心肌细胞凋亡研究进展,葛根素：再灌注时加入葛根素抑制缺血损伤过程中Fas 蛋白的表达，从而抑制大鼠心肌细胞凋亡；且在兔缺血模型中上调Bcl-2 蛋白而减少心肌细胞凋亡西洋参总皂苷：通过下调Fas蛋白表达，上调Bcl-2 蛋白表达，明显抑制急性心肌梗死后大鼠心肌细胞凋亡当归：通过上调凋亡抑制基因Bcl-2 和下调凋亡加速基因Bax 的表达减少大鼠心梗灶边缘区心肌细胞的坏死，改善左室功能，减轻心室重构,（三）中药复方合剂抗心肌细胞凋亡研究进展,活血注射液（丹参、川芎等）以及心衰颗粒（附子、桂枝、人参、丹参、葶苈子等）：下调Bax 蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达抑制急性心梗模型大鼠心肌细胞凋亡心脑舒通胶囊（蒺藜、总皂苷粉等）：调控高脂血症大鼠心梗后凋亡基因的表达而抑制心肌细胞凋亡冠心康胶囊：能明显下调p53 基因的蛋白表达，上调Bcl 2 基因的蛋白表达，对心肌细胞凋亡的发生起到明显的抑制和阻断作用四逆汤及附子多糖：我们正研究四逆汤对阿霉素性 心衰大鼠心肌细胞凋亡、自噬和胀亡的抑制作用。,保护线粒体,ATP合酶合成增加,减少糖元消耗,心肌供血增加,降低无氧酵解强度,改善心肌能量代谢心肌ATP含量,四逆汤抗心力衰竭机制,抗心力衰竭,86Rb示踪技术 SD 心肌NBF Langendorff 心脏灌流技术 SD 冠脉流量,RT-PCR SD 心肌、冠脉cNOS基因的表达 NO释放冠脉扩张改善心肌供血,心肌缺血缺氧ATP减少心肌收缩力减弱，舒张功能异常，心泵功能下降.HPLCEM,四逆汤对缺（氧）血心肌ATP含量和线粒体的影响,四逆汤可通过改善心肌能量代谢来增强心泵功能,例如：在缺血/再灌注损伤中有大量氧自由基（O2-，OH。）生成，在此过程中，电子在更微观的世界里的运动、分布凭借人们肉眼是无法直接查觉的，如果利用电子自旋共振技术（ESR），就可以清晰地分辨出自由基的种类、数量。ESR 羟自由基 超氧阴离子自由基 单线态氧,Cu-Zn SOD 基因扩增产物电泳图,Mn SOD 基因扩增产物电泳图,线粒体膜电位的检测结果,Control,线粒体膜电位的检测结果,SND 0.5h SND 2h SND8h,线粒体膜电位的检测结果,H2O2 0.5h H2O2 2h H2O2 8h,线粒体膜电位的检测结果,*p 0.05,vs control group;*p0.01 vs control；#p0.01 vs H2O2 treatment group,表达谱芯片双色荧光扫描A：缺血组（Cy5）/对照组（Cy3）B：四逆汤组（Cy5）/缺血组（Cy3）红色表达高表达：绿色表示低表达,黄色表示表达水平无改变。,A,B,基因芯片测试结果初步显示：,1.心肌缺血后下调基因主要是与能量代谢有关的酶或辅酶 CoQ、ATP合成酶、丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、琥珀酰辅酶合成酶等。2.四逆汤处理后表达下调的基因多与细胞损害有关 cell death activator CIDE-A 表达上调的基因多与抗氧化损伤和促进能量合成有关 glutathione transferase(GT)glutathione Stransrerase(GST-)ATPase-like vacuolar proton channel,心肌总蛋白2-DE图谱,心肌缺血后模型组及四逆汤组蛋白表达情况,1.与心肌细胞收缩功能相关蛋白 ssp1404 Alpha-actin-肌动蛋白 ssp1201 Myosin light chain 1 肌球蛋白轻链-1,2.与心肌细胞能量代谢相关蛋白 ssp2102 Heart fatty acid-binding protein 心脏脂肪酸结合蛋白 Ssp3301 Fructose-bisphosphate aldolase C 二果糖磷酸醛缩酶C Ssp7413 Malate dehydrogenase,mitochondrial precursor 苹果酸脱氢酶 Ssp1304 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 3-磷酸甘油醛脱氢酶 ssp5609 ATP synthase alpha chain ATP合酶链,A,B,D,C,心肌细胞凋亡率分析A：ControlB:ModelC：SNDD：EGB,#,#,#,保护线粒体,ATP合酶合成增加,减少糖元消耗,心肌供血增加,降低无氧酵解强度,改善心肌能量代谢心肌ATP含量,四逆汤抗心力衰竭机制,心肌收缩力增强,心肌凋亡-自噬-胀亡减少,OUTPUT 增加心衰状态改善,致谢！1.中国国家自然科学基金委员会2.美国密西根大学 Dr.Jeffrey Halter Dr.Weizhen Zhang3.澳大利亚悉尼大学 Dr.Daniel Sze MSc MMedSc MEd PhD CFIAC FIBMS,
