人体益生菌阿克曼氏菌检测方法的开发.docx

摘要人体内的肠道微生物群在维持生理稳态中一直发挥着重要作用，为人类健康提供内部支持。其中目前对肠道微生物的检测手段除了有传统培养法、下一代测序技术(NGS)两种以外。目前.，这些研究方法中普遍存在着一些明显的缺陷，如操作步骤繁多、耗费时间长、准确率低下、研究成本高等问题。除了以上两种，还有荧光原位杂交(FISH)和实时荧光定量PCR两种方法。本文旨在开发出一种利用实时荧光定量PCR来定向检测阿克曼氏菌的方法，通过该方法可以快速高效地在低成本的条件下定向检测阿克曼氏菌的数量并加以分析，由此为阿克曼氏菌的深入研究提供更加高效的大量数据支持。为了设计出特异性强，灵敏度高的引物探针组合，先从NCBI数据库中检索阿克曼氏菌的全基因组数据。找到16SrRNA序列保守区，通过MEGA软件先将序列进行对齐，根据阿克曼氏菌的特征SNP位点设计特异性强的引物探针组合，然后送到上海生工进行合成。本实验所检测的是人肠道微生物阿克曼氏菌，样本均为人粪便样本，能更好的反映人的肠道微生物组成。通过粪便微生物DNA提取试剂盒QIAamPPowerFecalProDNAKit进行微生物基因组DNA提取，使用过验证合格的引物先进行普通PCR扩增检测，琼脂糖凝胶电泳验证后再用qPCR检测手段去验证是否符合实验要求。在HITdb数据库中选择目标菌种后，我们设计了具有特异性的引物和探针，并验证了靶向菌种的覆盖率超过70%o通过比较文献数据和实验验证，筛选出适用于TaqManqPCR的肠道微生物标记基因，建立标准曲线，实现对肠道微生物数量的快速定量。通过对不同样本的检测和比较，我们获得了检测结果的变异系数小于10%的证明，说明该方法具有很高的稳定性。我们将T叫ManqPCR方法检测结果与16srRNA测序结果进行了相关性分析，结果较为显著(p<0.05),验证了该方法的有效性。本研究根据Hrrdb数据库设计的靶向微生物群的引物和探针检测到的粪便样本中微生物的相对丰度结果与16SrRNA测序结果相吻合。该研究可以为各种微生物行业提供更高的效益，同时也为临床诊断制定治疗方案提供了快速有效的参考信息。关键词：肠道微生物群；阿克曼氏菌；琼脂糖凝胶电泳；实时荧光定量PCRAbstractTheintestinalmicrobiotainthehumanbodyplaysanimportantroleinmaintainingphysiologicalhomeostasisandprovidinginternalsupportforhumanhealth.Currently,therearetwocommonlyusedmethodsfordetectingintestinalmicrobiota:traditionalcultivationandnext-generationsequencing(NGS).However,thesemethodshavesomeobviousdefects,suchascomplexoperationsteps,longtimeconsumption,lowaccuracy,andhighresearchcosts.Inadditiontothesetwomethods,therearetwoothermethods:fluorescenceinsituhybridization(FISH)andreal-timefluorescencequantitativePCR.ThisarticleaimstodevelopamethodfortargeteddetectionofAkkermansiamuciniphilausingreal-timefluorescencequantitativePCR,whichcanquicklyandefficientlydetectandanalyzethenumberofAkkermansiamuciniphilaunderlow-costconditions.Thisprovidesmoreefficientandmassivedatasupportforthein-depthstudyofAkkermansiamuciniphila.Inordertodesignaprimerprobecombinationwithhighspecificityandsensitivity,thewhole-genomedataofAkkennansiamuciniphilawasretrievedfromtheNCBIdatabase.Theconservedregionofthe16SrRNAsequencewasfound,andthesequencewasalignedusingMEGAsoftware.BasedonthecharacteristicSNPsitesofAkkermansiamuciniphila,aprimerprobecombinationwithstrongspecificitywasdesignedandsynthesizedbyShanghaiBioengineering.Thesamplestestedinthisexperimentwerehumanfecalsamples,whichbetterreflectthecompositionofhumanintestinalmicrobiota.MicrobialgenomicDNAwasextractedusingtheQIAampPowerFecalProDNAKit,andthevalidatedprimerswerefirstusedforordinaryPCRamplificationdetection.Afterverificationbyagarosegelelectrophoresis,qPCRwasusedtoverifywhetheritmettheexperimentalrequirements.AfterselectingthetargetbacterialspeciesintheHITdbdatabase,wedesignedspecificprimersandprobes,andverifiedthatthecoverageofthetargetedbacterialspeciesexceeded70%.Bycomparingliteraturedataandexperimentalverification,wescreenedforintestinalmicrobialmarkergenessuitableforTaqManqPCR,establishedastandardcurve,andachievedrapidquantificationofintestinalmicrobialquantity.Bydetectingandcomparingdifferentsamples,Weobtainedproofthatthecoefficientofvariationofthedetectionresultswaslessthan10%,indicatingthatthismethodhashighstability.WeconductedacorrelationanalysisbetweentheTaqManqPCRdetectionresultsandthe16SrRNAsequencingresults,andtheresultsweresignificant(p<0.05),verifyingtheeffectivenessofthismethod.TherelativeabundanceofmicrobesinfecalsamplesdetectedbyprimersandprobestargetingmicrobialgroupsdesignedaccordingtotheHITdbdatabasewasconsistentwiththe16SrRNAsequencingresults.Thisstudycanprovidehigherefficiencyforvariousmicrobialindustries,andalsoprovidesrapidandeffectivereferenceinformationforclinicaldiagnosisandtreatmentplans.KeyWords：Intestinalmicrobiota;Akkermansiamuciniphila;Agarosegelelectrophoresis;Real-timefluorescencequantitativePCR摘要错误!未定义书签。