14第十四章超敏反应性疾病的免疫学检验.ppt

第十四章 超敏反应性疾病的免疫学检验,返回总目录,目录,超敏反应（hypersensitivity）又称变态反应，是指机体再次接受相同抗原刺激后，发生的以组织细胞损伤或生理功能紊乱为主的特异性免疫应答。,变应原（allergen）：引起超敏反应的抗原称之为变应原。,超敏反应,第一节 激发试验,激发试验（provocation test）是模拟自然发病条件，用少量超敏原引起一次较轻的超敏反应发作，达到确定超敏原的一种体内试验。,非特异性激发：是用组胺等刺激物做雾化吸入，以观察患者对型超敏反应的敏感性，进而分 析病因或判定疗效。特异性激发：是用抗原如尘螨等做试验，对明确 超敏原有一定价值。用于型和型超敏反应性疾病的检查。,一、皮肤试验,是在皮肤进行的体内免疫学试验，简称皮试。机制：,型超敏反应,型超敏反应,皮内试验点刺试验（挑刺或刺痕试验）斑贴试验,（一）试验类型及方法,（二）结果判定及分级标准,速发型皮肤试验结果判定 阳性反应以风团为主；点刺试验的阳性反应以红晕为主。迟发型皮肤试验结果判定 阳性结果以红肿和硬结为主。,相同超敏原不同稀释度,速发型1530min内观察,迟发型4872h内观察,0.010.03ml/针,4mm/针,方法,结果,皮内试验,比皮内试验敏感性稍低，但假阳性较少；皮试液浓度要比皮内试验高10100倍。,将试验抗原与对照液分别滴于试验部位的皮肤上,用针尖透过液滴轻挑一下以刺破皮肤而不出血为度,1min后拭（吸）去试验抗原液,点刺试验,第一次读：48小时打开斑试器,间隔30min待斑试器 压痕消失后判定结果。第二次读：第3天或第4天。如怀疑光过敏，在斑贴试验的基础上给予紫外线照 射，操作过程相似。,斑贴试验,（三）结果分析及注意事项,假阴性出现的常见原因：皮试液的浓度过低或失效；老年患者或过敏性休克或哮喘大发作之后；皮试前用过抗组胺药或免疫抑制剂；操作不当将皮试液注入皮下或注入量过少等。,（三）结果分析及注意事项,假阳性出现的常见原因：皮试液含有非特异性刺激物；患者患有皮肤划痕征；操作手法较重；注入量较大或浓度过高；注入少量空气等。,询问病史,阳性对照,必备抢救药品和设施,如何避免假性结果的出现：,适应证,阴性对照,皮试液浓度,（四）应用与评价,预防药物或疫苗等过敏 防治型超敏反应性疾病 结核菌素试验评估机体细胞免疫功能 预防皮肤接触过敏,结核菌素试验,是用结核菌素进行皮肤试验，通过观察局部是否出现迟发型超敏反应，判断机体有无结核分枝杆菌感染和对该菌的免疫力。,阳性：机体已感染过结核杆菌或BCG接种成功；强阳性：可能有活动性结核病；阴性：机体未感染过结核分枝杆菌，但应考虑：感染初期；老年人；重度结核病患者，机体处于免疫反应低下状态；患有其他疾病。,二、支气管激发试验,手捏式雾化器,bronchial provocative test,BPT 测定支气管吸入某种刺激性物质后产生收缩反应程 度的方法，亦称气道反应性测定；吸入一定量的激发物；比较吸入前后肺通气功能指标；判断气道高反应性程度。,雾化抗原颗粒5微米,测定肺功能指标：用力肺活量(FVC)1秒用力呼气容积(FEV1)最大呼气流速(PEF)比气道传导率(sGaw),射流雾化器,特异性BPT 将一定浓度的抗原刺激物装入雾化器中 使受试者经口或鼻吸入雾化颗粒，其携带激发物在 支气管树及肺泡沉积而起作用。非特异性BPT 将一定浓度的激发物装入雾化器中，进行同特异性BPT的操作。吸气流速、雾化颗粒直径的大小以及气道通畅与否 均可影响雾化颗粒在气道的沉积，从而影响气道的 反应性。