基因工程实验.docx

本实验课程以一个基因片段的获得,表达和纯化和活性分析为主线,抓住蛋白和核酸两大主眶,建立一个综合型和研究性的大实验教学体系,重视各项技术的衔接,启迪学生的科学思维和创新意识,提高学生对实验方法和实验技术的纱合运用能力课程设计的思路:一实验一、E.coli染色体DNA提取实验原理：溶菌能破壁蛋白酗K水解菌体核蛋白变性染色体DNA沉淀(氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的别离)实验步骤：1.收集菌体：Iml菌液/2人,5k,5，,弃上清。2.加0.5mlBufferA,振荡混匀。3.加50ll0%SDS至终浓度1%,混匀。4.加5lProK至终浓度0.1mgml,55-C保温lh。5.加等体积PCI.混匀,12k.5)6.加等体积氯仿,12k,5,7.加0.8V异丙醇,冰浴30',12k,5'。8.70%Eth洗涤沉淀，12k,5'。9.枯燥后溶于20lTE,-20C保存考前须知：TriS-饱和酚的使用防止剧烈振荡EP管的使用(酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚-氯仿混合时,蛋白分子之间的水分子就被酚-氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性.经过离心,变性蛋白的密度比水的密度大,因而与水相别离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开.而酚-氯仿有机溶剂比重更大,保存在最下层作为外表变性的酚与氯仿,在去除蛋白的作用中各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10-15%的水溶解在酚相中,因而损失了这局部水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA.所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好.经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白,此时一起将酚带走)实验二：紫外吸收检11)na的浓度与纯度安画原理：苯环结构AbSorT%光谱扫描定量测定(TU-1901双光束紫外可见分光光度计；DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在26Onm处,吸收低谷在230nm;在26Onm时,DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关,也随构型而有差异.对标准样品来说,浓度为lgml时,DNA钠盐的OD260=0.02,当OD260=1吐dsDNA浓度约为50gml,ssDNA浓度约为33gml,RNA浓度约为40gml,寡核昔酸浓度约为30gml(由于底物不同有差异)；紫外分光光度计只用于测定浓度大于O25gml的核酸溶液)DNA浓度的估算:dsDNA(gml)=50(OD260)倍数ssDNA(gml)=33(OD260)倍数泰山虫草的核基因组DNA紫外吸收扫描图RNA浓度的估算:RNA(gml)=40×(D260)X倍数酵母RNA(50gml)的扫描图谱核酸纯度的判断DNA:A260A280=l.8,>.8RNA:A260A280=2.0残留酚、蛋白凝胶电泳(假设为DNA样品,A260A280比值大于1.8,说明存在RNA,可以考虑用RNaseA处理;小于1.6,说明样品中存在蛋白质或酚,应再用酚-氯仿抽提,以乙醇沉淀纯化DNA.RNA样品A26O/A28O比值小于2,应考虑再用酚-氯仿抽提)实验步骤：TEbUffel稀释:50x、IoOX旋涡振荡,混匀,离心预热15minCK:400lTE,校零样品测试,A26O、A280实验四：目的DNA片段的回收实验原理：电荷效应分了筛效应硅胶膜吸附凝胶是支持电泳的介质,它具有分子筛效应.