AbstractI第一章文献综述11.1 肠道微生物群的组成11.2 阿克曼氏菌简介11.2.1 阿克曼氏菌与疾病的关系21.2.2 阿克曼氏菌与饮食的关系21.3 检测方法31.3.1 传统培养法31.3.2 高通量测序技术31.3.3 荧光原位杂交41.3.4 实时荧光定量PCR51.3.5 常用方法优缺点比较6第二章TaqManqPCR检测方法快速检测阿克曼氏菌82.1 材料与设备82.1.1 材料来源82.1.2 主要设备92.2 实验方法102.2.1 样本的预处理102.2.2 DNA浓度检测102.2.3 琼脂糖凝胶电泳102.3 TaqManqPCR检测方法快速检测阿克曼氏菌实验112.3.1 靶标筛选112.3.2 TaqManqPCR检测方法的建立112.3.3 样本DNA提取112.3.4 阿克曼氏菌的TaqManqPCR检测122.3.5 质粒的建立13第三章结果与讨论153.1 引物和探针的设计结果错误!未定义书签。3.2 标准曲线与T叫ManqPCR方法的分析163.2.1 标准曲线的制作173.3 小结18第四章结论19参考文献20致谢22第一章文献综述1.1 肠道微生物群的组成人类微生物组计划(HMP)和人类肠道宏基因组学(MHlT)计划完成后，人们对自身携带的微生物有了清楚的了解。人体中寄居着数万亿微生物，它们的数量超过了人体细胞，二者之比为10：I0而且，人体内的微生物大部分寄居在肠道内，共有1000至2000种之多。因此在每个人的肠道中都有至少100多种细菌，还有一些数量和种类尚未弄清的病毒。它们对人类的生命功能和人体健康发挥着神奇的作用，因为它们具有调节代谢、营养、免疫和保护机体的功能。肠道微生物是一个庞大复杂的群体,种类达500Tooo种,细菌总数达100万亿，是人体自身细胞总数的10倍。人类肠道微生物群由无数微生物相互作用于人类宿主，所有肠道微生物基因的收集代表了一个遗传库，比人类基因组高一个数量级。在某种程度上，它也被认为是人体的“必需器官”。肠道菌群主要是由厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成，其中厌氧菌占99%以上。人类肠道菌群已经鉴定出细菌的几十个门，包括厚壁菌门Firm!cutes')、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(PrOteobaCterid)、放线菌门(A历。teriay梭杆菌11(Fusobacteria)疣微菌门(Verrucoinicrobiay蓝藻细菌门(CyanobaCteria)和螺旋体门(SPiroehaeteS)等。其中厚壁菌门(主要为梭菌属；占所有细菌的50-70%),拟杆菌门(10-30%)变形菌门(/10%),和放线菌门(W5%)。其中最主要的是拟杆菌门和厚壁菌门，占据着超过98%的绝对优势。整个消化道内肠道微生物群的微生物组成各不相同。在胃和小消化道中，细菌种类相对较少。然而，结肠包含一个密集的微生物生态系统，每克肠道物质中约有一千个细胞。个体肠道菌群的组成在门水平是相当稳定和保守的，然而，但在种水平上具有很大的差异。真菌、原生生物、古菌和病毒也存在于肠道菌群中，但对它们的活动知之甚少。1.2 阿克曼氏菌简介阿克曼氏菌是一种革兰氏阴性厌氧粘液层降解细菌，是一种定植于人类和啮齿动物的肠粘膜中的肠道共生体。它被认为是一种很有前途的益生菌候选物。16SrRNA基因序列分析表明，该种属于疣微菌门。阿克曼氏菌在生命的早期定植于人类的肠道，约占健康成人总微生物群的3%O在降解粘蛋白后，它会产生乙酸盐和丙酸盐，它们会作为其他细菌和宿主的底物。目前己知阿克曼氏菌在改善宿主代谢功能和免疫反应方面具有重要价值。此外，它也可能在改进癌症治疗方面具有价值。然而，目前的研究大多集中在阿克曼氏菌与疾病的相关性上，而对它们之间的因果关系知之甚少。对它的干预研究很少且仅限于动物实验，有限的研究探索了其在人体中的安全性和有效性。因此，对它现有知识的批判性分析将为定义它为一种新的有益微生物奠定重要基础。1.2.1 阿克曼氏菌与疾病的关系人体肠道微生物群是一个巨大的微生物群落，在人类生活中起着不可替代的作用。随着研究的深入，肠道菌群对人类疾病的影响逐渐被挖掘出来。肠道菌群失调对人体健康有不良影响，可导致多种慢性疾病。