茯砖茶中真菌的分离鉴定.docx

茯砖茶中真菌的分离鉴定摘要：【目的】探究茯砖茶中优势真菌的种类及形态学特征，为茯砖茶发花过程中实现人工干预促进优势真菌生长，提高茯砖茶品质，实现标准化生产提供理论依据。【方法】本实验以茯砖茶“发花”过程样(第9d)作为实验材料，通过真菌分离纯化技术对茯砖茶中的真菌进行分离纯化，平板培养进行菌落形态学观察、ITS区域序列同源性比对与系统发育分析方法对其进行聚类鉴定。【结果】结合形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，将分离纯化得到的6种真菌鉴定为：金花菌(Aspergilluscristatus)、琉球曲霉(AspergillusIuchuensis)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、皮落青霉(PenicilliumCrUStoSUnI)、灰绿曲霉(ASPergUIIUSglaucus)>黑曲霉(ASPergilIUSniger)【结论】茯转茶“发花”过程样(第9d)中优势真菌主要集中于曲霉属、青霉属真菌，以上种属的特定作用，促进了茯砖茶独特风味品质的形成。关键词：发花；优势真菌；形态学特征；ITS序列分析IsolationandidentificationoffungiinFuBrickteaAbstract:ObjectiveToexplorethespeciesandmorphologicalcharacteristicsofthedominantfungiinFuBrickteatea,soastoprovideatheoreticalbasisforartificialinterventiontopromotethegrowthofthedominantfungi,improvethequalityofFuBrickteateaandachievestandardizedproduction.(MethodInthisexperiment,thesampleofthetlooming,processofFuBricktea(No.9D)wastakenastheexperimentalmaterial.ThefungiinFuBrickteawereseparatedandpurifiedbythetechniqueoffungiseparationandpurification.Thefungiweregroupedandidentifiedbythemethodsofcolonymorphologyobservation,ITSregionalsequencehomologycomparisonandhylogeneticanalysisinplateculture.(ResultsCombinedwiththeresultsofmorphologicalidentificationandmolecularbiologicalidentification,thesixfungiisolatedandpurifiedwereidentifiedas:AspergillusCriSlaIus、AspergilIus山ChUenSis、AspergillusOryZac、Pcnicilliumcrustosum>Aspergullusglaucus、Aspergillusniger.tConclusionThedominantfingiinthellblooming,processofFuBricktea(No.9D)weremainlyAspergillusandPenicilliumfungi.ThespecificeffectsofthesefungipromotedtheformationoftheuniqueflavorqualityofFuBricktea.Keywords：Hairflower;Dominantfungi;MorphologicalCharacteristicsJTSsequenceanalysis弓I2材料与方法21 .1实验材料22 2实验主要试剂22.1.1 培养基制备22.4.3 真菌的形态学观察32.4.4 菌株ITS序列分析33数据处理44结果与分析54.1 *fa»54.2 菌株的分子生物学鉴定94.3 鉴定最终结果105讨论11参考文献13致谢错误!