,（一）试验类型及方法,测基础肺功能,激发物稀释液：低浓度/小剂量双倍浓度/剂量递增,阳性伴明显气促、喘息,口吸入,11分半钟,测定肺功能,阳性标准/明显不适/临床症状,直至,激发物达到最高浓度,阴性反应,支气管舒张剂,吸入,技术要点,（二）测定指标及结果判断,支气管反应有三种类型：速发、迟发和双重反应。每次观察不能小于24小时。FEV1：重复性好，结果稳定；PEF：峰流速仪价格低廉、方便、不受场地限制，与FEV1有较好的相关性，适合流行病学调查；sGaw：敏感性好，但重复性稍差。,变应原的确定常以定性试验判断结果。阳性：气道反应性增高 FEV1、PEF较基础下降20或sGaw下降35%，有时伴有明显自觉症状或肺部闻及哮鸣音。,（二）测定指标及结果判断,阴性：气道反应性正常 FEV1、PEF或sGaw上述标准，正常值为阴性。无论激发试验阳性或阴性，均应排除气道反应性的影响因素。可疑者，间隔23周后复检或2个月后再测。,（二）测定指标及结果判断,（三）注意事项及禁忌证,受试者在心肺功能不全、高血压、甲亢、妊娠、严重咽喉炎、呼吸道感染或肺炎等情况下一般不适宜作激发试验；有过敏性休克，严重的血管性水肿及严重的喉头水肿病史者；一周之内预防接种、职业性过敏因素的接触等。,受试者在检查前：48小时：停！抗组胺药、色甘酸钠及皮质激素类药;12小时：停！支气管扩张剂;15分钟：实验室休息,病史、体检排除BPT的禁忌证。,（三）注意事项及禁忌证,基础FEV1占预计值70%以上才能进行试验。受试者应为哮喘患者病情稳定时或缓解期。吸入激发物的浓度应从小到大，逐渐递增。应备有急救器械、药品和有经验的临床医生在场。,（三）注意事项及禁忌证,（四）应用与评价,观察症状,症状好转或减轻,导致,三、食物激发试验,基础饮食,吃可疑的过敏食物,症状加重,1周后,疑似,过敏原，重复3次,确定,某食物为过敏原,症状未减轻,1周后,排除,食物所致过敏,四、其他方法,结膜激发试验,将超敏原滴于一眼，阳性反应为结膜充血、水肿、分泌增加、搔痒，甚至眼睑红肿。注意假阳性对结果的干扰。,返回章目录,第二节 IgE的检测,一、IgE的测定,CLIA敏感度更高，特异性高，定量,测定方法,固相RIA是较传统的IgE检测方法,ELISA 双抗体夹心法，操作简便，敏感性很高，是测定血清IgE最常用的方法,临床意义 正常人群血清IgE水平受地域环境、种 族、遗传、年龄、性别、寄生虫感染、测定法及取 样等影响，结果有一定差异。,参考值,0.10.9mg/L,某些过敏体质者高于正常100010000倍,血清IgE高,特应症、支气管肺曲菌病、药物性间质性肺炎、麻风、寄生虫病及IgE型骨髓瘤等,二、特异性IgE的测定,用纯化的过敏原去检测相应的IgE抗体的一类试验。酶联免疫吸附试验：常用间接法测特异性IgE。免疫印迹技术：操作简单，能一次性测定多种变。应原的特异性IgE，故临床已普遍采用IBT法。,4.底物显色,2.待检特异性 IgE抗体,1.已知变应原 包被载体,（+）,3.酶标动物 抗人IgE,洗涤,洗涤,洗涤,结果,ELISA间接法检测特异性IgE,特异性变应原加入待检血清,转印至NC膜,NC膜,待检血清特异性IgE,抗-IgEHRP,底物,特异性抗原条带显色,NC膜变应原特异性IgE抗-IgEHRP,IBT检测特异性IgE,返回章目录,第三节 免疫复合物检测,免疫复合物（immune complex,IC）:指由抗原与相应的抗体结合而成的复合物。局部免疫复合物：沉积在机体的某一局部。循环IC（circulating IC,CIC）：血液中存在的IC。型超敏反应：在传染病或性病时，IC沉淀于局部后激活补体，最终导致组织损伤，形成IC病。