人类肠道微生物群作为人体内最大的微生态系统，与宿主共生，维持正常生理过程处于动态平衡状态。人类肠道微生物群的成分主要包括厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形门四大类。厚壁菌门/拟杆菌门比率是反映转基因疾病的重要参数。此外，人类肠道微生物群的丰度、多样性和均匀性也是反映肠道菌群组成的重要指标。在阿克曼氏菌预防炎症性肠病中的几项研究中发现，健康人和IBD患者的肠道菌群组成存在差异，在IJC患者体内阿克曼氏菌含量显著减少。此外，据报道，阿克曼氏菌或阿克曼氏菌的外膜蛋白可以减轻DSS诱导的小鼠结肠炎。阿克曼氏菌的外膜蛋白在结肠炎中的调节作用与浸润性巨噬细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞和促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-Q、白细胞介素）的减少有关。此外，阿克曼氏菌一定程度上减少了CD1632+结肠炎小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中的巨噬细胞。同时肥胖也与肠道生态失调有关，因为能量消耗和支出之间的不平衡有利于致病菌的流行。其中，由宏基因组的研究表明，阿克曼氏菌的丰度与人类体重呈负相关。对粪便中肠道微生物群的分析表明，与瘦儿童相比，肥胖和超重儿童的阿克曼氏菌的浓度明显降低。1.2.2 阿克曼氏菌与饮食的关系肠道菌群的特点是由于遗传和环境因素的个体间变异。在环境因素中，饮食习惯对肠道菌群组成的调节起关键作用。以西方饮食为主的受试者与以富含纤维饮食为主的受试者的肠道微生物群存在主要差异。根据不同的饮食摄入，肠道微生物群组成的具体变化已经在受试者中得到证实。特定的饮食可能会促进特定菌株的生长，从而导致宿主发酵代谢的改变，对肠道PH值产生直接影响，这可能是致病菌群形成的原因。此外，高脂肪饮食可以促进促炎肠道微生物群的发展，从而增加肠道通透性，从而增加循环中的脂多糖水平”叫同时膳食脂质也通过与肠道微生物群的相互作用影响宿主生理。脂质既作为细菌代谢过程的底物，又通过毒性影响抑制细菌生长，从而影响肠道微生物群UL一个阿克曼氏菌使用源自粘蛋白的碳水化合物，这些碳水化合物由岩藻糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰葡糖胺组成。低聚木糖、低聚果糖、阿拉伯木聚糖和菊糖被称为益生元，又可促进双歧杆菌和乳酸杆菌等有益细菌的生长。长链阿拉伯木聚糖和菊糖可以影响粘蛋白的更高产量，从而导致粪便中阿克曼氏菌的丰度增加。虽然不清楚仅仅一个阿克曼氏菌是否可以降解多糖，但是细菌降解多糖却可能支持阿克曼氏菌的生长。同时低碳水化合物式饮食、生酮式饮食会导致阿克曼氏菌含量的增加从而改变肠道微生物组成。蔬菜、豆类和草药等植物中含有大量植物化学物质，植物或其提取物（包括植物化学物质）对宿主健康和肠道微生物群的影响已得到研究，证明其能够明显引起阿克曼氏菌含量的增加1。1.3 检测方法目前对肠道微生物的检测手段主要有传统培养法、下一代测序技术、荧光原位杂交（FISH）和实时荧光定量PCR四种。1.3.1 传统培养法传统培养法是最早也是最常用的肠道微生物群检测方法之一。这种方法主要依赖于细菌的体外培养和分离培养，不过缺点较多。它的方法步骤繁杂、耗费时间多，而且仅能鉴定材料中的1%左右。该方法是在无菌环境下将待测样品或标本置于无菌的培养基中，使微生物在特定的培养基上生长，通过菌落形态、染色镜检、生化试验等对样品进行分离和鉴定。然而传统培养法只能培养10%30%的肠道微生物回。其中约有40%-80%的肠道菌群都是难以在体外培养的，因此仅靠培养手段会大大削减菌群的生物多样性，并不能反应肠道微生物的真实情况。1.3.2 高通量测序技术DNA测序的创始方法是Sanger双脱氧合成法和Maxam-Gilbert化学裂解方法。Maxam-Gilbert方法是基于DNA的化学修饰和随后在修饰的核甘酸附近的DNA主链的切割。Sanger测序使用缺乏3'-OH基团的特定链终止核苜酸（二脱氧核甘酸）。因此,在“测序”凝胶或自动测序机中分别对没有荧光标记的磷酸二酯键进行检测。虽然对原来的Maxam-Gllbert方法的化学性质进行了修改，以帮助消除有毒试剂，但Sanger合成法（SBS）二脱氧法已经成为了一种测序标准。