未定义书签。1引言茯砖茶，是种紧压黑茶，最先产自陕西泾阳，后发展至湖南、浙江、四川等地，距今已有600多年历史。茯砖茶因其砖身内要通过特定环境控制和培养一种被称为“冠突散囊菌”的黄色菌落，具有特殊的保健功效和独特的品质特征，并作为“边销茶”家族的特殊成员而闻名于世。微生物大量参与茯砖茶的后发酵过程川，这些微生物有的本来存在于茶叶表面，有的是在后期加工工艺中自然生长的。茯徜茶的后发酵工艺与其它黑茶稍有不同，主要分为2个阶段：一是黑毛茶阶段，刚采摘的鲜叶通过系列工艺制成黑毛茶。渥堆是该阶段的主要工艺，是湿热作用、微生物及其胞外酶的共同作用。二是发花阶段，黑毛茶经过汽蒸、压制成型、发花等工艺步骤形成茯砖茶。发花是茯砖茶加工的独特工序，决定着获豉茶中优势菌的种类和数量,其实质是在一定的温湿度条件下，破内优势菌一一冠突散囊菌（俗称“金花”）大量生长繁殖，它们进行物质代谢及分泌胞外酶进行酶促作用，形成茯砖茶独特的风味品质。长期饮用茯砖茶有益于人体健康叫如抗氧化、助消食、调节血脂、减肥、逆转动脉粥样硬化、促进肠道健康等"L历来学者对茯砖茶中微生物的种名、生长特性及生物学特征均进行过一定研究，但获砖茶产地众多，除湖南以外，四川、浙江、陕西等省也产茯砖茶，所以对于不同产地茯成茶之间占主导作用微生物的研究并不够全面。近年来茯砖茶中微生物的研究主要集中于湖南产区的样品，陕西产区的研究还比较少，而茯砖茶最早于陕西泾阳自然“发花”成功，其得益于其环境中的天然微生物，以及适宜真菌生长繁殖的气候、水质、温度、湿度等自然条件阴。曾经有“离开了泾河的水、关中的气候、陕西人的技术不能制”的“三不能制”的说法U%更加印证茯砖茶作为陕西地理标志性产品的独特性。为此，本实验以陕西产区内的茯砖茶“发花”过程样为研究对象，通过真菌分离纯化培养技术对茯砖茶中的真菌进行分离纯化，再通过菌落形态学观察、分子鉴定技术对其进行聚类鉴定，以期能够了解陕西产区茯砖茶“发花”过程中优势真菌的种类及形态学特征，进一步研究不同地域品种茯砖茶之间优势微生物的差异及其品质形成机制,为促进茯砖茶市场统标准的建立和新产品的开发提供理论依据。/ 批注11：大标IS在加个/3.数据处理2材料与方潴2.1 实验材料茯砖茶“发花”中期样（第九天）（100Og）2.2 实验主要试剂葡萄糖、琼脂、硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、七水合硫酸镁、氯化钾、蔗糖等，均为分析纯。乳酸酚棉兰染色液，析标科技有限公司。2.3 实验主要仪器与设备表1主要仪器名称TablelMaininstrumentname仪器名称型号生产厂家立式高压蒸汽灭菌器LDZX-50L上海申安医疗器械厂超纯水器UPD-I-IOT四川优普超纯科技有限公司电热鼓风干燥箱DHG-9I45A上海一恒科学仪器有限公司超净工作台SW-CJ-2F济南森亚实验仪器有限公司生化培养箱SPX-150B上海力辰邦西仪器科技有限公司超凡型小容量恒温培养振荡器SPX-200B上海世平实验设备有限公司数控超声波清洗器KQ-250DE昆山市超声仪器有限公司生物显微镜XSP-8CA上海佑科仪器仪表有限公司数码显微镜ED388DI麦克奥迪（厦门）精密光学有限公诃电子天平BSA22O2S赛多利斯科学仪器（北京）有限公司2.4 实验方法2.4.1 