,抗原特异性IC,抗原非特异性IC,检测已知抗原与相应抗体形成的IC,不考虑形成IC抗原的性质，检测未知抗原与相应抗体形成的IC总量,一、抗原非特异性CIC检测技术,CIC：分子量600kDa以上，沉降系数19S；热聚合人IgG(heat agglutination human IgG,HAHG)：作为参考标准品，绘制标准曲线进行CIC定量或测定 A值代表CIC相当于HAHG的含量。,CIC的检测方法：按抗体分子在结合抗原后发生的物理学和生物学特性的改变而设计。PEG比浊法;ELISA法;胞法Raji细胞法;抗球蛋白技术mRF凝胶扩散试验。,（一）PEG比浊法,1.基本原理 聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）为 不带电荷、直链大分子结构的多糖，有强脱水作用，利用2%4%浓度的PEG可选择性沉淀大分子CIC。2.技术要点 生物化学检验。,2%PEG沉淀大分子CIC；4%PEG沉淀较小分子CIC；超过5%PEG选择性沉淀CIC的特性消失；温度影响极大，需进行温差校正；低密度脂蛋白使浊度增加，空腹采血；高球蛋白血症和标本反复冻融浊度增加。,3.注意事项,（二）ELISA法,1.基本原理 ELISA法测定的CIC，是能够结合C1q的 IgG类抗体与其特异性抗原形成的CIC。2.技术要点 将聚苯乙烯包被上C1q，加入受检血清，CIC中IgG的Fc段与C1q结合，再加抗人IgGHRP，形成C1q-CIC-抗人IgGHRP复合物，加底物显色。,灵敏度高于PEG比浊法，检测到0.1mg/L，重复性好等优点；C1q制品不易精制,纯品不稳定，只能检出与补体结合的CIC。,3.方法评价,（三）细胞法Raji细胞法,Raji细胞是从Burkitt淋巴瘤分离建株似 B细胞系，在体外繁殖传代，细胞表面有高密度的 C1q、C3b、C3d等补体受体，而且不易脱落。,1.基本原理,将定量待检血清、HAHG和Raji细胞混合，使补体、CIC或HAHG与Raji细胞形成复合物，加入抗人IgGFIC，形成Raji细胞补体CIC(或 HAHG)抗人IgG FIC复合物，检测荧光强度。,2.技术要点,培养条件能改变Raji细胞其表面受体的数量及亲和性，影响检测敏感性;待检血清中如有抗淋巴细胞的抗体，能和Raji细胞反应;SLE血清中的抗DNA也能和Raji细胞反应，使测定结果偏高。,3.影响因素,敏感性高(6mg/L HAHG)，实用性强；缺点需培养Raji细胞和同位素标记抗人IgG，操作繁琐;Raii细胞培养较困难，不易长期稳定保持其特性，培养条件受限。,4.方法评价,（四）抗球蛋白技术mRF凝胶扩散试验,1.基本原理 IgG或IgM类自身抗体与IC中IgG的Fc段结合而不与游离IgG结合的特性，mRF与CIC亲和力较强。,2.技术要点 将mRF和待检血清中的CIC在琼脂凝胶中扩散，mRFCIC结合形成沉淀现象，进行CIC定性或定量。3.方法评价 敏感度较低100mg/L（HAHG），mRF来源受限，操作费时，难于常规应用。,二、CIC检测方法评价及应用,自身免疫性疾病病程中连续动态观察或辅助诊断：试验方法本身不完善；IC形成的复杂性，如在生理状态下IC是由各种抗原 与相应抗体所构成的，维持动态平衡。在病理状态 下往往是单一种类IC增高，而此种单一成分增高发 展到足以影响IC总体水平情况下，才能被试验检出。,（一）检测方法评价,肾脏疾病：急性肾小球肾炎、移植肾、IgA肾病；消化系统疾病：慢活肝炎、原发性胆淤性肝硬化；皮肤病：荨麻疹、天疱疮、皮疹性皮炎；型超敏反应性疾病：SLE、RA、硬皮症、自身 免疫性溶血性贫血等。此外，CIC的检测对于肿瘤、肝癌、白血病、霍奇金病、神经肌肉萎缩性侧索硬化症等疾病的诊断。,(二)临床应用,固定或沉积于病变局部组织中的IC测定常用免疫组化技术，如荧光免疫组化技术检测到组织标本有Ig和补体。