“下一代”这个术语意味着DNA测序技术的下一步发展，并暗示未来将会出现“下下一代”新技术的命名。鉴于这种命名惯例，对大型基因组进行更高吞吐量的低成本测序的需求，触发了许多第二代或“Nextgen”技术的开发，使用了各种创新方法，除了自动化的Sanger测序之外。与商业化的自动化Sanger测序一样，其中许多技术不再使用。第二代测序方法可以分为两大类，即杂交测序和合成测序（SBS）。SBS方法是Sanger测序的进一步发展，不使用二氧化二脱氧核甘酸末端，结合反复的合成、成像和方法，将额外的核甘酸并入生长链中。乍一看，这些新方法可能很昂贵，但反应通常在小室中以纳升、皮升或ZePtOIiter的体积并行运行，因此每个测序的碱基对成本很小。持续的改进和微型化正在进一步降低成本。下一代测序技术在过去15年中发展迅速，新方法不断商业化。随着技术的发展，基础科学和应用科学的相应应用数量也在增加。其中，杂交测序最初是在1980年代开发的，它使用已知序列的DNA寡核甘酸阵列在滤纸上杂交标记的待测DNA片段,通过重复杂交和清洗掉不想要的非杂交的DNA,就可以确定杂交的标记片段是否与滤纸上的DNA探针序列相即配。因此，可以基于探针杂交点的重叠信息构建更大的连续序列信息。杂交测序已经被大大限制在依赖于使用特定探针来询问序列的技术中，例如在诊断应用中用于鉴定特定基因中的与疾病相关的单核甘酸多态性或鉴定粗大染色体异常。合成测序（SBS）方法采取了几种不同的方法，目前的SBS方法与最初的Sanger测序方法的方法不同，因为它们依赖更短的读数（目前最多约300-500个碱基）o此外，它们通常具有相对于Sanger测序的内在更高的错误率，并依赖于数百万到数十亿短DNA序列读数的高序列覆盖率作为基于一致性序列的准确序列。大多数SBS技术利用一种方法,在该方法中，要测序的单个DNA分子分布到数百万个单独的井或腔中，或者被系在固体基质上的特定位置。然后，在PCR或等温改性“滚动环”扩增方法的扩增下，DNA分子将接受标记的核苜酸的DNA合成反应，或基于特定核甘酸的化学反应可以被成像或以其他方式检测。已经开发了许多创新技术，以实现在单个序列运行中生成数百万个DNA序列读数。序列运行可能持续数小时或几天，具体取决于吞吐量15O1.3.3 荧光原位杂交FISH（原位杂交荧光染色技术）的引入标志着染色体结构和功能研究的一个新时代的开始,它是常规遗传异常诊断的标准技术。作为一种结合了分子和细胞学方法的技术，这种视觉吸引力技术的主要优点在于其独特的能力，可以在保留单细胞水平信息的同时提供介于DNA分析和染色体研究之间的中等分辨率。其准确性和多功能性随后在生物和医学研究中得到了充分利用，提供了大量多样化的应用和基于FISH的诊断试验1。由于简单的FISH程序，可以识别肿瘤特异性异常。其应用范围仅限于设计的探针类型。基因重排，例如ALK,ROSl反映了许多易位伴侣，关键区域的缺失，例如IP和19q,基因融合例如CO融合例DGFB,基因组不平衡例如6p,6q,Uq和扩增例如HER2是个性化肿瘤学的目标。确认遗传标记通常直接提示开始特定的定向治疗。在其他情况下，检测到的异常帮助病理学家更好地区分软组织肉瘤，或者确定最终诊断。尽管许多更复杂的技术可用，例如实时PCR或新一代测序，但FISH仍是许多遗传实验室常用的方法。目前，原位杂交筛查在个性化医学中起到了支持性的作用。通过荧光原位杂交（FISH）主要可以评估一系列被认可的异常：由易位、插入或倒位引起的重排，缺失和增益。在某些情况下，染色体原位杂交（CISH）被引入分子病理学和分子肿瘤学领域。这两种方法的主要区别在于基因组区域标记的方法，是用生物素或地高辛（ClSH）标记还是用荧光标记（FISH）标记，随后使用适当的检测系统。对于标记有生物素的探针，使用与辣根过氧化物酶结合的链霉亲和素（HRP-链霉亲和素）进行检测。FlSH检测是直接的，需要荧光显微镜。基因标记的测试通常在决策患者方面起到关键作用，从患者风险分层到实施适当的治疗。CISH的灵敏度为94.4%,特异性为100%。虽然每种诊断工具，不仅基于杂交，还包括蛋白质表达，如免疫组化（IHC）,都有优缺点，但FISH技术目前被认为是参考方法皿。1.3.4 实时荧光定量PCR定量PCR（Q-PCR）方法现在广泛应用于微生物生态学中，以量化环境中的分类和功能基因标记的丰度和表达。