红薯康王5号的茎尖脱毒研究.docx

目的研究红薯康王5号的组培脱毒方法及脱毒检测技术。方法以红薯康王5号植株为材料，使用不同培养基对红薯康王5号茎尖培养，筛选出最佳诱导分化培养基，培养后获得脱毒红薯康王5号植株。通过指示植物检测法，对组培红薯不定芽叶进行病毒检测。结果表面消毒效果最佳的方法是通过用自来水冲洗20分钟，在75%的乙爵中处理30s,用0.1%的升汞浸泡10分钟后，再用无菌水冲洗8次的消毒方式，它能取得较好的灭菌效果并降低污染率；最佳诱导愈伤分化培养基是MS基本培养基+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.2mg/L蔡乙酸(NAA)+0.5mg/L茉氨基喋吟(6-BA),愈伤诱导率可达92.3%；最佳诱导不定芽分化的培养基是MS基本培养基+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.2mg/L蔡乙酸(NAA)+0.5mg/L茉氨基喋吟(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3),不定芽诱导率可达92.3%；最佳诱导不定根分化的培养基是MS基本培养基+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.1mg/L蔡乙酸(NAA)+0.4mg/L芾氨基口票吟(6-BA),不定根诱导率可达84.6%；病毒检测结果表明组培红薯不定芽脱毒率为80%,脱毒效果符合预期。结论为红薯康王5号脱毒苗工厂化生产提供理论依据和技术支撑。关键词：红薯；茎尖；脱毒；病毒检测；指示植物检测法AbstractObjectiveTostudythemethodanddetectiontechnologyofIpomoeabatatasLamKangwangNo.5.MethodUsingtheIpomoeabatatasLamKangwang5plantasthematerial,thebestinduceddifferentiationmediumwasselected,andthevirus-freeIpomoeabatatasLamKangwang5plantwasobtained.TheleavesofIpomoeabatatasLamweredetectedbyindicatorplantdetection.ResultsThebestmethodforsurfacedisinfectionisbywashingwithtapwaterfor20minutes,Wastreatedin75%ethanolfor30s,After10minutesofimmersionin0.1%litersofmercury,Thenrinsing8timeswithsterilewater,Itcanachieveabettersterilizationeffectandreducethepollutionrate;ThebestinducedcallusdifferentiationmediumwasMSbasicmedium+30g/Lsucrose+6.0g/Lagar+0.2mg/Lnaphthaleneaceticacid(NAA)+0.5mg/Lbenzysinopurine(6-BA),Calliinductionratecanreach92.3%;TheculturemediumforoptimalinductionofbuddingdifferentiationwasMSbasicmedium+30g/Lsucrose+6.0g/Lagar+0.2mg/Lnaphthaleneaceticacid(NAA)+0.5mg/Lbenzysamoprine(6-BA)+0.25mg/Lgibberellin(GA3),Theinductionrateofadventitiousbudcanreach92.3%;ThebestmediumtoinduceadventitiousrootdifferentiationwasMSbasicmedium+30g/Lsucrose+6.0g/Lagar+0.1mg/Lnaphthaleneaceticacid(NAA)÷0