核酸是一种两性电解质,在pH8.0-8.3时带负电荷,电泳时向正极移动；而在pH3,5时带正电荷.凝胶Pl收试剂盒提纯DNA片段的原理：主要是通过吸附材料的DNA结合法来到达DNA别离、纯化的目的.吸附材料包括硅基质材料、阴离子交换树脂与磁珠等.其中硅基质材料在高盐低PH(PH<7.5)时高效、专一地吸附DNA或RNA,在低盐高PH(PH>7.8)条件下洗脱,可以回收IOobP以上的片段,效率达70%以上。在电场和介质中，不同长度或不同构型的DNA呈现不同的Rf,根据别离片段在凝胶中的位置并参考Marker确定其大小DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动.用电泳法测定DNA分子大小时，应尽量减少电荷效应凝胶回收kit提纯原理:MB打断H键;蛋白解离MW洗去剩余胶液及杂质EB洗脱吸附DNA目的基因的回收包括两个过程:首先是凝胶中的DNA吸附到柱子中的硅胶粒上,主要靠缓冲液调节吸附柱与DNA的pH,来促进DNA吸附到柱子上,离心后将胶液去掉;其次,将吸附到柱子上的DNA重新返溶解到洗脱缓冲液中,再通过离心收集到新的EP管中,到达纯化基因的日的.)膜结合液(溶胶buffer)中的高氯酸钠(NaQo4)又称过氯酸钠,能打断琼脂糖聚合物中糖基间的氢键,使琼脂糖胶块溶解,而且高盐浓度也使与DNA结合的蛋白解离卜来；膜漂洗液(MW)的主要作用是洗去剩余的琼脂糖溶液与杂质,MW除含有缓冲系统外,还有一定浓度的乙醇,用于洗去高盐等杂质,也易使含DNA的硅胶颗粒枯燥；洗脱缓冲液(EB)的作用是使吸附的DNA重新溶解到缓冲液中切胶回收DNA片段电泳图实验步骤：1 .PCR产物的凝胶电泳0.4gAga-40mlTAE,煮沸冷却至55"C,2lEtB您倒胶,插梳子,凝固30min加TAE,浸过胶面点样:2l上样液+样品;marke80V电泳,观察;2.切胶与溶胶称EP管,算胶重Img胶加llMBUV302nm下切胶(55"C水浴,隔2,摇匀)MB:膜结合液(membranebinding)实际上是一种溶胶缓冲液：3.DNA结合切胶一1.5mlEP管加MB,55C溶胶胶液一吸附柱一收集管120Oog,离心l'4.清洗与洗脱6lMWf吸附柱120Oog,离心30s重复;离心2,力口25lEB12000g,离心1，考前须知2 .平安性:EB,UV2.Aga彻底熔化3.垂直上拔梳子4.忌点样孔穿透5.尽量低电压6.长波切胶7.胶块尽量小8.凝胶全熔实验五：目的DNA片段与载体的连接实验原理：PCR产物3T载体3，实验步骤*5l连接反响体系反响体系PCR回收产物2.0lddI12O1.5lpMD18-T(E5J0.5l对照DNA0.5l2x连接液12.5l2.5l低速离心,16C连接Ih,用于转化(PCR产物与T载体连接前最好进行纯化,以减少引物及其它杂质对连接的影响：纯化方法可以采用PCR产物纯化试剂盒盖紧盖子用手指轻弹EP管或用微量进样器混匀反响液,于台式离心机转2秒钟,以集中样品)实验六：E.co/i感受态细胞的制备与转化实验原理：Ca2+:细胞膨胀,膜磷脂,液晶Ca2+与DNAf羟基-磷酸钙42热激：膜通透性(将处于对数生长期的细菌置入0的CaC12低渗溶液中,使细胞膨胀,同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构,使得位于外膜与内膜间隙中的局部核酸酶离开所在区域,这就构成了£.Coli人工诱导的感受态；此时参加DNA,Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶(DNaSe)的羟基-磷酸钙复合物,并粘附在细菌细胞膜的外外表上；经短暂的42C热脉冲处理后,细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,随之出现许多间隙,致使通透性增加,DNA分子便趁机进入细胞内)实验步骤：1.