基于Q-PCR的分析将“传统”的终点检测PCR与荧光检测技术相结合，在PCR扩增的每个循环期间实时记录引物的累积。通过在PCR的早期指数阶段检测引物，可以在这些引物与起始模板浓度成比例时量化基因数量。当Q-PCR与前置反转录反应相结合时，可以用于量化基因表达。PCR技术与从环境基质中提取核酸（DNA和RNA）相结合的应用是微生物生态学中无菌培养方法的发展的核心。自从1990年代初期应用以来，这些方法使得分析环境系统中存在的全部微生物群落成为可能，彻底改变了我们对环境中微生物群落结构和多样性的认识。在将环境核酸分离并与随后的PCR扩增结合起来，同时分别对分类和功能基因标记进行DNA指纹图和基于测序的分析，使得未被描述的大部分环境微生物得以描述的方法，推动了新微生物系的发现，并能够描述功能基因标记的基因多样性。尽管最近开发的超高通量测序技术在序列覆盖方面远远超过了基于PCR的序列研究，但PCR能够从域到菌株或类群水平具体定位某些分类或功能标记的能力意味着PCR将成为分子微生物生态学家工具箱中不可或缺的方法。由Honand等人开发的“5'核酸酶酶切试验”适用于通过PCR扩增的环境DNA定量目标16SrRNA基因。此前，由Holland等人开发的5'核酸酶酶切试验与TaqManDNA探针的裂解后荧光检测相结合，使得在每个循环后（实时）可以监测到扩增产物的积累，从而便于定量确定初始模板基因数I。实时荧光定量PCR是一种有前途的工具，可用于研究肠道等复杂菌群组成。该方法的发展可以带来对肠道菌群组成、与饮食的关系以及其在健康和疾病中的作用的全面了解。这对于益生菌和益生元功效的临床评估提供了有用的工具。此外，TaqMan检测方法主要用于肠道微生物菌群评估。该程序已被用于粪便样品中双歧杆菌和一些双歧杆菌群的定量检测，以及在胃肠粘膜中定量肠道杆菌和普通类杆菌实验。基于SYBRGreenI的检测方法也已被用于PCR定量肠道双歧杆菌种或群。总之，实时荧光定量PCR是一种十分有用的工具，可以提供有关肠道菌群组成的深入了解，帮助我们更好地理解肠道健康和疾病之间的关系。1.3.5 常用方法优缺点比较表1.1常用检测肠道微生物方法的比较Table1.1Comparisonofcommonmethodsfordetectingintestinalmicrobes检测方法时间（h）成本（元/个）优点缺点传统培养法48216100普及度高，操作简单只能培养少量的肠道微生物，检测周期长，并且无法检测未知微生物荧光原位杂交723502800可以确定目标微生物的位置与数量只能检测到少量的菌群，成本较高，且存在探针选择性和杂交效率等问题16SrRNA测序721688001000分类覆盖范围广泛、功能分析准确，可以检测未知的肠道微生物物种检测周期长，且存在变异或缺失的情况，可能存在误识别和漏检，需要对相关序列很熟悉杂交测序244880可以基于探针杂交点的重叠信息构建更大的连续序列信息被大大限制在依赖于使用特定探针来询问序列的技术中合成测序2472（具体取决于吞吐量）500它们通常具有相对于Sanger测序的内在更高的错误率依赖更短的读数（目前最多约300-500个碱基），并依赖于短DNA序列读数的高序列覆盖率作为基于一致性序列的准确序列TaqManqPCR235成本低廉，操作简单易上手，准确度高，灵敏性强，可以检测到种需高灵敏度的检测设备第二章TaqManqPCR检测方法快速检测阿克曼氏菌2.1 材料与设备2.1.1 材料来源本实验所有粪便样本在沈阳医学院附属二四二医院科教科的辅佐下由消化内科采集。采集的样本对应人群男女比例为L1,年龄在22-45岁之间，样本未被尿液或污水污染，且存放于-80,通过干冰运输。试验符合赫尔辛基宣言的规定，所获得的所有数据均是保密的，只有研究人员和参与者才能根据要求访问这些数据。参与者均已告知研究的性质，生物样本的使用以及在研究前提供书面知情同意书。并且本试验已经得到了沈阳医学院附属二四二医院伦理委员会的批准。利用QIAampPowerFecalProDNAKit粪便微生物DNA提取试剂盒提取粪便微生物DNA。