.4mg/Lbenzysinopurine(6-BA);Thevirustestresultsshowedthatthedetoxificationrateofhistculturesweetpotatowas80%,Thedetoxificationeffectwasinlinewithexpectations.ConclusionProvidetheoreticalbasisandtechnicalsupportforthefactoryproductionofIpomoeabatatasLamKangwangNo.5virus-freeseedlings.Keywords:IpomoeabatatasLam;stemtip;detoxification;virusdetection;indicatorplantdetectionmethod摘要IABSTRACTII1 .绪论11.1 红薯价值以及常见病害和危害11.2 植物脱毒技术研究进展11.3 植物病毒检测方法进展21.4 课题研究目的、内容和意义32材料与方法42.1 材料42.1.1 材料42.1.2 试剂耗材42.1.3 仪器工具42.2.1 不同消毒方式的比较42.2.2 不同激素浓度配比对红薯茎尖愈伤组织诱导影响52.2.3 不同激素浓度配比对红薯不定芽分化影响52.2.4 不同激素浓度配比对红薯不定根分化影响62.2.5 脱毒效果检测方法63结果与分析83.1 不同表面消毒方法对茎尖染菌率的影响83.2 不同激素浓度配比对红薯茎尖愈伤组织诱导的影响83.3 不同激素浓度配比对红薯不定芽分化的影响103.4 不同激素浓度配比对红薯不定根分化的影响H3.5 脱毒检测结果124讨论及结论144.1 讨论144.2 结论14攻读学位期间的研究成果16参考文献17致谢191.绪论1.1 红薯价值以及常见病害和危害红薯(IPomoeabatatasLam.)又名地瓜、红苕、朱薯、红芋等，属旋花科，一年生或多年生草本块根植物。红薯是我国主要且高产的粮食作物之一，其营养丰富。富含多糖、胡萝卜素、膳食纤维、花青素、维生素和钾、铁、铜、硒、钙等10余种微量元素以及8种氨基酸，被誉为最均衡的健康食品，同时它也是重要的工业原料及饲料。红薯属于碱性食品，吃红薯有利于人体的酸碱平衡。同时吃红薯还能降低血胆固醇，防止心脑血管病等“现代病”。随着红薯低糖、低热、低脂肪的营养学特性及抗癌保健作用被消费者认知，世界范围内的“红薯热”日盛一日，使红薯种植业与加工业都有了快速发展*«!未找到引红薯适合在高温、短日照的环境下种植和生长，它的适应性强，抗逆性强，节水耐瘠薄，而且产量比较稳定。然而，在实际生产中，红薯会受到病虫害的感染。红薯的主要病害有：黑斑病、薯瘟病、软腐病、藤切病、根腐病和病毒病，其中病毒病对红薯的影响很大。目前，影响红薯作物生长的病毒病有30多种。而产生病害、影响红薯质量和产量的主要因素是病毒。其中以羽状斑点病毒(SPFMV)、潜伏病毒(SPLV)、静脉病毒(SPVMV)和G病毒(SPVG)为主，还有两种或多种病毒的混合感染叫据统计，红薯感染病毒后，一般情况下会减产20-50%,每年可产生高达几十亿元的经济损失。因为红薯一旦被病毒病感染，往往会导致其产量、质量和种性发生退化。1.2 植物脱毒技术研究进展植物脱毒的方法主要有：茎尖组培脱毒、热治疗脱毒、病毒抑制剂与茎尖组培相结合脱毒、茎尖组培和热治疗相结合脱毒等。茎尖组培脱毒。茎尖组培脱毒是目前最安全、最有效和最重要的生产无病毒植物的方法，因为它的脱毒效率高而且后代的遗传稳定性比较强。这项技术在国内外早已广泛应用，其中我国在马铃薯、红薯、花卉等植物上应用了此种脱毒方法，并取得了显著的成效。热治疗脱毒。它的基本原理是使病毒失去原本活性，导致植物体内的病毒含量不断降低。因为植物中某些病毒颗粒受热之后会有一定的不稳定性，所以病毒可以使用热处理的方法进行脱毒处理。在经过一段时间后，病毒会慢慢变少，最后自行消失。不同植物，不同品种和不同植物病毒对温度的敏感程度有很大差异。所以针对这种情况，热处理的方法也不同。常用的方法有：（1）热风处理法。（2）温汤浸渍法。这两种方法简单易操作，但容易导致植物材料受损。此外，植物长时间进行热处理，具有钝化植物组织中的阻抗因子的作用，导致植物的抗病毒因子失活。