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肺类器官在肺上皮细胞修复和再生医学中的研究进展2023摘要肺的上皮细胞组成肺内机械屏障并参与气体交换。其中，部分上皮细胞具有干细胞潜能，被认为是肺上皮干细胞，在维持肺内稳态和修复受损上皮细胞中发挥重要作用。类器官由多能干细胞或成体干细胞体外三维培养而来，其结构和功能与来源组织或器官高度相似，并且能自我更新和增殖分化。其中，肺类器官能体外模拟肺的上皮细胞结构和功能，为研究肺上皮干细胞修复上皮细胞提供理想模型，也为肺的再生医学领域提供理想移植物。本文围绕肺类器官，归纳肺上皮干细胞修复上皮细胞所涉及的机制，同时概括肺类器官在再生医学中的应用，以期为肺部疾病的治疗提供相关参考。呼吸系统主要由各级气管和肺泡组成，内侧覆盖广泛的上皮细胞，根据其分布区域可大致分成1：(1)气道上皮细胞：位于肺内外环境交界处，发挥抵御病原微生物、有害气体和过敏原等物质的作用2;(2)肺泡上皮细胞：处于肺内实质中，参与气血交换和分泌表面活性物质3o这些上皮细胞的损伤可造成慢性阻塞性肺疾病、特发也市纤维化等。近年来，有研究4认为部分肺上皮细胞具有干细胞/祖细胞潜能，在遭受损伤刺激时，能迅速从安静状态转为激活状态，通过增殖和分化来修复受损的上皮细胞。相较于炎症、纤维化等病理性修复方式，肺上皮干细胞/祖细胞能重建正常的上皮细胞5,6o因此，探索驱动这些肺上皮干细胞/祖细胞修复上皮细胞的机制能帮助我们更好地掌握肺上皮细胞损伤后修复情况，为肺部疾病治疗提供新思路。以往实验多利用细胞2D培养和动物模型进行研究。细胞2D培养模型无法真实刻画机体细胞的空间分布，动物模型又存在种属异质性，其细胞组成和结构与人类存在明显差异。这些经典实验模型的缺陷妨碍人们正确了解损伤修复的过程。然而，随着类器官这一新实验模型的出现，以上缺陷都有望得以克服。肺类器官是利用干细胞在体外3D培养环境中生成的结构包含肺上皮干细胞/祖细胞在内的多种上皮细胞类型并呈现与机体相似的细胞空间分布，尤其是人源性干细胞生成的肺类器官，能真实模拟人肺细胞组成和结构，帮助研究人体肺上皮细胞损伤后的反应和修复。同时,凭借其独有的成分同源性优势，它能有效避免移植中出现的排斥反应，可作为理想的移植物应用于再生医学领域。本文将围绕肺类器官，对肺上皮干细胞修复上皮细胞所涉及的机制进行归纳，同时对肺类器官在再生医学中的应用进行概括，最后简单讨论当前肺类器官发展的挑战和方向。一、肺类器官主要培养方式目前肺类器官的培养方案多种多样，尚无统一标准。公认的培养原则是遵循机体肺脏发育顺序。研究人员主要通过体外模拟与肺生长发育相似的环境，利用多能干细胞(pluripotentstemcellzPSC)和成体干细胞(adultStemCeIl,ASC)这两种起始细胞生成肺类器官。多能干细胞7,8,9是一群具有多向分化潜能的细胞。通过不同的细胞因子或者抑制剂先后作用，能够促使多能干细胞依次分化为终末内胚层(definitiveendoderm前肠内胚层(anteriorforegutendoderm)z该变化与肺脏早期发育轨迹相似。紧接着对前肠内胚层细胞进行特定肺祖细胞分选或其他处理，最后包埋在添加了细胞因子的基质胶中培养(表1%其中，用于肺组细胞分选的常见方法和用途如表2所示。肺祖细胞分选能进一步控制细胞生长发育的方向，有助于获得特定细胞组成的肺类器官。目前还没有报道将这些分选方法进行详细比较。表2肺祖细胞分选方法和用途文献分选方法分选的肺祖细胞用途McCauIeyt"1诺系特异性报告基因崎选法NKX2.1"肺祖细胞布助于生成气道上皮细胞为主的类器2Jacob"2'诺系特升性报竹将内筛选法NKX2j3"sriTCmi肺祖细胞助于生成AT2为主的类器仃Konishi""表面标志物筛选法表达段脓JWM的NKX2.1肺祖细胞行助于肺泡和气道上皮类器官生成Hawkins：M1衣面标志物筛选法CiM7高表达CD26低表达的NKX2.1M祖细胞不助于建立疾病类型的肺类器U肺成体干细胞是指肺脏中具有分化增殖能力的细胞，可以通过机械、化学10等处理从组织中提取，同样也需要包埋在添加了细胞因子的基质胶中培养。虽然目前生成的肺类器官细胞组成和成熟度均不相同，但大致能包含基底细胞、气道分泌细胞、纤毛细胞等气道上皮细胞和I型、11型肺泡上皮细胞，可用于体外观察肺上皮细胞损伤反应和修复机制。二、基于肺类器官研究上皮细胞修复1.