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,肿瘤的分子诊断Molecular Diagnosis of Tumor,Whats molecular diagnosis tumor?,病理切片和影像扫描,肿瘤的分子诊断Molecular Diagnosis of Tumor,一、肿瘤的分子诊断的目的与意义Purpose&Meaning of Molecular Diagnosis of Tumor,患家族性腺瘤性息肉瘤发现APC基因。,乳腺癌、卵巢癌的BRCA1、2、3，70基因等。,反向遗传学（reverse genetics）由基因的遗传连锁图分析，找到致病基因在特定染色体上的准确位置。,经典遗传学（classical genetics）由疾病的表型改变去追溯有无肿瘤易感基因存在。,2早期诊断（Early-stage diagnosis of tumor）,寻找肿瘤的早期诊断的分子靶点。,主要肿瘤的常用的多标志组合恶性肿瘤 主要标志 其他标志前列腺癌 PSA fPSA，PAP，ALP，CEA，TPS乳腺癌 CA153 CEA，CA549，CA72-4，hCG，LASA，erb-B2子宫颈癌 SCC CA125，CEA，TPA直结肠癌 CEA CA19-9，CA724，NSE胃癌 CA724 CA199，CA50，CEA，铁蛋白，SA，CA242原发性肝癌 AFP GT，ALP，TPS，GST肺癌 NSE ACTH,降钙素，CA724，CEA，铁蛋白，LASA淋巴瘤-2M Ki67,LASA,LD2黑色素瘤 黑色素瘤抗原 NSE，LASA，血儿茶酚胺，L多巴脑胶质瘤 VMA HVA，NSE，铁蛋白，甲基卟啉卵巢癌 CA125 CA19-9，CEA，TPS，AFP，LD，hCG，胰腺癌 CA199 CA242，CA50，CA724，CEA，ALP膀胱癌 无 CEA，TPA,3肿瘤分类（Classification of tumor）,WHO提出在传统病理学分型、分类的基础上，进行分子水平的分型。启动了肿瘤分子学分型工程，用分子生物学的检测技术对肿瘤进行分类、分型。能更准确地提供诊断、鉴别诊断和预后判断。,染色体的t（15：17）易位的检测，区分M3型白血病；Bcr-Abl基因检测，可确诊CML型白血病。,4预后监测（Prognostic inspect of tumor）,对血液、痰液、尿液等进行监测，可较早判断肿瘤的复发和转移。,（一）过表达或低表达（Over expressivity of gene）肿瘤细胞内癌基因过表达和抑癌基因低表达或突变后过表达。,二、肿瘤的分子诊断依据,转录水平检测 多拷贝基因使其转录增多，表现出mRNA过表达或突变体。,1点突变（Point mutation）人类大部分的肿瘤几乎都存在相关基因的点突变。,【For Example】肺癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、胆囊癌、胰腺癌等存在H-Ras、K-Ras、N-Ras的12、13、61编码子的已知 点突变,3基因易位或重排 易位或重排使目的基因与它的调控基因出现位置上分离，导致目的基因表达异常，使细胞恶变。【For Example】B淋巴瘤：由于其Bcl-1断裂点发生t(11:14)(q13:q32)易位，Cyclin D1基因受到IgH启动子控制（IgH位于14号染色体），导致Cyclin D1基因的过表达，导致细胞癌变,对基因易位或重排检测将有助于肿瘤的诊断和生物学分型。,3.异常甲基化检测意义 检测异常甲基化的启动子作为肿瘤标志物。,2.异常甲基化导致基因表达失常的机制 低甲基化可使受抑制的癌基因过表达，增加了整个基因组的 不稳定性；过甲基化可使抑癌基因的表达失活和蛋白质表达丧失。（类似于突变所造成的基因功能丧失）甲基化的CpG位点是突变热点和易发点（Mutant hot spots）（5-甲基胞嘧啶的嘧啶环4位脱氨基转变成胸腺嘧啶）,四、肿瘤的分子诊断技术 Detection methods involved in the MDT,1.基因的检测技术 基因点突变检测（Gene point mutation）基因缺失、易位检测（Gene loses&translocation）基因过表达检测（Over expressivity of gene）,（一）传统检测方法（Method of traditional detection）,（1）基因点突变检测（Gene point mutation）已知有义点突变检测，一直是肿瘤分子生物学检测的主要研究对象。等位基因特异性寡核苷酸分析（ASO）一种建立于基因杂交基础之上的已知点突变检测技术。,【ASO检测原理】,PCR-SSCP法（PCR-单链构型多态性检测）利用基因突变后，其单链DNA的二级结构发生改变，这样在非变性 聚丙酰胺凝胶（56%）电泳时会出现迁移率改变。,荧光共振能量转移探针结合融合曲线分析（Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET）检测探针与靶DNA杂交后，根据杂交结合物的解链温度（Tm）的差异进行基因点突变的实时监测。并结合荧光融合曲线分析，提高点突变的检测分辨率。,50,52,DNA序列分析（DNA sequencing）利用双脱氧终止法进行碱基序列分析。肿瘤DNA的核苷酸序列测定后，再与正常DNA序列进行比较，以确定突变的类型和突变的位置。,染色体Giemsa染色分析 采集新鲜的肿瘤组织，经短期培养后用秋水仙素处理，使细胞停留在有丝分裂中期，收集细胞，制片后经10%Giemsa染色显带，进行G带分析。【染色体核型】单倍体、异倍体、缺失、重排、易位、倒位、插入等。,荧光原位杂交（Fiuorescence in situ hybridization,FISH）荧光素标记核苷酸制被探针，通过原位杂交检测目的靶DNA存在的一种分子检测技术。,【FISH最大的优点】可以检测染色体结构异常和靶基因定位。可用于新鲜组织，也可用于固定组织的石蜡包埋切片。能用于有丝分裂中期细胞和间期细胞检测。具有较强的特异性、稳定性和无污染。,Normal,N,N,N,D,H,N,H,D,1,W,2,W,36%粒,33%粒,18%粒,35%粒,12%粒,29%粒,Western blot,ELISA检测仪器,（三）组学检测技术【生物芯片技术（Technique of DNA chip）】生物芯片或微阵列技术是指在一小片（或微粒）固相载体上储存大量的生物信息，并形成高通量的检测技术。,（Wen用DNA芯片和DNA序列分析两种技术对108例卵巢癌p53基因突变进行检测，并比较两种技术的效率、敏感性，其中57例突变被两种方法同时检出，一致率为81%，另外14例被芯片检出，但有6例由测序检出）,2.蛋白质组检测技术【血清学检测】蛋白质组技术与血清学研究相结合，应用于肿瘤标志物的筛查和鉴定工作。,血清蛋白质组分析（SERPA）,血清全蛋白进行分析（血清蛋白质指纹模型）,【血清检测方法】,肿瘤组织蛋白 2-DE 组织蛋白质分离 免疫印迹 凝胶上蛋白质转印NC膜上 患者、健康人血清 显色,