所以，热处理方法的主要缺点是，可能会使植物材料受损，且并非能去除所有的病毒。例如，在马铃薯中，这种技术只能消除卷叶病毒。病毒抑制剂和茎尖组培相结合脱除病毒。即在采用茎尖组培脱毒时，在培养基中加入适量的病毒抑制剂。在不影响植物离体组织生长的情况下，使茎尖中的病毒被抑制，从而使再生的植物组织不含病毒。常用的病毒抑制剂包括孔雀石绿、2,4-D和三醇核营等。其原理是利用病毒抑制剂对病毒的抑制作用。例如，在补充有三哇醇核苜的培养基中培养的马铃薯茎尖能有效地剥离PVX和PVSo茎尖组培和热治疗相结合脱毒。研究表明，如果植物本身带毒较多且此种病毒难以去除，只采用茎尖脱毒这种方法很难完全去除病毒。如果结合热治疗脱毒的方法，可以有效地去除植物中存在的病毒。因此，先进行热治疗处理脱毒，使植物的茎尖基本无毒，再采用茎尖组培方法进行脱毒。1.3 植物病毒检测方法进展常用的植物病毒检验方法有生物学方法、血清学方法、电镜观察方法以及分子生物学方法中的核酸分子杂交技术、双链RNA电泳技术、聚合酶链式反应技术（PCR,RT-PCR,实时荧光定量PCR,多重PCR,巢式PCR）、核酸序列扩增技术、环介导等温扩增技术等。目前红薯病毒的检测方法主要有：（1）症状学诊断法，这种检测方法会受植物不同品种、植物不同生长阶段、植物所在环境因素被限制影响，且植物病毒的隐性症状不容易被检测发现。（2）血清学检测法，这种方法的检测结果是比较准确的。但红薯植物体内存在多种病毒，且几种病毒常常交叉感染。如果采用试剂盒进行诊断，很难判断和检测。正常情况下，检测多种病毒的诊断试剂盒也不易制作。如果病毒没有交叉感染，诊断试剂盒检测病毒的这种方法是可以实现的。但这种脱毒方法适用于大样本，需要的成本也较高。（3）电子显微镜检测法，这种检测方法是目前最理想的检测法。它是一种能够定性检测植物病毒的方法。但这种检测方法技术难度比较大，除了需要专用设备，还需要有专业的技术人员操作设备，要求通常较高。（4）分子生物学检测法，具有准确性高、灵敏度高的特点。但涉及分子方面的实验，采用的技术和方法要求都是比较严格的。它需要有专用实验设备，专业的技术操作人员。实验过程中，各种试剂、试剂耗材和试剂盒成本也很高。(5)指示植物检测法。研究证明，指示植物法的检测结果是比较准确。它的实验过程简单，且实验步骤容易操作。在结果检测时也不需要昂贵的仪器设备，相比于其他几种红薯病毒检测的方法，其成本较低。JamesJohnSOn早在1925年就开始用指示植物鉴定植物病毒。生物学检测法又叫指示植物检测法0o指示植物检测法是植物病毒检测和鉴定的传统方法。其结果可以不使用任何实验设备，用肉眼直接进行观察。此种方法进行的鉴定结果也是比较可靠的，它不仅能准确地反映病毒的生物学特性，而且能够检测出植株体内的未知病毒。目前在国内外都有广泛应用，例如李春敏用黄瓜为指示植物鉴定核果坏死环斑病毒(PNRSV)6。1.4 课题研究目的、内容和意义红薯的种植非常广泛，对当代人民产生巨大经济效益的同时，食用后对人体也有一定的抗癌保健作用。然而，在实际生产中，红薯会受到病毒的感染。基于此，要对红薯植物进行脱毒。在对红薯进行脱毒时，选择的脱毒方法要保证脱毒后，并不改变红薯本身的营养价值。脱毒后的病毒检测也至关重要，在选择检测方法时也要考虑全面。选择简单易操作、实验结果准确和所需成本较低的检测方法进行实验也是非常有必要的。本课题选择的实验试材红薯康王5号是一种新的红薯品种，且之前没有进行相关脱毒实验，所以本实验对其脱毒方法和病毒检测进行研究。对红薯康王5号采用茎尖组培脱毒的方式进行脱毒，选择指示植物检测的方法进行病毒检测，以期达到较为理想的脱毒效果。通过对红薯康王5号进行脱毒和脱毒检测研究，最终为红薯康王5号产业的健康发展建立一种简单、快速、高效、稳定的脱毒方法。本研究的具体内容包括：(1)通过实验探究茎尖不同表面消毒方法对染菌率的影响。筛选出最佳表面消毒方式。(2)通过实验探究不同激素浓度配比对愈伤组织诱导影响，筛选出最佳诱导愈伤形成的培养基。(3)通过实验探究不同激素浓度配比对不定芽分化影响，筛选出最佳诱导不定芽形成的培养基。(4)通过实验探究不同激素浓度配比对不定根分化影响，筛选出最佳诱导不定根形成的培养基。(5)对形成的不定芽进行脱毒检测。2材料与方法2.1 材料2.1.1 材料红薯康王5号由陕西洋县康原生态农业有限责任公司提供；脱毒紫薯苗购自山东亿朵薯苗公司。