标准征求意见稿-实验动物 细菌核酸检测试剂国家参考品研制的标准规程.docx

ICS65.020.30CCSB44实验动物学会团体标准T/CALASx××-202x实验动物细菌核酸检测试剂国家参考品研制的标准规程1.aboratoryanimal-Preparationofnationalbiologicalreferencematerialsfornucleicacidtestreagentofbacteria（征求意见稿）202×-××-xx 实施202x-xx-××发布中国实验动物学会发布本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本规范由国家病原微生物资源平台建设项目提出。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会(SAC/TC281)技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：吉林大学、南方医科大学、中国医学科学院医学实验动物研究所、中国食品药品检定研究院。本文件主要起草人：袁宝、朱玉峰、高飞、张西臣、张楠、向志光、苏磊、付瑞。实验动物细菌核酸检测试剂国家参考品研制的标准规程1范围本文件规定了实验动物细菌核酸检测试剂国家参考品的研制规范。本文件适用于实验动物细菌核酸检测试剂国家参考品的研制。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14922实验动物微生物学等级及监测GB19489实验室生物安全通用要求WS315人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构设置技术规范3术语和定义以下术语和定义适用于本标准。3. 1实验动物Laboratoryanimal是专门培育供实验用的动物，主要指作为医学、药学、生物学、兽医学等的科研、教学、医疗、鉴定、诊断、生物制品制造等需要为目的而驯养、繁殖、育成的动物。4. 2细菌Bacterium是指生物的主要类群之一，属于细菌域。也是所有生物中数量最多的一类，形状多样，主要包括细菌、放线菌、立克次体、螺旋体、支原体、衣原体等。5. 3参考品BiologicalreferencemateriaIs是指用于定性鉴定微生物（或其产物）或定量检测某些制品生物效价和生物活性的国家标准物质。6. 4核酸NucIeicacid核酸是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的总称，是由许多核甘酸单体聚合成的生物大分子化合物,是所有已知生命形式必不可少的组成物质，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。7. 5Ct值eyeIethreshold实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4参考品8. 1参考品来源参考品制备所用的菌株需来源于国内或国际的菌种保藏机构，且菌株的遗传学特性得到相关部门的确认和保证并可追溯。如有需要还可以对参考品进行鉴定：对菌种进行培养特性观察，并进行生化鉴定和质谱分析。同时，收集菌株新鲜过夜培养物进行全基因组DNA提取，使用16SrRNA通用引物扩增目的DNA片段，再对目的DNA片段进行测序，将测序拼接结果提交到在线美国国家生物技术信息中心（NatiOnalCenterfOrBioteChnologylnformation,NCBD数据进行BIaSt比对分析，确保所用的菌株无污染。4.2参考品类型参考品分为以下四种类型。421阳性参考品是所要测试的目的菌株，一般选取n株（n5）不同来源且具有代表性的菌株作为阳性参考品。4.2.2 阴性参考品选取除测试目的菌株以外的其它种属细菌，一般选取与阳性参考品相同数量的菌株作为阴性参考品。4.2.3 重复性参考品选取1株阳性参考品菌株作为重复性参考品。