感受态制备：过夜菌,12%种量扩大振荡23h,OD600=0.4,预冷菌液Iml/组,3k,4C离心5',3ml预冷CaC12轻匀离心,0.1mlCaC12悬浮沉淀2.筛选平板的制备：LB固体M熔化,至60加Ap(lOOgml),倒平板,20ml/皿40lX-gal&4lIPTG/皿,涂布放置10min；3.重组质粒转化：5l连接液+50l感受态,轻匀,冰浴30,CK:50l感受态42水浴热激2,冰浴2加450lLB(摇匀),37C,1h离心5',llLB悬浮沉淀转化反响:No转化类型ddH2O受体菌CK+目的片段T-vol1c÷4.5ml50ml0.5ml055ml2CK-5.0ml50ml0055ml3转化组050ml05ml55ml4.铺平板：55lCK+、CK-、转化组涂布LB固体M(含0.1mgmlAP)平板放置10min37匕倒置,1624h观察结果实验七：碱变性质粒DNA的提取实验原理：细胞裂解质粒别离乙醇沉淀(溶菌酶是糖汁水解前,水解细菌细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的P-1,4糖昔键,因而具有溶菌的作用.当溶液PH小于8时,溶菌酶作用受到抑制；葡萄糖的作用在于增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力作用而降解;EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌能的反响要求有较低的离子强度的环境)实验步骤：(1)2ml菌液/组,4k,3,100lSol，振荡二室温5-(3)200lSolII,颠倒3次,冰浴5,(4)150lSolIII,同上(5)12k,离心8，,转上清等体积PCI,混匀,12k,又转上清(7)加Vbl3MNaAc(pH5.2),2×Volale(8)-2(TC放置3(/,12k,离心10,(9)0.3ml预冷70%Eth洗沉淀，12k,5,(10)枯燥后溶于20lTE,-2(C保存考前须知：摇菌时施加选择压收集菌体时尽最除尽水分加溶液Il5,后,是否变粘稠?SDS质最影响产率（加溶液II5min后,没有看到溶液变粘稠时,实验不能继续做下去.要检查所用试剂是否正确?数量是否符合；对SDS的要求较高,使用重结晶的分析纯SDS,质粒得率较高）实验八：重组质粒的酶切鉴定轰骏原通：8s/HI单切SghHI单切实验步骤：1.酶切反响步骤:ddH2O于EP管fIOxbuffeL质粒DNAf限制酶一混匀,离心5s-37°C,50,65C水浴10'（1）单酶切反响成分ddH2OIOXKBufTcrDNABamHXTotal需量(l)7.52100.5208mHI(15Ul)组/4人；30,50'(2)双酶切反响ECoRl&Pstl（15Ul）绚4人；37,C,50,3 .凝胶电泳检测d0.8%Aga,3OmlTAE,煮沸冷却至55°C,2lEtBr®倒胶,插梳子,凝固20,2l上样液+样品100V电泳,观察（配制0.8%琼脂糖凝胶（30ml）,加20lEB,酶切样品全部点样,另外取10l未酶切质粒作对照,100V电泳,待澳酚蓝移至胶的3/4位置结束电泳；-HindIIIdigestDNAmarker（50ngl）,由于cos末端之间的结合,会膨响23k和4.36k的条带,因此,电泳前热处理（60C,5min）,使Marker的电泳图像变得更为清晰）酶切失败的可能原因:不全切或根本未切缓冲体系不适宜酶量过多样品杂质含量高DNA被降解:痕量DNase（励切失败主要表现为两方面:（1）不完全防切甚至是DNA根本未发生前切；主要原因有：缓冲体系不适宜,可进行重新酶切；酶量参加过多而导致甘油抑制酶活,可将反响体系适当稀释：DNA样品杂质含量高,可采用稀释酶切或将DNA样品重新抽提后酶切;（2）DNA被降解（不成带状）：主要原因是DNA样品中含有痕量的DNAS,建议重新抽提除去