培养基制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯去皮，挖去芽眼，洗净，切片，取200g置于IoOOmL蒸镯水中，文火煮沸30min,双层纱布过滤后加入葡萄糖20g、琼脂20g再次煮沸（过程中需不断搅拌），加蒸播水在IL容量瓶中定容，121C灭菌20min°普通察氏培养基：取IOoOmL蒸储水文火煮沸后加入NaNo33g、KH2PO31g、硫酸亚铁0.01g、MgSO47H2O0.5g、KCl0.5g>蔗糖30g、琼脂20g使其完全溶解后，加蒸储水定容至IoOomL,121C灭菌20min°2.4.2真菌的分离纯化温琼英州对于茯砖茶中真菌最适生长条件的研究表明，茯砖茶中真菌在28C,自然PH的PDA培养基中长势最佳n（1）称取IOg茯砖茶茶样（有肉眼可见金花菌部分），放入装有玻璃珠的三角瓶中，加入90mL无菌水在恒温振荡培养器中以180rmin振荡30min,洗脱茶叶中附着的菌体。将去除茶叶的洗脱液制成浓度为10的菌悬液，取5支试管分别编号1-5依次放入试管架，吸取IOmL至灭菌的1号试管，再从1号试管吸取ImL悬液至2号试管加入9mL无菌水混匀制成浓度为IO-?的菌悬液，依次操作至5号试管，获得浓度为10到IO。的菌悬液，每个梯度分别用移液枪吸取（吸取前先将菌悬液混匀）200HL菌悬液涂布于PDA固体培养基平板上，倒置于28C恒温生化培养箱中避光培养6d。（2）采用三点法对稀释平板涂布后长出真菌菌落进行多次分离纯化培养，直至平板只长出同一种形态的真菌菌落并对其进行编号，每天观察菌落的生长状况并根据中国真菌志及真菌鉴定手册对其种属进行初步鉴定。（3）对已经在培养皿上长出单个纯菌落的菌株,在超净工作台中用接种环挑取少量菌丝接种在PDA斜面培养基上，转移至生化培养箱中培养5d后，于4的冰箱中保存，并根据实验进程，定期进行继代培养。2.4.3真菌的形态学观察从PDA斜而培养基中挑取纯菌落，接种在普通察氏平板培养基上，于生化培养箱中28'C,培养13d,每天观察菌落形态特征，并对菌落的大小、颜色、质地、光泽度、隆起状态、边缘特征等形态学特征做好记录。培养57d时，挑取菌落用乳酸酚棉兰染色液染色6min后通过光学显微镜与数码显微镜进行形态学观察。2.4.4菌株ITS序列分析用三点法对菌株进行纯化培养7d后，挑取少量菌落，接种于PDA斜而培养基中，于生化培养箱中避光恒温培养，直至长出明显菌落，送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。（1）真菌基因组DNA的提取（CTAB法）参照Saghaii和GUOI闾等的方法，取足量的纯化真菌置于无菌的研钵中，加入适量石英砂和PVP,倒入液氮充分研磨后，将研磨物转移至eppcndorf（2mL）管中，65C预热Ih,加入3%的CTAB（ImL）,在65的恒温水浴锅中保温50min;取上清液700UL,转移至2mL的EP管中，加入等体积的氯仿轻轻颠倒混匀多次，4下，12000Vmin离心IOmin,重复抽提1次，转移上清液于新的EP管中，加入2倍体积的无水乙醇混匀，于-20冰箱中静置30min,4°C下，12000rmin离心IOmin；除去上清液，于EP管中加入800UL乙醇（75%）,轻轻颠倒EP管几次，除去上清液。重复上述操作2次，将沉淀物置于超净工作台中风干：向风干的EP管中加入适量（30UL）的去离子水溶解DNA,获得的DNA,于-20C的冰箱中保存备用。PCR扩增百采用通用引物（见表2）对真菌进行序列扩增，具体反应流程：94C预变性5min；94变性30s、58退火30s、72延伸30s,循环30次；最后72C延伸IOmin,PCR反应体系（见表3）表2PCR扩增引物序列Table2PrimersforPCRamplification菌种待扩增序列引物名称引物核酸序列ITSl5,-tccgtaggtgaacctgcgg-3,真菌ITSITS45,-TCCTCCGCTATTGATATGC-3'表3PCR反应体系Table3PCRreactionsystem试剂用量/UL10×PCRbuffer2.5dNTP2.0Primcr-F0.5Primer-F0.5模板DNA0.5Taq.