2.1.2 试剂耗材MS培养基、琼脂、蔗糖、茉氨基喋吟(6-BA)、蔡乙酸(NAA)、赤霉素(GA3)、蒸储水、IMNaOH溶液、IMHCl溶液、金刚砂、0.05mol/LpH7.2的磷酸缓冲液(PBS)O以上试剂耗材均购自西安化学试剂厂。2.1.3 仪器工具超净工作台、灭菌锅、酒精灯、接种刀、银子、称量纸、天平、微波炉、药匙、玻璃棒、滴管、培养皿、PH试纸、滤纸、小烧杯、研钵与研棒、马克笔、纱布。2.2实验方法2.2.1 不同消毒方式的比较取红薯康王5号红薯植株，去掉叶片，剪取茎尖顶端35cm,先用洗衣粉液洗涤5I0min,然后用自来水冲洗20min,再将材料放置在超净工作台上按表1设置的3种方法分别进行消毒处理“L每种消毒处理10个芽，接种7d后统计染菌的数量，计算出染菌率。染菌率=染菌数/接种总数XlOO%表1：不同表面消毒处理方法处理表面消毒方法75%的乙醇30s+0.1%升汞溶液5min75%的乙醇30s+0.1%的升汞溶液8min75%的乙醇30s+0.1%的升汞溶液IOmin2.2.2 不同激素浓度配比对红薯茎尖愈伤组织诱导影响根据参考文献设计以下三种激素浓度配比培养基U3W5U：在MS基本培养基上均加入30g/L蔗糖、6gL琼脂，PH调整在6.0左右。在超净工作台上，取0.5mm茎尖，并将茎尖分生组织接种于培养基进行培养。温度设置在2528,光强调整为2000LX。每日光照12h进行处理，在这种条件下培育诱导愈伤的形成。设计诱导愈伤组织形成的培养基激素浓度配比方案见表2o将红薯康王5号的离体组织接种培养20d后，观察愈伤组织的生长状况。对愈伤组织生长状况进行统计并拍照，并计算出愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率=愈伤组织诱导数/愈伤组织接种总数XlOO%表2：诱导愈伤组织形成的培养基激素浓度配比方案培养基NAA(mgL)6-BA(mgL)M-I0.10.4M-20.20.5M-30.30.62.2.3 不同激素浓度配比对红薯不定芽分化影响研究发现，赤霉素(GA?)能起到促使芽仰长的作用，在培养基中加入赤霉素(GA3)后，可缩短形成不定芽的时间。所以在诱导不定芽生长时，在诱导愈伤组织培养基的基础上加入赤霉素(GA?),保证其快速生长。再根据其他参考文献设计以下三种激素浓度配比的培养基。：在MS基本培养基上均加入30g/L蔗糖、6g/L琼脂，PH调整在6.0左右。在超净工作台上，切取培养的愈伤组织，并将愈伤组织接种于培养基进行培养。温度设置在25。028。(2,光强调整为2000LXo每日光照12h进行处理，在这种条件下培育诱导不定芽的形成。设计诱导愈伤组织形成不定芽的培养基激素浓度配比方案见表3。将红薯康王5号愈伤组织接种30d后观察统计并拍照不定芽生长情况，并计算出芽诱导率。芽诱导率=芽诱导数/接种总数Xloo%表3：诱导愈伤组织形成不定芽培养基的激素浓度配比方案培养基NAA(mg/L)6-BA(mg/L)GA3<mgL)M-40.10.40.25M-50.20.50.25M-60.30.60.252.2.4 不同激素浓度配比对红薯不定根分化影响张迪等通过对泰中11号紫薯的茎尖分生组织研究，发现在诱导泰中11号紫薯形成不定根时，茉氨基喋吟(6-BA)浓度在大于1.0mg/L的情况下，不能形成不定根“3】。郑世英等通过对紫薯济薯18号茎尖分生组织的研究，发现在诱导紫薯济薯18号形成不定根时，蔡乙酸(NAA)浓度为0.1mgL,根和茎生长较快；当苇氨基嘿吟(6-BA)浓度为0.11.0mg/L时,更有利于紫薯济薯18号根和芽的生长。根据以上两篇文献，设计以下三种激素浓度配比的培养基：在MS基本培养基上均加入30g/L蔗糖、6gL琼脂，PH调整在6.0左右。在超净工作台上，切取培养的不定芽，并将不定芽接种于培养基进行培养。温度设置在25°C28°C,光强调整为2000LX。每日光照12h进行处理，在这种情况下培育诱导不定根的形成。设计诱导不定芽形成不定根的培养基激素浓度配比方案见表4o将红薯康王5号不定芽接种30d后观察统计并拍照不定根生长情况，并计算出根诱导率。