数字PCR可行性分析.docx

数字PCR可行性分析数字PCR技术的原理数字PCR(DigitalPCR-dPCR技术是一种新的核酸检测和定量方法,与传统定量PCR(qPCR)技术不同，数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方式具有比传统qPCR更加出色的灵敏度和特异性、精确性,dPCR迅速得到广泛的应用，这项技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面变现出的优势已被普遍认可，而其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面具有的广阔应用前景已经受到越来越多的关注。数字PCR采用的策略概括起来非常简单,就是“分而治之”(divideandconquer)l,这种做法非常类似于计算机科学中的“分治算法”，将一个标准PCR反响分配到大量微小的反响器中在每个反响器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后,通过阳性反响器的数目“数出”目标序列的拷贝数。在实际的数字PCR实验中，事实上是通过呈现两种信号类型的反响器比例和数目进行统计学分析，计算出原始样本中的模板拷贝数。sample partitionedinto many reactionsabsolutequantificationOOOOOOOOOOOOOOOO图1.数字PCR的原理数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态,因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Cl值的鉴定,因此数字PCR的反响受扩增效率的影响大大降低,对PCR反响抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反响体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。数字PCR技术的开展历史从原理可以看出,数字PCR与传统的定量PCR两者皆定位于同样的平台根底一聚合酶链式反响和双链DNA标记技术，但两者采用的是完全不同的定量策略和思想方法，dPCR和qPCR并没有实验方法和思路上的承继关系，从这个角度来说,目前很多人把数字PCR称为第三代PCR技术并不准确。在实时定量PCR技术成熟和开展之前，早在1992年，南澳洲弗林德斯医学中心的科学家使用有限稀释、PCR和泊松分布数据校正模型的方法limitingdilution,PCRandPoissonstatistics,检测了复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因，进行了极其精细的定量研究2,虽然当时这种方法并没有被冠以“数字PCR”之名，但已经建立了数字PCR根本的实验流程,更重要的是了数字PCR检测中一个极其重要的原那么以“终点信号的有或无”all-or-noneendpoint)作为判断标志，这也是之后1999年BenVogelstein和KenKinZIer将之命名为“数字PCR,(digitalPCR)的主要原因13数字PCR技术的原理非常简单,然而在样品分散(divide)的环节上却遇到了无法突破的瓶颈。早期的dPCR尝试使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作为分散反响的载体，或者采用类似流式技术的磁珠乳液扩增方法(BEAMing-Beads,Emulsion,Amplification,MagnetiCS)2006年FlUidigm公司推出了第一台商品化的基于芯片的商品化数字PCR系统。2008年德国Inostics推出基于磁珠法乳浊液扩增和流式检测方式的BEAMingdPCR检测效劳，但这些方法无论在分散程度和数据群体的体量上都无法到达更加精细的要求，时间和耗材本钱严重限制了dPCR技术的开展。近几年来,随着纳米制造技术和微流体技术Sanofabricationandmicrofluidics的开展,数字PCR技术遇到了突破技术瓶颈的最正确契机。