(5U-L-l)0.25ddH2O18.753数据处理将经过基因测序得到的基因序列整理后，在NCBI数据库中使用Blast进行核酸-核酸的同源序列比对，对测序菌株进行屈种归类，取相似度97%及以上的2个序列作为鉴定参考序列。用MEGAZO软件构建供试菌与参考菌的系统发行树,选用邻接法(Neighbor-joining,NJ),用自展(BOolStraP)做验证进化树分析，随机自检率设置为1000,其余保持默认设置“明得到的进化树通过iTOL(InteractiveTreeOfLife)进行修饰。4结果与分析注：A、B:菌株在PDA培养基上的正面、反面：C、D:菌株在普通察氏培养基上的正面、反面；E:菌株的分生电子(IooX)F菌株的产胞结构(IOoX)；G:菌株的子囊果(IooX)；H:菌株的分生抱子(1(X)×)图IBS-13-1菌株的菌落形态特征和显微结构Figure1ColonymorphologyandmicrostructureofBS-13-1strain由图1可知，BS-13-1菌落菌落在PDA培养基上，于28c条件下在生化培养箱中避光恒温培养6d后，菌落正面中心呈黑色，边缘呈黄白色，丝绒状，菌落反面呈橘红色。分生抱子链紧密，分生抱子球形、椭圆形，壁粗糙，长半轴9.23-10.60微米,短半轴8.12-10.12微米。有褐黄色近球形的子囊果,子囊簇生。分生抱子梗，呈枝状，有节点。菌落在普通察氏培养基上生长速度较快，于28C培养5d后，菌落呈淡黄色，质地丝绒状，反面中心呈橘红色，边缘呈淡黄色,无渗出液。经查真菌鉴定手册叩和中国真菌志：第五卷“叫将该菌株初步鉴定为：散囊菌属。正面、反面：E:菌株的分生抱子（40x）：F:菌株的分生胞子链（4（）x）:G：菌株的产胞结构（100x）；H:菌株的分生抱子（IoOX）图2BS-24-2菌株的菌落形态特征和显微结构Figure2ColonymorphologyandmicrostructureofBS-24-2strain反面；E:菌株的分生泡子（40x）；F:菌株的产袍结构（IOoX）；G:菌株的子囊果（IooX）；H:菌株的分生池子（100X）图3BS.41-3菌株的窗落形态特征和显微结构Figure3ColonymorphologyandmicrostructureofBS-41-3strain由图2可知，BS-24-2菌株菌落在PDA培养基上，于28条件下在生化培养箱中避光恒温培养6d后，菌落正面中心呈灰黑色，边缘呈灰白色，纥绒状，菌落反面呈灰白色。分生抱子呈长椭圆形或椭圆形，长半轴8.92-10.01微米，短半轴5.30728微米，分生抱子链呈三角状、长链状。菌落在普通察氏培养基上生长速度较快，于28°C培养5d后，菌落表面呈现灰黑色，质地絮状，反而呈淡灰白色，无渗出液。经查真菌鉴定手册和中国真菌志：第十四卷ML将该菌株初步鉴定为：枝抱属。由图3可知，BS-4I3菌株菌落在PDA培养基上，于28条件下在生化培养箱中避光恒温培养6d后，分生抱子呈椭圆形，长半轴54.57-60.05微米，短半轴40.13-50.78微米，正面呈黄绿色，中心有突起，质地绒状，反面呈微黄白色。有近球形的子囊果，簇生。菌落在普通察氏培养基上生长速度较快，于28°C培养5d后，菌落表面呈现橙黄色，质地絮状，反面呈淡灰白色。