表2.1主要试剂Table2.1Experimentalmaterials主要试剂生产厂家QIAampPowerFecal上海凯杰企业管理有限公司ProDNAKit粪便DNA提取试剂盒异丙醇上海BBI生命科学Tris饱和酚溶液上海生工生物工程股份有限公司热启动多重扩增试剂盒KAPA凝胶回收试剂盒OMEGA4SGreenPlus无毒核酸染料上海BBI生命科学琼脂糖BioFroxxTrisDiamondEDTABioFroxx醋酸上海生工生物工程股份有限公司GHAampPowerFecaIProDNAKitProcedurePrepare sampleAdd stool sample o PowerBeod Pro Tub Add Solution CDICell IysitABoch to VOdeX Adopter or place ino Powertyzer 24 Homogenizer or into TissvetyMr IlHomogQnizgInhibitor RemovolTechnologyAdd Solution CD2Bind DNAWoAAddSolutionCD3LoodintoMBSpinColumnWoshwi*SolutionEAWashwlSolutionC5日gI«EIVtwithSoMiooC6图2.1试剂盒使用流程2.1.2 主要设备表2.2主要设备耗材Table2.2Mainequipmentconsumables设备耗材生产厂家超净工作台苏州安泰空气技术有限公司恒温水浴锅北京大龙兴创实验仪器股份公司金属浴北京大龙兴创实验仪器股份公司实验室雪花制冰机厦门国仪科学仪器有限公司低温离心机Eppendorf常温离心机Eppendorf低速离心机北京大龙兴创实验仪器股份公司涡旋振荡仪北京托摩根生物科技有限公司高通量组织研磨仪北京鼎昊源科技有限公司超微量核酸检测仪DeNovix核酸电泳仪北京六一生物科技有限公司凝胶成像仪Bio-Rad切胶仪上海生工生物工程股份有限公司移液枪Eppendorf电子天平OHAUSPCR仪Bio-Rad1.5mL>2mL无菌离心管上海BBI生命科学15mL、50mL离心管NESTBiotech2.2 实验方法2.2.1 样本的预处理a.使用电子天平称取（Hg粪便，放入2mL无菌离心管中，然后将其放在冰上。b.向每个粪便样品中加入ImLlnhibitEX缓冲液，连续涡旋直到粪便样品完全均质。C.将样品离心14,000转/分钟处理1分钟，使粪便颗粒沉淀。如果上清液中仍然可见颗粒，则再次离心样品。d.加入25L蛋白酶K到新的2mL无菌离心管中。e.加入600L上清液到含有蛋白酶K的2mL无菌离心管中。f.加入60（）L缓冲液AL并涡旋15秒。必须将样品和缓冲液AL充分混合，形成均匀的溶液。g.放入金属浴70孵育10分钟。短暂离心以去除管盖内部的液滴。h.向裂解物中加入600L乙醇（96-100%）,并通过涡旋混合。短暂离心以去除管盖内部的液滴。2.2.2 DNA浓度检测取1.5LDNA溶液加入到Denovix超微量核酸检测仪，定量提取方法DNA浓度和A260A280o使用Denovix荧光核酸检测仪对DNA浓度精准定量。2.2.3 琼脂糖凝胶电泳1 .在电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液后，准确称取一定量的琼脂糖干粉，加入到合适体积的锥形瓶中。2 .加入一定量的电泳缓冲液（约30ml的1×TAE）,放入微波炉中加热融化，冷却片刻（不烫手即可）后加入1L的染料。3 .摇晃混合融化后的琼脂溶液并倒入电泳槽中，等待其凝固。4 .等待3040分钟左右室温下凝固，小心地拔出梳子，取出凝固好的凝胶放入电泳槽内，并在胶面上方约Imm处倒入足够的电泳缓冲液，去除胶孔内的气泡，准备上样。5 .将5L的DNA样品加入1L的上样缓冲液(Ioadingbuffer)中，混匀后加入凝胶孔中。6 .上样完成后，接通电源，红色正极，黑色负极，DNA样品会被带往正极，加样孔侧为负极。7 .设置电压为IOoV,恒流为400mA,40分钟后关闭电源。在凝胶成像仪上观察样本位置并比对marker判断大小。2.3TaqManqPCR检测方法快速检测阿克曼氏菌实验2.3.1 靶标筛选通过人类肠道宏基因组公共数据库(GMrePO：https:/gmrepo.humangut.info./home)获得大量阿克曼氏菌样本的数据，并在出现频率和相对丰度的条件下对样本数据进行筛选，得出所需的流行物种列表，选择目标靶标分类群。