DNA酶）考前须知：吸量要准确最后加酶冰上操作勿触管盖内面EP管盖严（吸样最一定要准确；为了不使酶污染而导致浪费,最后才加酶；要求在冰上操作,并充分混匀：开启EPPendOrf管时,手不要接触到管盖内面,以防污染；样品在37C与65C保温时,将离心管盖严,以防水进入管内造成实验失败）限制酶母解中常见的问题和原因:（I）DNA完全没有被限制前切割：限制前失活；DNA不纯,含有SDS、有机溶剂、EDTA等；限制酶非最正确反响条件；酶切位点被修饰；DNA上不存在该酶的识别顺序（2）DNA切割不完全：限制酶活性下降或稀释不正确；DNA不纯或反响条件不佳；酶切位点被修饰；局部DNA溶液粘在管壁上：防切后DNA黏端退火（3）DNA片段数目多于理论值:基因工程的常规技术别离检测分子杂交PCR 作核酸的别离与检测：gDNA I）破碎2）去蛋白DNA沉 DNA提取的三大步骤:细胞 胞裂解，参加缓冲液螯合金属 醇等抗氧化剂及PVP（聚乙烯限制前星号活力；存在第二种限制酶污染；样品DNA中含有其它DNA技术DNA测序基因定点突变溜DNA与Pr互的别离质粒DNARNA的别离gDNA的提取:淀破碎、去除蛋白、去除RNA.（液氮研磨材料,使细离子，以降低DNase对样品的水解；参加P-筑基乙毗咯烷酮）可降低酚类物质对DNA的干扰，PVP还可有效去除多糖）gDNA提取方法：浓盐法SDS法CTAB法高盐：溶解；低盐：沉淀：蛋白、多糖别离：NaAc-70%ale特点：去除糖类杂质；获得高质量的DNA保持CS-DNA的完整性:物理降解内源DNaSe>pH7DNA相对分子质量较大，机械张力或高温容易使其断裂，因此，应防止剧烈振荡和使用小口径枪头，去除尖端局部，使其口径有5mm;过酸条件,发生脱嗓吟作用，造成断裂质粒DNA的别离纯化:拓扑学的差异gDNA大，易解旋质粒小,ccc状态CSe-EB密面梯度离心:纯度高、周期长、设备要求、EB污染；碱变性：纯度较高、操作周期较短；沸水浴：纯度低、快速、操作简便质粒DNA别离的原理:gDNA大，断裂成线性分子，易解旋；质粒MW小（0.012%）,在抽提中仍保持CCC状态1 .CSCI密度梯度超离心:含EDTA的buffer悬浮菌体，加溶菌酶,CsCl和EB,超离心ON,收集CCCDNA,稀释沉淀质粒结构致密，结合的EB少，密度大;gDNA结合大量EB.密度小.离心，酚去蛋白，异戊醇萃取除EB,2×Eth沉淀2 .碱变性法：pH12:gDNA变性彻底，cccDNA结构紧密，H键断裂,两互补Si仍紧密结合；pH7:cccDNA复性快,gDNA复性慢，易聚集形成网状结构，离心后与变性蛋白及RNA沉淀,cccDNA滞留上清；SoII:50mM葡萄糖(增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力而降解)；25mMTris-HCl.10mMEDTA(螯合金属离子；溶菌酶要求低离子强度);SolII(现用现配,NaOH易潮解,与空气中的CO2形成碳酸钠):0.2MNaOH,1%SDS,去膜释放内含物;SolIII:3MNaAc(pH4.8),去gDNA及蛋白；酚-氯仿萃取,Eth沉淀；RNase水解3 .沸水浴法：加酶破壁沸水浴40s离心Eth沉淀RNA的提取:提取的原理：细胞破碎、蛋白变性、乙醇沉淀.细胞破碎；异硫鼠酸服(蛋白质强变性剂)处理，使蛋白变性或降解；酸性水饱和酚(pH5.0)/氯仿抽提；乙醇沉淀利用Poly（八）与其他RNA分开防止R、A降解的措施：DEPC处理RNaSin专用无菌台器皿、手套、口罩低温操作核酸质量检测：紫外光谱法凝胶电泳法荧光分析法DNA的定量及纯度测定:紫外光谱分析法；琼脂糖凝胶电泳法；荧光染料(HoeChSt)测定法；二苯胺显色法荧光UoreSCenCe)分光光度法:用于定量分析激素、维生素、核酸和氨基酸等生物体内的微量物质.