受累组织的成分、构型和特定的部位可为疾病的严重程度和预后提供依据。,三、沉积于组织中IC 的测定,返回章目录,类型,第四节 抗人球蛋白试验(Coombs试验),不完全抗体：抗体分子较短小，只能与颗粒抗原一方相结合，不出现可见的凝集现象，但能封闭抗原决定簇，使其不能再与完全抗体结合。,抗人球蛋白试验（antiglobulin test,AGT）：将人 球蛋白注入异种动物，诱导动物产生抗人球蛋白血清（antiglobulin serum，AGS)，AGS加入表面结合有不完全抗体的红细胞复合物中，就能出现可见的凝集现象。,作用：检测红细胞表面结合的不完全抗体。临床意义：新生儿溶血症和自身免疫性溶血性贫血的诊断。,RBC为Rh+,7S的IgG,体内发生,+,抗IgG,体外测试,抽血,一、直接抗球蛋白试验,检测游离在血清中的不完全抗体或红细胞表面的抗原,RBC为Rh+,不完全抗体试剂,+,抗IgG,体外测试,二、间接抗球蛋白试验,技术要点,凝集为阳性，表明受检血清有不完全抗体或红细胞上有相应抗原；同时具备阳性对照管凝集阴性对照管不凝集，如有不完全抗体，可将血清以作倍比稀释进行效价测定。,结果判断,在37水浴中，抗体吸附相应红细胞上的结合程 度，与致敏的时间、离子强度有关；离心速度和时间十分重要，原则应以最小的离心 力和最短的离心时间使阳性对照管出现反应为宜。,是一种极为敏感的检查不完全抗体的方法，也是RhD 检出的确证试验。操作繁杂，受试验条件影响较大。,注意事项,方法评价,血液病的检测；鉴定血型和检查血清中不完全抗体；有助于RhD的检出，多用于检测母体RhD抗体；输血前交叉配血试验及其他特殊研究；及早发现和避免新生儿溶血症的发生；红细胞不相容的输血所产生的血型抗体进行检测。,返回章目录,临床意义,方法：荧光分光光度法、放射免疫分析法及酶免疫 分析法测定。变应原刺激剂致嗜碱粒细胞释放组胺，可以检测出嗜 碱粒细胞的释放能力，变应原刺激剂可以特异性确定 变应原的类型。,类型,第五节 药物过敏筛选实验,一、组胺含量测定,BHRT是变应原刺激剂刺激纯化、洗涤后的嗜碱粒细 胞悬液而后释放化学介质组胺，通过测定组胺的量来 反映嗜碱粒细胞的释放能力。BHRT的结果可以从细胞释放一定量的组胺所需要的 变应原浓度或在一定浓度的变应原作用下细胞所释放 定量的组胺量来表达。实验的灵敏度高，结果可靠，但价格较高。,嗜碱粒细胞组胺释放,(basophil histamine release test，BHRT),(human basophil degranulation test，HBDT),人嗜碱粒细胞脱颗粒试验,嗜碱粒细胞胞质中硫酸肝素颗粒可以被碱性染料(甲苯胺蓝、阿利新蓝等)染色。当嗜碱粒细胞表面结合的IgE与过敏原结合后，嗜碱粒细胞脱颗粒，则不再被染色，染色完整的细胞减少，从减少的完整细胞判断变应原引起的过敏状况。,类胰蛋白酶,类胰蛋白酶：是MC更具有选择性的标志，类胰蛋白酶储存于分泌颗粒中，MC激活时，被释放至细胞外；类胰蛋白酶原以酶原的形式存在，它的释放不需要MC的激活，所以它的血清水平可以反映体内MC数目。嗜碱粒细胞几乎不含类胰蛋白酶。,返回章目录,小 结,超敏反应性疾病通过体内和体外实验，可进行变应原的相关检测，包括激发试验（根据刺激物不同分为非特异性和特异性激发试验，按检测部位又分为皮肤试验、支气管激发试验、食物激发试验等）；IgE检测（总IgE和特异性IgE检测）；免疫复合物检测主要针对抗原非特异性CIC；抗球蛋白试验（直接法和间接法）；药物过敏筛选实验（组胺含量测定和特异性抗体测定）。,返回章目录,THANK YOU FOR YOUR ATTENTION!,返回总目录,