实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶.ppt

实验 23琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶,实验目的,掌握：电泳法测定血清乳酸脱氢酶同工酶的基本原理。熟悉：电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶的的操作过程、注意事项及对疾病诊断的临床意义。了解：琼脂糖凝胶电泳的临床应用。,乳酸脱氢酶同工酶的一级结构和等电点不同，在一定的电泳条件下，使其在支持介质上分离。然后利用酶的催化反应进行显色：,实验原理,1巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.075）20.082mol/L巴比妥-盐酸缓冲液（pH 8.2）310mmol/L乙二胺四乙酸二钠 45g/L缓冲琼脂糖凝胶 58g/L缓冲琼脂糖凝胶 6显色试剂7固定漂洗液,试剂与器材,1制备琼脂糖凝胶玻片 2加样 用微量加样器加约40l血清于槽内。3电泳 电压75V100V，电泳30min40min。4显色 5固定和漂洗,操作步骤,1目视观察 在碱性介质中，LD同工酶电泳条带由正极到负极依次为：LD1、LD2、LD3、LD4和LD5。按各区带呈色的深浅，比较LD各同工酶区带呈色强度的关系。2光密度计扫描 用光密度计在570nm波长下扫描，求出各同工酶区带吸光度所占百分比。,结果观察,3在不具备光密度仪扫描条件下，如果需要进行定量，可将各区带切开，分别装入试管中，加入400 g/L尿素 4ml，于沸水浴中加温5 min10min，取出冷却后以570nm波长比色。空白管则取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用上述相同的方法处理。比色后根据各管吸光度计算各同工酶的百分率。,结果观察,吸光度总和：A总A1+A2+A3+A4+A5，式中A1、A2、A3、A4、A5为各同工酶区带的吸光度各同工酶百分率(%)为：(x=1，2，3，4，5),计算,健康成年人血清中LD同工酶百分比有下述规律：LD2LD1LD3LD4LD5。,参考范围,1.LD同工酶电泳分析在临床上常用于急性心肌梗死的诊断，在急性心肌梗死时LD1与LD2活性均升高，但LD1升高更早、更明显，导致LD1/LD2比值增大。2.溶血性疾病、幼红细胞贫血症、肾坏死、以及假性肥大性肌营养不良、活动性风湿性心肌炎、急性病毒性心肌炎患者血清LD1和LD2的活性也可增高。,临床意义,3.肝炎、急性肝细胞损伤时LD5增高。急性肺损伤、白血病、胶原病、心包炎以及病毒感染时LD2和LD3增高。4.胃癌、结肠癌和胰腺癌患者血清中五种LD同工酶均可升高，但以LD3增高最为显著。骨骼肌损伤时LD4和LD5增高。,临床意义,1严禁溶血。2LD4与LD5（尤其是LD5）对热很敏感，因此底物-显色液的温度不能超过50，否则易使LD5等变性失活。3LD4和LD5对冷不稳定，容易失活，应采用新鲜标本测定。如果需要，血清应放置于25条件下保存，一般可保存2d3d。4PMS对光敏感，故底物显色液需避光保存，否则显色后凝胶板背景颜色较深。,注意事项,操作简便、重复性好、标本用量少。明显的溶血会导致假阳性。,评价,1LD同工酶测定时为什么要严禁溶血？为何测定LD的血清标本不能冰冻或冷藏？2LD同工酶测定对疾病诊断的临床意义为何优于LD总活性测定？3LD同工酶琼脂糖电泳测定的原理是什么？在电泳中应注意哪些事项？,思考题,