1997年KaIinina,、BrownJ,和SiIVerJ使用纳升级芯片进行单克隆模板PCR扩增，获得了美国专利，更重要的是这种采用“电浸润法”进行纳升级芯片制造技术显露雏形I】。伴随二代测序技术开展起来的“油包水PCR-技术，可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴，可以作为dPCR的样品分散载体。QuantaLife利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字PCR技术,这也是最早出现的相对成熟的数字PCR平台,在运行本钱和实验结果稳定性方面都根本到达了商品化的标准。2011年,QuantaLife公司被Bio-Rad公司收购其微滴式数字PCR仪产品更名为QXlOO型号仪继续在市场上销售，这个早期型号为dPCR概念的普及和应用领域的拓展发挥了重要作用。2013年该公司又推出了升级型号QX200。2012年，RainDance公司推出Raindrop型号数字PCR设备，这个设备将其原有的二代测序文库制备平台技术平移到数字PCR技术平台，在高压气体驱动下，将每个标准反响体系分割成包含100万至1000万个皮升级别微滴的反响乳液，该公司的创始人之一Darren1.ink表示这种超高的微滴数目可以为用户”提供更高的检测动态范围,适用于处理更大浓度差异的不同样品工2013年下半年,Life-technologies推出了PCR市场上最新型号的产品。采用高密度的芯片技术，样本均匀分配至20,000个单独的前数字纳升流控反响孔中。QuantStudio3D数字PCR系统，这也是目在整个工作流程中,样本之间保持完全隔离，可以有效地防止样品交叉污染，减少移液过程，简化操作步骤。同时芯片式设计防止了微滴式系统可能面临的管路堵塞问题5。数字PCR技术的应用领域从上世纪90年代以来qPCR技术的爆发式开展使得现代核酸检测技术具有全新的面貌,而进入二十一世纪之后,速度更快、通量更高。本钱更低的DNA测序技术正在迅速开展，也是目前竞争最为剧烈的研究领域之一，即使在这种情况下，dPCR技术仍然以其高度的灵敏性和特异性在诸多科学领域争取到属于自己的一席之地。1 .癌症诊断检测研究说明肿瘤可能通过细胞坏死及凋亡从而释放大量的基因组DNA进入人体系统循环，因此可以通过这些DNA分子的微卫星DNA变化、易位、突变和甲基化等对癌症进行检测。近年来，数字PCR技术被广泛应用到血液、粪便等非侵入性样本分析中，为癌症的检测提供新的途径。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)属于酪氨酸激酶受体,它介导的信号转导途径调节细胞的生长、增殖和分化，大量研究说明，EGFR基因的突变或过表达会导致癌症的发生。Yung等利用数字PCR技术研究非小细胞性肺癌病人血浆和肿瘤中第19外显子框内缺失和第21外显子L858R突变两种ERFR突变体，通过微流体系统对35份血浆样本进行检测，两种突变类型检出率分别为17%和26%,该结果与对肿瘤样本的测序相比，其灵敏度和特异性分别到达92%与100%o随后,Wang等也将数字PCR检测应用到肺癌基因组中EGFR异常的检测中，得出了相同的结论，即数字PCR能够对EGFR突变具有灵敏的检测与精确的定量，适用于肺癌的诊断，对预测治疗反响、监测病情进程及早期抗药性诊断等提供了非常有利的分析手段。在对结肠癌的研究中,Taly等用采集19位病人的血液样本，通过数字PCR分析结果显示其中14例样本检测到KRAS基因突变，1例检出与肿瘤样本不一致的突变,另外5例那么检测不到同时其中5例BRAFV600E突变型全部检测出来。Qi等那么利用数字PCR对直肠癌病人的粪便样本进行mRNA定量分析,在8例病人组织和9例粪便样本中的检出率分别达100%和77%o2 .产前诊断(prenataldiagnosis)产前诊断又称宫内诊断，是指胎儿出生前采用遗传学和影像学等各种检测方法预测其是否有先天性疾病，是预防染色体病患儿出生的主要措施。传统的产前诊断采用侵入性诊断(invasiveprenataldiagnosis)方法，主要包括孕中期的胎儿羊水的产前诊断、脐血的产前诊断，目前常用的取材手术主要有绒毛膜绒毛取样，羊膜腔穿刺，脐带血穿刺等，但这些方法对母体和胎儿均有一定的创伤并存在胎儿丧失风险。