经查真菌鉴定手册网和中国真菌志：第三十五注：A、B:菌株在PDA培养基上的正面、反面；C、D:菌株在普通察氏培养基上的正面、反面；E:菌株的分生抱子(40×)；F:菌株的产抱结构(100x);G:菌株的子囊果(100X)；H：菌株的分生抱子(1(X)×)图4BS-25-4菌株的菌落形态特征和显微结构Figure4ColonymorphologycharacteristicsandmicrostructureofBS-25-4strainStructureA注：A、B:菌株在PDA培养基上的正面、反面；C、D：菌株在普通察氏培养基上的IE面、反面；E：菌株的分生抱子(40×)；E菌株的产抱结构(l×);G:菌株的子囊果(100×);H:菌株的分生泡子(00×)图5IiS-H-S菌株的菌落形态特征和显微结构Figure5ColonymorphologyandmicrostructureofBS-11-5strain由图4可知，BS-25-4菌株菌落在PDA培养基上，于28条件下在生化培养箱中避光恒温培养6d后，分生抱子面呈现蓝绿色；中部隆起有晶状物，其他部分近于平坦，菌落中心带絮状；反面呈橙黄色：分生抱子呈现球形，长半轴85.393.10微米，短半轴57.8137.41微米，壁近于平滑；分生抱子链较疏松。菌落在普通察氏培养基上生长速度较缓慢，于28°C培养5d后，分身抱子面呈现灰绿色，质地呈丝绒状，反面呈黄褐色，无渗出液。经查真菌鉴定手册g和中国真菌志：第三十五卷U9,将该菌株初步鉴定为：橘青霉。由图5可知，BS-Il-5菌株菌落在PDA培养基上，于28C条件下在生化培养箱中避光恒温培养6<1后，分生抱子面呈现蓝绿色或灰绿色，质地絮状或丝绒状，因菌核较多而兼颗粒状，边缘呈现白色菌丝，渗出液较多，呈现橘红色，反面中心呈现橘黄色，边缘呈现淡黄色，；分生胞子成链状，聚集紧密呈现球形或椭圆形，较小，壁光滑,长半轴8.31-12.77微米，短半轴9.31-12.77微米，产抱结构呈帚状，分生胞子聚集紧密，子囊果呈现不规则状，其内分生抱子密集。菌落在普通察氏培养基上生长速度较缓慢，于28°C培养5d后，菌落表面呈现淡蓝色或灰绿色，边缘呈现灰白色，无渗出液，反面呈现淡黄色。经查真菌鉴定手册1闭和中国真菌志：第三卜五卷119I将该菌株初步鉴定为：菌核青霉。注：A、B:菌株在PDA培养基上的正面、反面；C、D：菌株在普通察氏培养基上的正面、反面;E：菌株的分生胞子(40x)；F:菌株的抱子分生丝(I(M)X)；G:菌株的产抱结构(100x):H:菌株的分生抱子(100x)图6BS-53-6菌株的菌落形态特征和显微结构Figure6ColonymorphologyandmicrostructureofBS-53-6strain由图6可知，BS536菌株菌落在PDA培养基上，于28C条件下在生化培养箱中避光恒温培养6d后,菌落正面平坦或近于平坦,边缘不规则;质地绒状，有放射状沟纹和同心环纹；分生抱子面呈现暗褐绿色或灰绿色，近于橄榄柠檬色或褐橄榄色；菌丝体灰白色，渗出液缺乏；反面呈现喑褐绿色，有裂纹，可溶性色素缺乏；分生抱子呈现椭圆形或长椭圆形，壁光滑分生泡子梗枝链生，分布紧密，壁粗糙，有节点，且每节长度不均一；长半轴56.17-61.18微米，短半轴16.19-24.08微米，分生抱子菌落在普通察氏培养基上生长速度较快，于28C培养5d后，菌落中心呈现褐绿色，外缘菌丝体呈现灰白色，无渗出液，反面呈现暗褐绿色。经查真菌鉴定手册口刀和中国真菌志：第三十五卷19,将该菌株初步鉴定为：神农架青霉。4.2 菌株的分子生物学鉴定将实验得到的序列上传NCBI数据库使用Blast进行NucleicacidNucleicacid的同源序列比对,分子生物学鉴定结果如表5所示,菌株BSJ31、BS242、BS-41-3和BS-25-4、BS-Il-5BS-53-6的ITS基因序列分析结果系统发育树(Neighbor-jommg!NJ)如图7所示。表4茯将茶发花过程样中真菌的分子鉴定Table4MolecularidentificationoffungiintheprocessofFuBrickteablooming编号NO.