细胞工程第7章干细胞与组织工程.ppt
（6）OCT基因活性鉴定,OCT基因:ES细胞中特异性表达，常作为标志基因。利用OCT抗血清和间接免疫荧光法可检测ES细胞。也可作为鉴定ES细胞分化与否的依据。此外，ES细胞发育全能性的标志：ES细胞表面表达时相专一性胚胎抗原（Stage specific embryonicant，SSEA），,4、胚胎干细胞的保持,1常规保持：即通过不断更换培养液，以传代培养方式维持ES的快速繁殖和抑制分化状态。2冷冻保持：通过超低温冷冻保存，使细胞的代谢活动完全停止，而长期保存,总结：胚胎干细胞的建系过程,分离囊胚的内细胞群或分离胚胎生殖脊细胞与饲养层细胞共培养，细胞非分化增殖胚胎干细胞的鉴定与保存定向诱导分化前体细胞功能细胞,（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）将ES细胞与特定的细胞共培养（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内,干细胞诱导分化的常用方法,7.1.6 ES细胞的应用前景及面临的难题,1、ES细胞的应用前景研究哺乳动物个体发生发育规律研究细胞分化研究基因功能生产转基因动物疾病治疗与治疗性克隆研究细胞癌变机理及新药物的筛选制备嵌合体动物,治疗性克隆,嵌合体动物chimera animal,将A动物的胚胎干细胞嵌入B动物的胚胎中创立嵌合体动物，获得移植用机体器官。嵌合体意义：可解决哺乳动物远缘杂交的困难，应用于动物育种。嵌合体动物对发育生物学和遗传学等的研究有重要作用。,2.ES细胞研究面临的难题,（1）.增殖与分化的矛盾（2）.潜在致癌机制（3）.器官形成困难重重（4）.伦理冲突,（1）.ES细胞存在增殖与分化的矛盾,筛选适宜的培养基，平衡体外培养下ES细胞的快速增殖和分化之间的矛盾，筛选ES细胞系的最佳创建条件。,（2）.ES细胞的潜在致癌机制,ES细胞高度未分化，具有形成脐胎瘤的可能，因此必须设计自杀基因，使得ES细胞在治疗过程中万一向肿瘤方向分化时，启动自杀程序，使ES细胞凋亡。,（3）ES细胞用于器官克隆与移植存在的困难,A.多胚层器官的形成过程复杂；B.离体器官的体外保存与功能维持困难。,人胚胎干细胞研究伦理指导原则,第四条禁止进行生殖性克隆人的任何研究。第六条进行人胚胎干细胞研究，必须遵守以下行为规范：（三）不得将人的生殖细胞与其他物种的生殖细胞结合。第七条禁止买卖人类配子、受精卵、胚胎或胎儿组织。,如何解决伦理矛盾,不破坏胚胎的情况下获取胚胎干细胞成体干细胞横向分化睾丸细胞：胚胎干细胞的新来源iPS,体细胞诱导多能干细胞,2007年11月20日，美国威斯康星大学詹姆斯汤姆森的研究小组在科学杂志发表体细胞转变成“诱导性多能干细胞”（iPS细胞）的成果，而日本京都大学教授山中伸弥领导的研究小组也于同日在细胞杂志发表类似的研究结果。ips细胞的诞生仿佛给沉寂一时的国际干细胞研究打入了一剂强心剂。,Junying YU,James A.Thomson.Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells.Science,2007,318(5858):1917-1920,诱导性多能干细胞iPS cells,iPS cells是被重新编程从而进入一个类似胚胎干细胞状态的体细胞。“PS细胞”具有和胚胎干细胞类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，因此在医疗领域的应用前景非常广阔。世界第一只体细胞克隆动物多利羊的培育者、英国苏格兰爱丁堡大学教授伊恩威尔莫特宣布放弃人类胚胎干细胞克隆研究，转而进行“细胞”研究，他认为这种细胞比胚胎干细胞更具潜在优势。,1 自我更新的机理，定向分化的机理2 胚胎干细胞建系（尤为人胚胎干细胞）3 治疗性克隆4 胚胎干细胞定向发育成三维器官5 胚胎干细胞移植的安全性问题,胚胎干细胞的重点研究方向,7.2 成体干细胞,1.成体干细胞是指存在于已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成该类型组织的细胞。2.成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。,成体干细胞横向分化,3.成体干细胞的优点分析,获取相对容易 源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在组织相容性的问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制剂 理论上，成体干细胞致瘤风险很低，而且所受伦理学争议较少 成体干细胞还具有多向分化潜能,4.造血干细胞,(1).造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）是指骨髓中的干细胞，具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分化成各种其他细胞。(2).造血干细胞有两个重要特征：其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分化成所有类型的血细胞。,(3).造血干细胞移植的作用,造血干细胞移植是现代生命科学的重大突破。造血干细胞移植可治疗恶性血液病，部分恶性肿瘤，部分遗传性疾病等 75 种致死性疾病。包括急性白血病、慢性白血病、骨髓增生异常综合征、造血干细胞疾病、骨髓增殖性疾病、淋巴增殖性疾病、巨噬细胞疾病、遗传性代谢性疾病、组织细胞疾病、遗传性红细胞疾病、遗传性免疫系统疾病、遗传性血小板疾病、浆细胞疾病、地中海贫血、非血液系统恶性肿瘤、急性放射病等。