肺泡上皮细胞修复的有关因素：肺泡区域主要包括I型肺泡上皮细胞(AT1)和11型肺泡上皮细胞(AT2I其中，AT2被认为是肺泡上皮干细胞，能增殖和分化修复受损的AT1,维持肺泡上皮细胞正常结构和功能160既往传统的实验模型和慢性阻塞性肺疾病患者均发现WNT-5A、WNT-5B表达增高、FZD4表达降低等情况。相关研究17,18利用肺泡类器官探索它们对疾病的影响及作用机制，发现这些情况可能会抑制经典WNT信号通路，导致肺泡类器官的减少和表型缺失。Ng-Blichfeldt等19进一步研究发现，这些异常表达的物质可能与病理状态下间质成纤维细胞大量分化为肌成纤维细胞有关，他们还发现肌成纤维细胞不仅能抑制经典WNT信号通路，还会减少HGFxFGF7表达，两者可能会发挥协同作用，加重上皮损害。因此，部分研究将治疗靶点聚焦于激活经典WNT信号通路。WU等20通过合成非选择性Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶抑制剂，证实其能有效逆转上述改变，帮助肺泡类器官生成。此外，Costa等21筛选出临床药物氨来占诺，可以作为WNT-Catenin信号通路激活剂促进肺泡类器官生成，并显著改善肺气肿小鼠的肺功能。同时，与其他模型相比，类器官具有独特的组织同源性，能更真实反映疾病状态并检测药物效应。一直以来，维甲酸(retinoicacid)被广泛用于临床治疗肺部疾病，但其治疗效果并不理想。得益于类器官模型，Ng-Blichfeldt等22在研究中发现,维甲酸抑制剂能激活YAP信号通路和上皮-间质细胞间FGF信号通路，促进AT2增殖，而激活维甲酸信号通路能诱导AT2分化为AT1。这一发现表明短暂地抑制RA信号通路可能更有利于修复肺泡上皮细胞。此外,Gokey等23尝试探索RA对于IPF的作用，发现它能间接激活成纤维细胞中的PDGFA信号通路，帮助肺泡上皮细胞修复。其他研究24,25也发现了疾病状态下的异常改变会影响肺泡上皮细胞修复,如慢性阻塞性肺疾病患者的AT2会出现巨噬细胞抑制因子类似物(D-dopachrometautomerase)表达降低，又如IPF患者的AT2会出现特异性细胞外基质透明质酸(HA)缺乏，它们分别调节PI3K-Akt信号通路和STAT3信号通路参与损伤修复。以上研究证明，肺泡类器官既能模拟疾病状态，又能用来探索这些异常改变对疾病的影响，并阐明其作用机制，有助于我们深入、全面理解致病因素，从而给临床治疗提供可靠依据。此外，肺泡类器官还能用来研究炎症环境对损伤修复的作用。Katsura等26用IL-I和TNFa与类器官共培养来模拟炎症环境，发现这些炎症因子能够激活NF-KB信号通路刺激损伤区域及周围的AT2分化成AT1o随后，Choi等27发现，肺泡上皮细胞损伤会引起间质巨噬细胞释放IL-1,通过激活Hif1a信号通路来介导糖酵解途径，促使AT2分化为损伤相关的暂时性祖细胞(damageassociatedtransientprogenitor,DATP),进而再分化成AT1o但是他们发现持续存在的IL-1会导致大量DATP和不成熟AT1累积，阻碍肺泡上皮细胞修复。这些发现表明持续存在的炎症环境不利于修复，可用来解释慢性炎症会导致肺部疾病的发生。同时其涉及的信号通路，也可能成为治疗上的靶点。还有一些研究通过观察不同信号通路对AT2增殖和分化来说明影响肺泡上皮细胞修复的因素。Chung等28发现BMP信号通路有助于AT2分化为AT1,而抑制该通路能促进AT2增殖。因此，可能需要根据肺泡上皮细胞修复的不同阶段调节该信号通路。Zhang等29发现prkg2基因通过编码CGMP依赖的2型蛋白激酶激活PKA信号通路，促进肺泡上皮细胞修复。2.参与气道上皮细胞修复的相关因素：气道区域主要由基底细胞、气道分泌细胞和纤毛细胞等上皮细胞组成，是传导气体的重要场所。其中，基底细胞、气道分泌细胞也被认为是上皮干细胞,具有增殖和分化潜能300支气管哮喘、慢性阻塞曲市疾病等患者会出现IL-6水平升高。有研究31发现，IL-6既能激活STAT3信号通路促进基底细胞增殖，又能抑制Notch信号通路并调节McidasxFoxjl等纤毛相关基因表达，促进基底细胞分化为纤毛细胞。Gao等32发现，气道上皮细胞损伤后高表达的Grhl2通过激活NOtCh信号通路，诱导MCidas、RfX2、Myb等纤毛相关基因表达，参与气道上皮细胞损伤修复。此外，也有研究33证明抑制BMP信号通路能促进基底细胞增殖和分化。