4.2.4 最低检出限参考品与重复性参考品相同的菌株作为最低检出限参考品。5菌悬液的制备将参考品菌株复苏后分别接种在适合生长的培养基中，置于最适的温度下培养18h-24ho取固体培养物或经离心收集液体培养物沉淀，用灭菌的生理盐水悬起菌株，分别制备成菌悬液，利用中国细菌浊度国家标准品进行细菌计数进而确定菌悬液浓度。将明确浓度后的菌悬液进行加热灭活处理，并经平板布涂法确认无细菌生长后，将菌悬液分别稀释至适宜浓度（推荐稀释成LOxO个mL或LOXIO8个mL）,定量分装后置于-20C及以下环境保存备用。6参考品的制备6.1阳性参考品的制备将选取的n个（n5）阳性参考品原始菌悬液分别用无菌生理盐水进行稀释（推荐稀释成LOXlO6个r11L或LOxO个/mL）,每个阳性参考品稀释到统一工作浓度后再分别进行定量分装（推荐0.5mL管），标记PlPn<.6. 2阴性参考品的制备将选取的n个（n>5）阴性参考品原始菌悬液分别用无菌生理盐水进行稀释，稀释的浓度与阳性参考品工作浓度一致，然后定量分装（每管分装量与阳性参考品分装量一致），标记Nl-Nno6. 3重复性参考品的制备选取1个阳性参考品，将其稀释成与6.1和6.2相同的菌液工作浓度，然后定量分装（推荐08mL管），标记为重复性参考品。6.4 最低检出限参考品的制备取重复性参考品的菌液进行倍比稀释，分别制成LoXlO$个/mL、LOXlo4个岫、1.0XIO3个/niL、LoXlO2个岫、LoXK）I个/mL五个稀释浓度，然后定量分装（推荐0.8mL管），标记为最低检出限参考品。7参考品验证分析6.5 均匀性分析随机抽取阳性参考品（Pl-Pn）.重复性参考品各n管，以及最低检出限参考品，使用阳性参考品菌株的核酸检测试剂进行检测，重复23次。计算批内不同样品的循环阈值（cyclethreshold,Ct）的变异系数（CV）,评价参考品的均匀性。变异系数小于5.0%,表明参考品的分装均匀度良好。7. 2稳定性分析7.4.1 加速稳定性将阳性参考品（PlPn）和最低检出限参考品，分别于28、室温（25）、37的环境下放置3d、7do用阳性参考品菌株的核酸检测试剂进行检测，重复23次。同时以-20C保存的参考品作为检测对照。计算批内样品Ct值的变异系数，变异系数小于10%且P值大于005,则表明加速稳定性良好。7.4.2 冻融稳定性将阳性参考品（Pl-Pn）和最低检出限参考品，分别从20及以下冷冻环境中取出，在室温（25°C）环境中放置4h后，再重新放入-20及以下冷冻环境中，重复冻融35次。用阳性参考品菌株的核酸检测试剂进行检测，同时以-20C保存的参考品作为检测对照。计算批内样品Ct值的变异系数，变异系数小于10%且P值大于0.05,则表明冻融稳定性良好。7.3适用性分析731阳性参考品符合率将阳性参考品（PlPn）分别用两种及以上不同来源的核酸检测试剂进行检测，每份样本重复检测23次，每个试剂分别进行23次独立实验，检测阳性参考品符合率。7.3.2 阴性参考品符合率将阴性参考品（NlNn）分别用7.3.1相同的核酸检测试剂进行检测，每份样本重复检测23次，每个试剂分别进行23次独立实验，检测阴性参考品符合率。7.3.3 重复性将重复性参考品（推荐5管及以上），分别用7.3.1相同的核酸检测试剂进行检测，每份样品重复检测10次及以上，每个试剂分别进行23次独立实验，计算批内变异系数（CV）,评价参考品的重复性。变异系数小于5%,则表明重复性良好。7.3.4 最低检出限取LoXlo5个岫、LOXlO4个/mb、1.0Xl（）3个岫、LOXlO2个nLLoXlol个/矶五个浓度的最低检出限参考品，分别用7.3.1相同的核酸检测试剂进行检测，每份样本重复检测23次，每个试剂分别进行23次独立实验，评价检测试剂的最低检出限。8参考品协作标定对阳性参考品、阴性参考品、重复性参考品和最低检出限参考品进行编盲，分别发给三家及以上核酸诊断试剂生产企业实验室进行协作标定，分别使用各自的检测试剂进行准确性、特异性、重复性和最低检出限检测分析，并进行23次独立实验，最后将所有原始结果返还协作标定组织单位汇总分析。