,(4).造血干细胞移植类型,造血干细胞移植包括骨髓移植（BMT），胎肝造血细胞移植，外周血干细胞（PBSC）移植及脐带血造血细胞移植。,5.神经干细胞,（1）神经干细胞(neuralstemcell，NSCs)是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。,（2）神经干细胞特点,自我更新：神经干细胞具有对称分裂及不对称分裂两种分裂方式，从而保持干细胞库稳定。多向分化潜能：神经干细胞可以向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。低免疫源性：神经干细胞是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，不被免疫系统识别。组织融合性好：可以与宿主的神经组织良好融合，并在宿主体内长期存活。,（3）神经干细胞的应用：,神经干细胞在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用。神经干细胞移植是修复和代替受损脑组织的有效方法，能重建部分环路和功能。神经干细胞可作为基因载体，用于颅内肿瘤和其它神经疾病的基因治疗。神经干细胞对于判断药效及药物毒性等也有一定实用价值。,（4）神经干细胞应用中存在的问题：,建立的神经干细胞系绝大多数来源于鼠，而鼠与人之间存在着明显的种属差异；神经干细胞的来源不足；部分移植的神经干细胞发展成脑瘤；神经干细胞转染范围的非选择性表达；存在着社会学及伦理学方面的问题等。,6.胰岛干细胞,（1）胰岛干细胞一般是指未达终末分化状态，能分化增殖为胰岛组织（胰岛B细胞），或起源于胰腺，具有自我更新复制能力的细胞。,（2）胰岛干细胞的来源,胚胎干细胞向胰岛干细胞的分化；成体干细胞向胰岛干细胞的分化，如肝脏干细胞等也可在一定条件下转化为胰岛素分泌细胞。,（3）胰岛干细胞的应用,将糖尿病患者的体细胞核取出，放入一捐献的去核卵细胞中，胚细胞进一步发育后从中取出胚胎干细胞，经诱导分化为胰岛细胞再植入患者体内。这一方法的最大优点为可以避免移植免疫排斥。也可以从糖尿病病人的胰腺、肝脏或骨髓等部位活检分离出干细胞，在体外诱导分化为胰岛干细胞后再移植入患者体内，此也可以避免移植免疫排斥问题。,胰岛B细胞,胰岛B细胞是胰岛细胞的一种，属内分泌细胞，能分泌胰岛素，起调节血糖含量的作用。胰岛B细胞功能受损，胰岛素分泌绝对或相对不足，从而引发糖尿病。,7.皮肤干细胞,(1)存在于表皮基底层和毛囊基部的干细胞。(2)皮肤有极强的修复和再生能力，这与皮肤干细胞的存在具有直接的关系。研究较多的主要有表皮干细胞(Epidermal stem cells)和 毛囊干细胞(foliar stem cells)。(3)皮肤干细胞最显著的生物学特性是慢周期性(slow cycling)、自我更新能力以及对基底膜的粘附性。,(4)皮肤干细胞的临床应用,主要表现在几个方面:在细胞替代治疗中的应用。当皮肤受到外伤、疾病等的损伤时，位于皮肤表皮基底层和毛囊隆突的皮肤干细胞就会在内外源因素的调控下，及时增殖分化生成相关细胞，以修复机体受损表皮、毛囊等结构。,在组织工程中的应用。人工真皮是利用组织工程技术形成商品化用于临床的真皮替代物，它可诱发正常的皮肤愈合过程，已用于治疗大面积烧伤病人的暂时性皮肤覆盖及慢性皮肤溃疡的治疗。,在基因治疗中的应用。将表皮干细胞作为皮肤遗传性疾病等基因治疗的靶细胞已成为可能。将外源基因通过逆转录病毒导入表皮干细胞并植入体内后，机体可长期维持转导基因的表达，这就为表皮干细胞应用于基因治疗提供了可靠的依据。,7.3 组织工程,(1)应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理和技术，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的一门科学。(2)组织工程的核心：由种子细胞和生物活性材料构成的三维空间复合体。(3)组织工程的关键：通过模拟体内环境，使种子细胞（干细胞）正常生长和分化。,(4)组织工程的步骤,大量扩增种子干细胞；设计并使用聚合物骨架，种植种子细胞，诱导细胞分化；采用灌注培养系统，使得工程组织保持长期分化。,（5）组织工程应用,组织工程化皮肤组织工程化骨骼组织工程化血管组织工程化管状器官（食道，气管，肠道，尿道、肾脏）组织工程化腺体器官（肝脏，胰脏，甲状腺）,科学家首次利用人体干细胞培育出颚骨,（6）组织工程的意义,在体外构建有生物活性的种植体，植入体内修复组织缺损，替代器官功能；或作为体外装置，暂时替代器官功能，达到提高生存质量，延长生命活动的目的。提出了复制“组织”、“器官”的新思想，标志着“生物科技人体时代”的到来，是“再生医学的新时代”，是“一场深远的医学革命”。,干细胞类型小结,ES:embryonic stem cell胚胎干细胞；EG:embryonic germ cell胚胎生殖细胞；EC:embryonic carcinoma cell胚胎癌细胞；HSC:hematopoietic stem cell，造血干细胞；NSC:neural stem cell，神经干细胞；ESC:epidexmis stem cell，表皮干细胞；ASC:adult stem cell，成体干细胞；TSC:totipotent stem cell，全能干细胞；MSC:multitotipotent stem cell，多能干细胞；CSC：committed stem cell，定向（专能）干细胞；,