这些发现找到了基底细胞参与气道上皮细胞修复的信号通路，有可能成为临床治疗的新选择。相似地,气道分泌细胞，尤其是Club细胞是如何参与气道上皮修复也有研究进展。RaSIan等34发现ClUb细胞能表达R-spondin2蛋白并激活经典WNT-catenin信号通路,帮助Club细胞增殖并分化为FOX川+纤毛细胞和MUC5AC+杯状细胞。其他研究35,36发现，不同的气道平滑肌亚群通过激活WNT-catenin或FGF10信号通路，促进Club细胞增殖和分化。此外，Li等37发现，自噬是炎症环境下保持Club细胞干性的重要方式,Club细胞主要通过摄取中等量葡萄糖来维持。一旦阻止其摄取葡萄糖,会刺激Club细胞分化为纤毛细胞和杯状细胞。这些结论较好地反映了气道周围环境和营养代谢对气道上皮细胞的修复作用，也可能作为疾病治疗的作用点。三、肺类器官在再生医学中的应用再生医学作为一门前沿学科，旨在通过药物、干细胞和组织工程等途径来修复或替代结构和功能有缺陷的细胞、组织和器官，并帮助其恢复正常功能38o近年来，类器官培养、3D生物打印、CRlSPR-CAS9基因编辑等先进技术发展，极大地推动了再生医学领域的进展39o其中类器官能利用机体来源干细胞实现体外生长，并拥有发展为完整器官的潜力，具有相当可观的再生医学应用前景。为探索肺类器官能否在体内存活并发挥有效功能，相关学者进行了初步研究。Tan等40将成人原代支气管上皮细胞、肺成纤维细胞和肺微血管内皮细胞3D培养生成气道类器官,并将其移植到免疫缺陷小鼠的肾包膜下。研究发现它能从移植区域附近的小鼠血管中获得生长所需的营养物质，实现体内存活超过6周。同时，对该类器官进行细胞特异性标志物检测，发现在其生长的过程中，能够检测出新的细胞类型，如CC10+气道分泌细胞和AQP5、SPC+肺泡上皮细胞。这一研究表明，肺类器官有望实现体内移植并能保持生长能力，一定程度支持肺类器官用于肺的再生。此外，MilIer等41对气道损伤的小鼠进行气道内滴注芽尖祖细胞类器官，发现移植1周后它们还具有增殖能力。6周后再次检测，发现MUC5AC÷分泌细胞、FOXJ1+纤毛细胞、SNY+神经内分泌细胞等更多种细胞种类。这一发现更加支持肺类器官用于再生医学。其他研究42还分别培养SCAl-的AT2生成的肺泡类器官和SCA1+多能祖细胞生成的肺类器官。同样将其注入损伤肺组织内。其中SCAl-的肺泡类器官始终定植于肺泡区域并表达AT2特征表型，通过单细胞转录组测序，发现该肺泡类器官中的AT2转录组学信息与自然肺泡高度相似。用蔡再次刺激小鼠肺脏时，定植的SCA1-的肺泡类器官中AT2能分化为AT1,发挥修复作用。不同地，SCA1+多能祖细胞生成的肺类器官可分布在支气管和肺泡区域，随着时间的推移可出现中间状态，发挥不同作用。以上发现表明，肺类器官极有可能用于肺再生治疗。并且，随着研究深入，不同种类的肺类器官可能专注于某一区域，发挥特定功能，从另一角度推动了肺损伤的精准治疗。四、肺类器官在研究肺上皮细胞修复和再生医学中的挑战和展望当前生成的肺类器官有一定局限性，给肺上皮细胞修复和再生医学研究带来挑战。首先，大部分肺类器官细胞组成相对单一，主要缺乏血管内皮细胞、免疫细胞等肺内微环境相关细胞，其精确性和复杂性远不及真正肺脏,并且忽视了这些细胞在修复中的作用。其次，该模型体外培养周期较长，组成细胞未彻底分化，仍需要在体内进一步生长发育。另外，小鼠肉瘤来源的Matrigel是培养肺类器官的重要组成，具有异源性和致瘤性风险，并且其组分不明确、批次质量不稳定，会限制其人源性转化应用。同时，目前Matrigel培养出的肺类器官直径大小不一,可能会影响实验准确度。因此，优化肺类器官模型，建立标准化肺类器官培养方式将更好发挥该模型优点。目前，现有的一些初期探索43,44发现，通过外源性添加其他种类细胞或优化培养方案来提高该模型的复杂性、精确性。此外，水凝胶、胶原蛋白等新3D培养体系在肠道、胰腺等类器官培养中的成功应用，也给培养肺类器官带来启示，有学者45,46已经开始尝试用水凝胶、胶原蛋白培养肺类器官，取得一定进展。与此同时，已有相关文献47报道支架材料有望解决肺类器官直径大小不一问题。另外，微流控、磁性纳米颗粒、生物反应器系统等48,49技术与肠、脑等类器官培养方案优化有效结合，也可用于指导肺类器官培养。总体而言，肺类器官虽处于发展的起步阶段，但其前景相当可观。将来，一定会出现与人体相似度百分之百的肺类器官，实现更多、更深入的医学研究。