最高同源性菌株的基因登录号最高同源性菌株最高同源碱基序列相似度鉴定结果BS-13-1MT582745.1Aspergilluscristatusstrain100AspcrgillusCristatusBS-24-2MH781272.1AspergillusIuchucnsisstrain100AspergillusIuchucnsisBS-41-3HQ285465.1Aspergillusoryzaestrain97AspergillusoryzaeBS-25-4KY172962.1Penicilliumcrustosumstrain99PcnicilliuinCnISloSUmBS-11-5MZ314138.1Aspergullusglaucusisolale99AspergullusglaucusiBS-53-6MT597435.IAspcrgillusnigerisolate99Aspergillusniger4.3 鉴定最终结果通过对真菌PDA培养基菌落形态、普通察氏培养基菌落形态观察以及菌落显微结构观察，根据中国真菌志及真菌鉴定手册，符分离纯化得到的6种真菌初步鉴定为：散囊菌属、枝电属、菌核青霉、神农架青霉、鲜绿青霉、橘青霹。通过结合形态学鉴定结果和ITS测序结果，经过综合分析，最终将分离纯化得到6种菌株鉴定为:BSJ3-1金花菌(ASPCrgillUSCriStaUis)、BS-24-2琉球曲霉(AspergillusIuchuensis)BS-41-3米曲霉(ASPergiHUSOryZae)、BS-25-4皮落青霉(Penicilliumcrustosum)BS-11-5灰绿曲板(Aspergullusglaucus)BS-53-6黑曲霉(Aspergillusniger)。TrMtute: 0.1-4H5K1B61Ae(CrIAAEetatenmrBS-115KMZZZZ241AaperplMy*MmrMZ3141361">MN*m3»BS-13-1I11M451Mc*>M7tth*stvInSrWS*3M三M41ACA中gBS双KYT1*r<J3itM11mu8S-2MM2M1QlPwA11a*Mm0uM(*H*13gZUCMME8$MK27751Aw9u6btmkMMQ28M51Ae*astqSfcan8S4V3i1141(11451c*mecH图76种菌株(BS-B-KBS-24-2.BS-41-3BS-25-4>BS-11-5,BS-53-6)的ITS序列比对系统发育树(NeighbOr-joining,NJ)Figure7ITSsequencealignmentphylogenetictreeofsixstrains(BS-13-l,BS-24-2,BS-41-3,BS-25-4,BS-11-5,BS-53-6)5讨论近年来，随着分子生物学的不断发展和分析仪器的不断改进，分子鉴定技术在茯砖茶中微生物群落结构、种属鉴定等方面已有较多研究口1本实验对茯砖茶发花过程样中分离纯化出的菌株进行测序，结合菌株的形态学特征和显微结构,将6种真菌依次鉴定为金花菌(Aspergilluscristatus),最大相似度为100%、琉球曲客CAspergillusluchuensis),最大相似度为100%、米曲霉(Aspergillusoryzae),最大相似度为97%、皮落青霉(PeniCiHiUmCrUSlosum),最大相似度为99%、灰绿曲霉(4卬“8“$8/刖:”$),最大相似度为99%、黑曲霉(AsPe侬sNger),最大相似为99%。其中金花菌是茯砖茶发花的关键真菌，金花菌除冠突散囊菌外还包括谢瓦式散囊菌(E初irnCheValieri)、阿姆斯特丹散囊菌(Eurotiumamstelodami)、间型散囊菌(EurotiumCristatum)以及肋状散囊菌(Eumhumcostifarnie),由于金花菌种类繁杂，且相互之间基因序列的相似性较高，形态学特征也极为相似，所以本次实验未能确定实验样品中金花菌的具体种类未能确定，只能鉴定到属。刘兰等R2,以安华白沙溪茯砖茶为实验材料，经过H'S序列分析，认为其优势真菌为曲寄属(Aspergillus),推测为谢瓦曲寄。