2.3.2 TaqManqPCR检测方法的建立为了识别针对特定肠道微生物群的引物和探针，需要分析基因序列以识别在给定群体中高度保守的区域以及足以将该群体与肠道微生物组的其他成员区分开来的区域。首先使用NCBI设计引物和探针。在选择每个靶标的特定保守区序列后，通过Ncbi-BLAST算法获得所选基因序列的物种特异性，并设计参数比如引物长度、探针长度、扩增子长度、熔解温度、GC含量等，以获得更高的成功率。为了提高TaqMan探针的稳定性、特异性和灵敏度，每个探针至少应包含4个锁定的特异性碱基。接着使用PCR与qPCR扩增验证引物和探针的稳定性与特异性。通过BLAST搜索将扩增的序列与相应的微生物基因组进行比较，验证引物和探针的靶向微生物的覆盖度。使用PCR扩增验证引物的特异性，反应体系为50L(最终体积)的PCR混合物，由上游下游各lL弓|物(终浓度0.4M)、25LMix(2xTaqPCRMix,Vazyme)和lpg50ngDNA模板组成。得到PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳验证目的条带，再通过qPCR检测多重反应中所有引物的稳定性。2.3.3 样本DNA提取1 .将PowerBeadPro管简短离心，以确保珠子沉淀在底部，添加大约250mg的粪便和800L的CDl溶液。简短涡旋混合。2 .将PowerBeadPro管水平固定在VortexAdapter上，用于1.5-2mL管，以最大速度涡旋10分钟。(注意：如果同时使用VorteXAdaPter进行12个以上的准备，请将涡旋时间增加5-10分钟。)3 .将PowerBeadPro管以15,000Xg转速离心1分钟。4 .将上清液转移到干净的2mL微离心管中，在添加200L的CD2溶液后进行涡旋处理5秒钟。（注意：预计500600L0上清液可能仍然含有一些粪便颗粒。）5 .以15,000Xg转速离心1分钟。为避免颗粒过多，将最多700L的上清液转移到干净的2mL微离心管中。（注意：预计使用为500-6（X）L0）6 .在管中添加600L的CD3溶液，并涡旋5秒钟。7 .将650L的裂解物加载到MBSpin柱上，并以15,000Xg转速离心处理1分钟。8 .再次将所得物加载到MBSPin柱张，以确保所有赤潮已通过MB旋转柱。9 .小心地将处理后的MB旋转柱放入干净的2mL收集管，操作中要避免将任何流体溅到MB旋转柱上。10 .向MB旋转柱中加入EA溶液500l后，以15,0（X）Xg转速离心操作1分钟。IL丢弃流体,并将MB旋转柱放回同一2mL收集管中，向MB旋转柱中加入500lC5溶液并以15,00OXg转速离心操作1分钟。12 .丢弃流体，并将MB旋转柱放入新的2mL收集管（附带），以高达16,000xg转速离心操作2分钟。小心地将MB旋转柱放入新的1.5毫升洗脱管（附带）。13 .向白色过滤膜中心加入50-100lC6溶液，以15,00OXg转速条件离心操作1分钟。14.丢弃MB旋转柱。将所得DNA进行保藏处理。（注意：由于C6溶液不含EDTA,建议将DNA冷冻保存。）QIAampPowerFecalProDNAKit可以从粪便和肠道样本中分离微生物和宿主基因组DNA,为粪便DNA的提取提供一种专有的方法，即使是最困难的粪便类型，也能有效去除PCR抑制剂。实验时，每份粪便样本称取0.2g用于提取DNA。提取后测量DNA浓度，并储存在20"C以便进一步分析。2.3.4阿克曼氏菌的TaqManqPCR检测使用CFXConneCtTM荧光定量PCR检测系统（BioRad）并在0.1mLPCR八连管（NEST）中进行反应。引物和TaqMan探针的序列见表2.3。每个样品设置两组平行实验，反应总体系为20L（AnimalDetectionU+ProbeMasterMix,0.4M引物，0.2MTaqMan探针和1L模板DNA）。所有qPCR反应均通过以下热循环程序进行：37,2分钟（此步使用UDG酶,建立PCR防污染体系，保证PCR扩增结果的准确性）；9530s；9510s,60r30s,40次循环。通过qPCR获得的基因扩增水平显示为与初始DNA浓度成反比的CT值。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，通过获得的样品Ct值，从标准曲线上计算出该样品的拷贝数。CF