紫外光谱法：fssDNAl=33×(A260-A310)X稀择dsDNA=50×(A260-A310)X稀释ssRNA=40(A260-A310)X稀释凝胶电泳技术：别离原理：分子筛:Rf-大小及构型电荷效应：检测原理:UVfEBf荧光;；Rf、分辨力的影响因素：大小，构型gel浓度电压、时间buffer凝胶浓度的影响：低浓度胶：分子量大一清楚，分子量小smear;高浓度胶：小狭带，大一不清缓冲液及其pH；TBE:缓冲力大长：TAE>TBE短:TAE分辨力低RNA的检测:A260变性胶28S-45kb18S-2.1kbPAGE尿素buffer:0.5lXTBE.同位素或荧光标记:测序、多态性分析分子杂交技术:SOUthernblotNorthernblotWeSternblot(4)dotblotFlSH菌落原位杂交探针与探针标记:寡核件酸片段SSords足够长度不含互补区1.探针的标记：5 4G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3,3 4C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A-5'4 DNaSeI5'G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T-3'3'C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5,DNApoIIMg2+15,dNTP5,ppdA(-52P-dATP5'G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3'3'C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5,使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程，同位素或非同位素.化学合成；CDNA合成；mRNA;PCR扩增标记.探针标记的方法：缺口平移、随机引物、5,末端标记.2.标记物及其检测：8放射性标记力I匚放射性标记物及性质标记方法杂交体检测法地高辛:DIGRPL酶标抗体-底物显色生物素：Bio-16-dUTPNT,TL,PCR梅标亲合素显色荧光素：罗丹明,FITC合成法荧光显微镜RPL:随机引物标记.FlTC:异硫系酸荧光素，通过荧光显微镜或免疫组织化学检测生物素标记:生物素又称维生素H,也是一种小分子的半抗原，存在于蛋黄中.抗生物素蛋白(avidin),又称亲含素，一种精蛋白荧光素标记:荧光素是一类在激发光作用下发射出荧光的物质，通过荧光显微镜或免疫组织化学检测SoUthem杂交:质粒鉴定、基因位置、分子诊断Southern:DNA的分子鉴定.酶切和电泳法:重组克隆的初步鉴定NOrthern杂交：样品,电泳.探针不宜减变性勿低盐buffer洗膜胶中无EBWeStern杂交:电泳，印迹，免疫学。步骤：SDS-PAGE,blot杂交(AP或HRP)电泳:SDS-PAGE;探针：抗体；抗体与靶蛋白特异性反响.FlSH杂交：制片探针制备杂交镜检、拍照菌落(斑)原位杂交:以菌落(噬菌斑)为对象检测重组子的技术；依重组质粒(Phage)的靶序列，合成与之互补的DNA片段，作杂交探针.用途：从未知重组子检测与探针序列互补的阳性重组子PCR扩增技术：链式反响动物单拷贝G；根本原理：离体合成几何级数平台效应反响体系:模板引物7gBdNTPs缓冲液引物的设计:1630nt,GC含量连续互补碱基33正确配对5'可被修饰简并引物耐热的DNApohTaq酶Pfu酶35，校读高保真缓冲液:pH、离子强度Mg2+I,酶活IMg2+f,非特异t引物退火根本过程:变性退火延伸PcR技术的改良:©nestedPCRinversePCR(3)anchoredPCRRT-PCR"s"PCR实时定量PCR1 .巢式PCR：嵌套引物B外引物B内引物特点:降低错配，提高扩增特异性2 .