丁婷画以陕西茯砖茶为原料，通过形态学及ITS序列鉴定发现陕西茯砖茶中优势真菌为冠突散囊菌。刘石泉四采用平板梯度稀释法从湖南茯砖茶中分离出了蜡叶散囊菌(E.加广加万”“?)、产紫百喜(P.pujurogenum')产黄青霹(PC力、青霉(PeniCilliUmSP)和酱油曲霉(A.sojae),其中蜡叶散囊菌(EJierbariorimi)是优势金花菌，其余为非优势菌，含量相对少。赵仁亮等因等通过形态学观察、转录间隔区序列(internaltranscribedspacer,ITS)和B-IUbUlin系列的系统发育分析将陕西、湖南茯砖茶中优势菌群鉴定为冠突曲霉(Axristatus),浙江产区茯成茶优势金花菌鉴定为为谢瓦曲霉(A.Chevalien)0伍金金等囱通过ITS序列鉴定，分析得出泾渭茯砖茶发酵过程中微生物种类有冠突曲霉(Aaristatus)、肋状曲露(Axostifonnis)黑曲霉(A.niger)、米曲毒(4也Ze)»以上学者通过传统平板分离鉴定、B-IUbUlin序列鉴定、ITS序列鉴定等多种方法对不同产区获砖茶中的微生物的种类进行了分析，研究结果表明：茯砖茶中主要优势真菌为曲客属、青寄属真菌。本实验中分离鉴定出的6种真菌，基本于前人结果相符合，未能发现特殊真菌。关于分子生物学的鉴定方法还有对NRPS、barcodeorMLST、MALDI-ToF等的差异分析m】，但这些研究目前均有一定的偏差，因此需要寻求更准确、分辨率更高的分子生物学鉴定方法a】。茯砖茶是我国一类特殊的紧压黑茶，关键性工序是“发花”，其目的是促进优势菌冠突散囊菌的生长【28】，本实验通过形态学鉴定和分子生物学鉴定相结合的方式，从茯砖茶发花过程中分离出6种真菌，为了解茯砖茶发花过程真菌种类，实现人工干预，促进状砖茶品质的上升及市场统一标准的建立，具有一定的参考价值。参考文献IZHENGX.HONGX»JINY.ctal.CharacterizationofkeyaromacompoundsandrelationshipbetweenaromacompoundsandsensoryattributesindifferentaromatypesofFuBrickTcaJ.FoodChemistry：X,2022,13(I)：!248.2J姚衡斌,马敬宜,冯瀚瀚等.基于微生物组扩增子ITS的茯砖茶发花特征真菌菌群演替规律分析J中国食品学报,2023,23(01):306-317.311文杰宇,李宗军,王远亮等.黑茶中微生物及其相关保健功能研究进展J食品科学2010,31(09):329.332,(41吕嘉扬,杨柳青,孟雁南等.茯砖茶中金花菌群的研究进展叫.食品科学,2020,41(09):316-322.(5J王茹茹,肖孟超,李大祥等.黑茶品质特征及其健康功效研究进展办茶叶科学,2018,38(02):H3-I24.6刘婷,李颂,张廖等.冠突散囊菌和茯碗茶的健康功效J.食品研究与开发,2016,37(05):208-212.RJ胡治远,赵运林.刘素纯等.不同品种茯醇茶中优势微生物的分离鉴定J,江西农业学报,2011.23(12):60-64.网杨吉/曾祥平.蒲慈坡等,陕西茯砖茶的微生物多样性和群落结构J食品与发酵工业,2020.46(03):50-57.史璐.“泾阳茯砖茶”地理标志法律保护调研报告D.陕西：西北大学,2018.(10王亚丽.茯砖茶“金花菌”分离鉴定及“发花”效应研究D映西科技大学,2018.II温琼英.茯砖茶中主要微生物的研究JL茶叶通讯,1986(04):19-21.(121普聪,刘素纯,达海韬,石月.不同原料及生长因子对冠突散囊菌固体培养特性的影响叫.安徽农业科,2010,38(17):9178-9179+9243.(13 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