根诱导率二根诱导数/接种总数XlO0%表4：诱导不定芽形成不定根的培养基激素浓度配比方案培养基NAA(mg/L)6-BA(mg/L)M-70.10.1M-80.10.4M-90.10.72.2.5 脱毒效果检测方法指示植物检测法是利用病毒在其它植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的标准，也称枯斑或空斑测定法。枯斑和指示植物检测法利用受病毒侵染能产生枯斑的寄主植物进行检测病毒，在指示植物叶片摩擦少许金刚砂，然后蘸取汁液涂抹在指示植物的叶片上，5分钟后，用清水清洗。置于室温条件下培养26天，然后观察指示植物，根据指示植物叶片变化表现，观察是否被病毒感染，判断组培的植物是否脱毒。如出现枯斑，褪绿点或花叶等症，断定病毒存在，且枯斑数与侵染病毒的多少成正比1。因此，在本实验中，将待测不定芽的汁液人工接种到紫薯苗的叶片上，26天后观察紫薯苗的叶片变化情况并拍照，计算出脱毒率。脱毒率=未感染叶片数/待检总叶片数XlOO%取10份组培不定芽进行植物病毒检测，方可确定其脱毒率。具体步骤：(1)取13克待鉴定的脱毒不定芽叶片放入研钵中，加入适量的磷酸盐缓冲液(10毫升)，研磨成糊状，用纱布过滤；(2)在指示植物上涂上一层薄薄的金刚砂；(3)蘸取少量不定芽组织液到纱布上，在撒有金刚砂的叶片上摩擦23次；(4)5分钟后冲洗叶片；(5)每隔两天观察接种叶片的变化情况，并记录接种叶片是否发生病害。3结果与分析3.1 不同表面消毒方法对茎尖染菌率的影响实验选择0.10%的升汞和75%的酒精作为主要的灭菌剂I12叫研究升汞不同浸泡时间对消毒效果的影响，结果如表4所示。根据各处理结果对染菌率的影响，采用自来水冲洗20分钟，加75%的乙醇浸泡30s,再加0.1%的升汞浸泡，最后用无菌水冲洗8次的消毒方式，用于红薯康王5号消毒处理，随着升汞处理时间的延长，染菌率呈现下降趋势，染菌率降为10%。表5：不同表面消毒方法对茎尖染菌率的影响处理接种数污染数染菌率()104401022010110注：染菌率=染菌数/接种总数XlOO%3.2 不同激素浓度配比对红薯茎尖愈伤组织诱导的影响在MS培养基中加入生长调节剂制成诱导愈伤分化的培养基，而愈伤分化培养基的成分及其浓度是影响诱导率的关键，浓度过高过低会延迟甚至无法出现愈伤组织，导致诱导率降低”加2叫为了避免这种状况，需选出最合适的培养基，在添加不同浓度蔡乙酸(NAA)、苇氨基喋吟(6-BA)的培养基上进行红薯茎尖组培脱毒，达到预期的结果。由表1可知，激素浓度配比为0.2mg/L蔡乙酸(NAA)+0.5mg/L节氨基噪吟(6-BA)的培养基愈伤诱导率最高，诱导率为92.3%,激素浓度配比为0.3mg/L蔡乙酸(NAA)+0.6mg/L茉氨基喋吟(6-BA)的培养基愈伤诱导率最低,诱导率为80%。培养基接种总数(株)愈伤诱导数(株)愈伤诱导率()M-I121083.3M-2131292.3M-310880.0注：愈伤诱导率=愈伤诱导数/接种总数XloO%由图1可知，M-1、M2、M3培养基处理均可诱导出愈伤，其中M-I和M2培养基中形成的愈伤组织是属于松脆型的愈伤组织。愈伤组织块比较大，有多个大细胞团，且易分散成多个单细胞。单个细胞之间具有较大的细胞间隙，细胞排列疏松无序。这种愈伤组织块后续容易处理，是最适合培养成不定芽的材料。相反，M-3培养基产生紧密型的愈伤组织，愈伤组织块较小且没有较大的细胞间隙,细胞之间通过果胶质紧密的连接，而不易分散。D图1：不同激素浓度配比对红薯茎尖愈伤组织诱导的影响A0.1mg/L蔡乙酸(NAA)+0.4mg/L芳氨基喋吟(6-BA)激素配比接种进去的茎尖离体组织B0.2mg/L泰乙酸(NAA)+0.5mg/L羊氨基喋吟(6-BA)激素配比接种进去的茎尖离体组织C03mg/L蔡乙酸(NAA)+0.6mg/L苇氨基喋吟(6-BA)激素配比接种进去的茎尖离体组织D0.1mg/L蔡乙酸(NAA)+0.4mg/L节氨基嚓吟(6-BA)激素配比诱导形成的愈伤组织E0.2mg/L蔡乙酸(NAA)+0.5mg/L羊氨基喋吟(6-BA)激素配比诱导形成的愈伤组织F0.3mg/L蔡乙酸(NAA)+0.6mg/L苇氨基口票岭(6-BA)激素配比诱导形成的愈伤组织3.3 不同激素浓度配比对红薯不定芽分化的影响将生长调节剂加入MS培养基中，制成诱导不定芽分化的培养基。不定芽分化培养基的组成成分及激素浓度配比对诱导不定芽的形成具有重要影响。浓度过低会出现愈伤组织无法分化成芽，浓度过高会出现黄花现象，导致诱导率降低。