反向PCR：扩增X、Y未知序列B酶R消化B环化B另一酶切B扩增X、Y序列X、Y示未知序列；用靶序列中不存在的限制酶R消化线性DNA模板，酶切后连接成环状；另一限制酶消化环形分子,从序列切开待扩增序列未知，难以选择适当的限制酶；扩增的长度有限，23kb;扩增产物常含有重复序列;DNA分子自身环化的效率较低特点：难选适当的限制酶扩增的长度有限自身环化效率低3 .AnchOredPCR：锚定引物A:PCR扩增0产物鉴定：特点：扩增未知序列无需酶切及连接操作简单特异性高5 .原位PCR原位扩增，杂交，定量。不需抽提模板中灵敏度高IoOX病毒检测、肿瘤发生率(原位PCR:扩增组织细胞中特异核酸，原位杂交后定量分析.(1)预处理：切片常规脱蜡：0.2molLHCl处理IOmin;蛋白能K消化；梯度酒精脱水，室温枯燥(2)原位扩增：切片滴加特异性引物，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边;(3)原位杂交.灵敏度比原位杂交高IoOX)6 .实时荧光定量PCR：FRET技术；荧光标记探针荧光扩增曲线分3个阶段：荧光背景信号阶段；荧光信号指数扩增阶段；平台期；实时荧光定量的原理：数学原理和化学原理几个参数确实定：临界点Ct标准曲线基线f阈值一Ct值一DNA0基线是扩增曲线中的水平局部；临界点(阈值)是在荧光信号指数扩增阶段上人为设定的一个值,但一般将阈值缺省设置(default)为315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍;Ct值：荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数.Ct值取决于阈值,阈值取决于基线,基线取决于实验的质量,Ct值是一个完全客观的参数:基线f阈值一Ct值TDNA浓度1.Og浓度与循环数的关系：起始数越多,Ct值越小：标准曲线一样品Ct值一初始模板量分子信标：与扩增产物结合产生荧光,信号的强弱一靶序列的多少荧光定量PCR的特点:实时检测特异性强定量结果准确DNA测序：化学降解法末端终止法SangCr引物设计:模板,引物.pol,dNTPs(dd)4个反响一4组产物PAGE-自显影一X光片DNA全自动测序:同位素标记荧光标记单色荧光多色荧光荧光标记:4种不同的荧光染料分别标记cldATRddTTP,ddCTP,ddGTP,这4种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光,因而每一种荧光代表一种碱基终止物的荧光标记。DNA的定点诱变:盒式取代我、切除；合成；转化Olig介导PCR诱变错误掺入诱变，即易错PCR因Taq酶无Y-5，外切酶活性，每扩增一次都会出现错配碱基，大多数为碱基置换(转换,AGC)盒式诱变(Cas$ettemutagenesis):切除特定片段；合成突变序列；转化.用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代WT基因中的相应序列.然而,并非所有变异区附近都能找到适宜的限制位点，如果不存在限制位点，就要用寡核背酸指导的定位诱变引入限制位点Olig介导的诱变:Olig片段退火合成转化；步骤：设计Olig片段；退火；合成互补链；转化和筛选；用途：功能研究；改变编码区个别AA的密码子以提高基因的表达活性转化fWT和MT基因的细胞一杂交鉴定1 .酵母双杂交(Y2H)：GAUproteinBD与UAS结合AD激活历CZ单独不起作用2 .酵母单杂交(YIH)：取代BDf融合蛋白报告基因表达3 .凝胶阻滞试验：探针标记与提取物温育非变性PAGE放射自显影凝胶阻滞试验的根本原理：放射性标记的DNA与一种蛋白B结合,于是在非变性凝胶中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带4 .足迹试验：通过与未加蛋白质保护的对照DNA的序列作比拟,便可得知相应于足迹部位的核昔酸序列结构5Summary:电泳技术PCR技术分子杂交DNA测序定点诱变