结果表明，M-4、M-5、M-6培养基处理均可诱导出不定芽，其中M-5即0.2mg/L蔡乙酸(NAA)+0.5mg/L茉氨基喋吟(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)的激素配比是诱导出不定芽的最佳培养基。表7：不同激素浓度配比对红薯不定芽分化的影响培养基接种总数(株)芽诱导数(株)芽诱导率()M-410880M-5131292.3M-612975注：芽诱导率=芽诱导数/接种总数XIOo%由图2可知，在M-4和M-5培养下形成的不定芽生长状态最好，其中M-5培养形成的不定芽数量多且芽大，并且其叶片舒展，叶色及芽点颜色较深。而M-6培养形成的不定芽生长状态较差，其不定芽数量少且芽小，叶色及芽点颜色也很浅。图2：不同激素浓度配比对红薯不定芽分化的影响AO.lmg/L泰乙酸(NAA)M).4mg/L节氨基喋吟(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)激素配比接种的愈伤组织B0.2mg/L蔡乙酸(NAA)+0.5mg/L不氨基噪吟(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)激素配比接种的愈伤组织C0.3mg/L蔡乙酸(NAA)+0.6mg/L苇氨基喋吟(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)激素配比接种的愈伤组织D0.1mg/L泰乙酸(NAA)+0.4mg/L节氨基口票吟(6BA)+025mg/L赤霉素(GA3)激素配比诱导形成的不定芽E0.2mg/L蔡乙酸(NAA)+0.5mg/L苇氨基喋吟(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)激素配比诱导形成的不定芽F0.3mg/L蔡乙酸(NAA)+0.6mg/L节氨基喋岭(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)激素配比诱导形成的不定芽3.4 不同激素浓度配比对红薯不定根分化的影响在MS培养基中加入生长调节剂制成不定根分化的培养基，而不定根分化培养基的成分及其浓度是影响诱导率的关键，浓度过高过低会延迟甚至无法出现不定根，为了避免这种状况，需选出最合适的培养基。结果表明，M-7、M-8、M-9培养基处理均可诱导出不定根，其中M-8即0.1mg/L蔡乙酸(NAA)+0.4mg/L平氨基喋吟(6-BA)的培养基激素浓度配比是诱导出不定根形成的最佳培养基。表8：不同激素浓度配比对红薯不定根分化的影响培养基接种总数(株)根诱导数(株)根诱导率()M-712975M-8131184.6M-9121083注：根诱导率=根诱导数/接种总数XlO0%由图3可知，在M-8和M-9培养下的形成不定根是生长速度最快，而且有大量根毛生成。其中M-8形成不定根的根毛数量最多，根茎较粗而且颜色也较深。而M-7形成不定根的根毛数量少，根茎细且颜色很浅。图3：不同激素浓度配比对红薯不定根分化的影响A0.1mg/L泰乙酸(NAA)+0.1mg/L苇氨基喋吟(6-BA)激素配比接种的不定芽B0.1mg/L蔡乙酸(NAA)+0.4mg/L苇氨基噪吟(6-BA)激素配比接种的不定芽C0.1mg/L禁乙酸(NAA)+0.7mg/L羊氨基噪吟(6-BA)激素配比接种的不定芽D0.1mg/L泰乙酸(NAA)+0.1mg/L苇氨基喋吟(6-BA)激素配比诱导形成的不定根E0.1mg/L蔡乙酸(NAA)+0.4mg/L羊氨基喋吟(6-BA)激素配比诱导形成的不定根F0.1mg/L蔡乙酸(NAA)+0.7mg/L节氨基噪吟(6-BA)激素配比诱导形成的不定根3.5 脱毒检测结果把不定芽组织液用人工接种的方法接种到干净且无枯斑，无褪绿点或花叶等症的指示植物紫薯苗叶片上。2-6d后，观察指示植物紫薯苗。发现有2片叶子出现枯斑，褪绿点或花叶等症，如A所示。其余涂抹不定芽组织液的8片叶片没有出现病症，如B所示。由表9知，脱毒率为80%。表9：脱毒后芽诱导率待检数(片)未感染数(片)脱毒率(%)810感染数(片)80注：脱毒率=未感染叶片数/待检总叶片数XloO%如图4中A所示，2片叶子出现枯斑，褪绿点或花叶等症，断定这两片叶子存在病毒。其余涂抹不定芽组织液的8片叶片没有出现病症，如B所示，表明无病毒存在，即脱毒成功。图4：脱毒成功与未脱毒成功检测对比结果图A表示指示植物出现圆形枯斑的叶片，即脱毒未成功B表示指示植物未出现圆形枯斑的叶片，即脱毒成功4讨论及结论4.1 讨论有研究表明，甘薯茎尖分生组织的再生效果受蔡乙酸(NAA)、茉氨基喋吟(6-BA)等激素的影响较大仇2叫阮先乐等通过对甘薯品种豫薯12的茎尖分生组织的研究，发现诱导豫薯12再生的最佳培养基是MS÷0.3mg/L苇氨基噂吟(6-BA)+0.01mg/L蔡乙酸(NAA),此时茎尖萌芽率为80.4%123许泳清等研究发现，福薯604茎尖组培成苗的最佳培养基为MS+1.2mg/L茉氨基嘿吟(6-BA)+0.1mg/LNAA+0.1mg/L赤霉素(GA3),其茎尖组培苗萌芽率为93.3%°。邱鹏飞等以烟薯26号和烟紫薯3号为试验材料，发现烟薯26号和烟紫薯3号较适宜的茎尖诱导培养基为MS+1.5mgL(NAA)12叫这些研究结果表明，在不同比例的激素浓度和不同红薯品种下，茎尖诱导率和生长速度存在较大差异。另一方面，查阅文献并对比后发现，本研究中得到的愈伤组织诱导率、不定芽诱导率和不定根诱导率都高于前人的大部分研究，说明本研究设计的激素浓度比例比较适合于红薯康王5号茎尖的组织培养。茎尖分生组织培养是脱毒最主要的一种方法。朱红彩等研究发现，剥离的茎尖越小，所带病毒越少，获得无病毒植株的概率就越大，但诱导成活的难度大RS。如果剥离的茎尖越大，所带病毒越会增多，获得无病毒植物的概率就很小，不能实现脱毒。所以，在切取茎尖时，要注意大小适宜，且必须靠近它的生长点，才能保证有高的成活率和较低的污染率。本实验采用茎尖组织培养的方法对红薯康王5号进行脱毒，并用指示植物检测法进行脱毒后的病毒检测。检测后得出脱毒率达到了80%,整体实验结果符合预期。在实验中，两种或者两种以上的脱毒方法更能保证脱毒的有效性，同理两种或者两种以上的脱毒检测技术也能保证脱毒结果的准确性。所以在之后的红薯脱毒研究中，将会结合其他脱毒方法和更加先进且易操作的脱毒检测技术进行病毒检测。从而逐步提高红薯康王5号植株的脱毒率，研究更加适宜红薯康王5号的高效脱毒技术。为红薯康王5号品种的高效脱毒及生产应用提供参考依据。4.2 结论本研究通过设计不同表面消毒方式，不同质量浓度的蔡乙酸(NAA)、茉氨基噂吟(6-BA)和赤霉素(GA3)的比例，研究适合诱导红薯康王5号形成愈伤组织、不定芽和不定根的培养基激素浓度配比方案。从而使红薯康王5号能快速有效脱毒，并利用指示植物检测法去检测脱毒效果。本研究结果表明，表面消毒效果最佳的方法是通过用自来水冲洗20分钟，在75%的乙醇中处理30s,用0.1%的升汞浸泡10分钟后，再用无菌水冲洗8次的消毒方式，用于红薯康王5号消毒处理，染菌率为10%；在各激素配比差异不大的情况下，蔡乙酸(NAA)、茉氨基喋吟(6-BA)和赤霉素(GA3)激素处理下培养的红薯康王5号愈伤组织诱导率、不定芽诱导率和不定根诱导率均高于75%,其中MS+0.2mgL蔡乙酸(NAA)+0.5mg/L茉氨基喋吟(6-BA),愈伤诱导率最高，可达92.3%；MS基本培养基+0.2mgL蔡乙酸(NAA)+0.5mg/L茉氨基噂吟(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)处理后，芽诱导率最高，诱导率为92.3%；MS基本培养基+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.1mg/L蔡乙酸(NAA)+0.4mg/L茉氨基喋吟(6-BA)处理后，根诱导率最高，诱导率为84.6%；此外，用指示植物检测法检测其脱毒效果，检测结果显示，脱毒率为80%。本研究的目的是建立适合红薯康王5号的有效脱毒技术方法，为红薯康王5号健康脱毒种苗的培育和绿色高效生产提供科学的技术支持。攻读学位期间的研究成果2021年11月参与项目“珍稀濒危药用植物太白贝母种子生理生化的研究”O获得由教育部高等学校大学生物学课程教学指导委员会，教育部高等学校生物科学类专业教学指导委员会举办的“第六届全国大学生生命科学竞赛省级三等奖”。参考文献1张桢,周志疆,赵敏蓉等.鲜食红薯脱毒苗高效、快速繁殖的关键技术浅析J.现代农业研究,2021,27(12):117-118.2陈益华，钟志凌，贺正金等.甘薯脱毒苗的快速繁殖与生产技术J.长江蔬菜，2009(14):9-113张振臣.河南省甘薯脱毒技术研究现状及展望UL河南农业科学,2009(09):64-66+74.4郑世英,耿建芬,贾海慧等.紫薯济薯18号脱毒苗的芽诱导及快繁技术研究J.现代农业科技,2017(15):24+26.5刘振伟,植物脱毒技术技.中国果菜,2005(01):23-24.6宋宗淼.甘薯病毒的2种指示植物检测法J.安徽农业,2000(01):23.7迟惠荣,毛碧增.植物病毒检测及脱毒方法的研究进展J.生物技术通报,2017,33(08):26-33.8陶源,吴兴泉.植物病毒检测方法的研究进展J.分子植物育种,2017,15(07):2901-2906.9周淑芹,朱光新.电子显微镜技术在鉴定筛选马铃薯无毒核心材料中的应用UL黑龙江农业科学，1996(06):17-20.10张希太，张彦波，肖磊等.指示植物检测甘薯病毒技术的改进研究J.西南农业学报,2014,27(04):1509-1513.11韩艳，曹丽，李闯等.马铃薯吉科6号茎尖脱毒及组织快繁研究J.农业与技术，2023,43(03):6-9.12丁文雅.植物组织培养脱毒技术与检测方法UL农业科技通讯,2009,No.447(03):75-77.13张迪,张星辰,姜孟琪等.紫薯脱毒苗的组培快繁技术研究LH.现代园艺,2018(17):18-19.14关崇梅，秦静远，徐志英等.甘薯茎尖分生组织培养与快速繁殖技术研窕J.中国农学通报，2004,(04):33-35.15陈益华，钟志凌，贺正金等.甘薯脱毒苗的快速繁殖与生产技术UL长江蔬菜，2009,(14):9-11.16杨婷.大丽花组织培养与脱毒技术研究D.河北农业大学,2014.17刘洋,陶春来,崔绍玉等.甘薯脱毒苗快繁技术J.现代农村科技,2021(02):23.18吴凡,陈闽,刘佳等.甜薯脱毒苗快速繁殖技术J.江苏农业科学,2020,48(12):36-3919于永学,张丹,杨红等.不同甘薯品种茎尖脱毒与快繁特性分析J.河南农业,2017(28)：53-54.20陈玉霞,邱建辉,张朝臣等.甘薯茎尖脱毒培养技术研究J.安徽农业科学,2016,44(13):135-137+219.21秦梅,张燕,徐美恩等.甘薯茎尖脱毒及组培快繁技术J.安徽农业科学,2014,42(32):11238-11239+11258.22康明辉,刘德畅,海燕等.甘薯脱毒技术的原理及方法J.种业导刊,2010,No.175(01):14-15.23胡琳琳,王雁楠,卞倩倩等.甘薯郑红23号高效脱毒技术探讨J.山西农业科学,2022,50(09):1249-1255.24阮先乐，陈璨.甘薯茎尖分生组织培养及快繁技术的研究J.周口师范学院学报,2015,32(02):94-96.25许泳清，李华伟，邱永祥等.甘薯新品种茎尖培养及病毒检测技术J.福建农业科技，2020(12):52-56.26邱膨飞，柳璇，商丽丽等.不同浓度NAA对甘薯茎尖诱导植株再生的影响J.学,2017,45(03):159-160.27何新民，蒋菁，唐洲萍等.甘薯茎尖培养与脱毒技术研究J.广西农业科学,2009,40(8)：964-968.光阴荏苒，大学生活即将结束，四年的学习生活使我受益匪浅。以前总感觉毕业来日方长，但此已到眼前。关于大学的这个故事始于2019秋，终于2023年夏，我会永远记得那个初秋，也不会忘记这个初夏。站在毕业的门槛上，此时我接受了我提笔写致谢的时刻，我也将慢慢诉说这个难忘的故事，并将它小心珍藏于心。值此毕业论文完成之际，我谨向所有关心，爱护，帮助我的人表示最衷心的感谢和祝福。“明师之恩，诚为过于天地，重于父母多矣。”首先，我要感谢我的导师陈克克老师。在这几年的师生相处中，不管是学习还是生活，都给了我宝贵的意见。在论文的选题，撰写和修改的过程中，陈老师都非常认真负责，一直严格要求，并督促我完成我的论文。老师严谨的治学态度，勤奋的敬业精神，对科研的不断追求是我学习的楷模。老师的每一次督促，每一次指导都让我受益匪浅。毕业在即，在此谨向您表示我最衷心的感谢，同时祝您工作顺利，一切顺心。“谁言可草心，报得三春晖。”其次，感谢我的父母，在这个普通的家庭下，他们的付出和支持是我人生路上最大的底气，父母的鼓