而非侵入性产前诊断(non-invasiveprenataldiagnosis,NIPD)那么采用了无创伤的技术方法防止了以上的平安威胁，成为当下引起广泛关注的诊断方法。1997年，Lo等采集孕妇血液进行研究,利用PCR的方法扩增Y染色体特异片段并出现阳性信号，证明母体血液中存在胎儿的DNAt,',自此拉开了NIPD研究的序幕。但是,从大量母体DNA中成功检测到胎儿游离DNA的过程中存在相当大的难度，需要提高检测方法的灵敏度和特异性。2007年，L。等利用数字PCR技术开展了两种策略用于产前诊断胎儿21三体综合症，其一称之为digitalRNA-SNP,检测胎盘细胞特异表达即完全来自胎儿的21号染色体上PLAC4mRNA的SNP位点的比例；其二为digitalRCD法，检测孕妇血液中21号染色体与1号染色体的相对含量，可以检测到血液中25%的胎儿基因山】。Um等I比拟了数字PCR与实时定量PCR、质谱检测三者的灵敏度，发现数字PCR比其他两种方法更为精确，因此，数字PCR检测到胎儿基因的浓度可能要高于预期。随着研究的深入，数字PCR被证明比传统技术方法具有更高的临床灵敏度和特异性，未来该技术在产前诊断领域将越来越被广泛地应用。3 .稀有突变分析在基因组变异研究领域,群体基因组水平上的SNP（SingleNucleotidePolymorphism,单核昔酸多态性检测面临的问题主要是突变序列往往与大量正常序列同时存在，竞争性反响严重影响突变序列的检测精度，数字PCR技术带来的极高的扩增特异性在稀有突变检测方面具有天然的优势，在癌症标志物检测、无创产前检查、线粒体突变检测等研究方向上，我们已经看至UdPCR的许多精彩表现。稀有突变检测对癌症研究具有重大意义。原癌基因或肿瘤抑癌基因的突变累积是促进肿瘤发生的一个重要因素。极少量体细胞的上述突变即足以促进癌症发生或开展。由于上述突变通常只存在于极少量的细胞中,因此需要使用具有高信噪比和低假阳性率的Assayo常用的SNP基因分型技术（如毛细管电泳或实时荧光定量PCR）是最高效的突变检测方法，可以检测突变率不低于20%（约五分之一细胞）的突变细胞。但是，数字PCR能够从野生型背景中鉴别出突变基因，具有更高的灵敏度和精度。数字PCR通过将样本分到芯片的数千个单独的PCR反响中，大大降低了某个反响中的总分子数，从而有效地富集目标序列，并稀释了野生型背景。4 .拷贝数变异（CNV）鉴定拷贝数变异（CNV）是基因座的野生型拷贝数相比参考基因组增加或减少造成的基因组失衡。这些基因组改变从小的（小于IOkb）插入或缺失到大的（超过1Mb）、复杂的多等位基因复制均有。CNV是人类基因组中最常见的遗传变异，与多种疾病有关，包括癌症或遗传性疾病易感性QR因此,我们需要简单可靠的方法定量CNV,用作潜在的生物标记物，并用于了解肿瘤形成的分子机制。目前的CNV评估方法如表1所示。这些方法包括原位杂交，但该方法耗时、费力且结果分析具有主观性I。阵列比拟基因组杂交（aCGH）可以提供更高的精度，但该方法需要大量的操作时间且分辨率取决于所需的阵列类型,161o最近，下一代测序技术的进步使得通过单次运行即可经济高效地检测多种类型的遗传变异成为可能”4最后,在目前所有方法中，实时荧光定量和数字PCR技术提供了最简单的工作流程，可以获得准确的拷贝数结果，且操作时间极短,周转时间较快。«1.常用的CNV评估的分子学方法.原位杂交aCGH下一代能序实时荧光定ItPCR数字PCR说明采用标记探针检测单个固定细胞的DNA序列单独标记以1:1比例混合的单能检测DNA和参照DNA,然后与寡核苛酸点样或BAC眸列杂交高通量测序，然后定位并计数目的序列,泅定绝对或相对拷贝数通过实时监测PCR扩增过程，对无DNA序列进行相对定量将PCR反应样本进行有限稀释，分成很多份,对纪DNA分子进行绝对定量：然后使用标准泊松统计学方法计算浓度样本制备要求细胞保存和切片标准基因组DNA分离方法标准基因组DNA分离方法标准基因组DNA分离方法标准基因组DNA分离方法操作时间极长很长很长很短很短获得结果的时间数天数天数天数小时数小时结果分析主观客观客观客观客观定*精度分辨率-HER2(人表皮生长因子2,又称为ERBB2)是一种原癌基因，在特定的情况下会促进癌症细胞的增殖。原癌基因促进肿瘤发生的机制有三种：(1)染色体重排导致超活性基因融合,(2)编码序列上的点突变或缺失导致超活性蛋白生成,(3)基因扩增导致蛋白质过表达。HER2基因扩增多年来一直被视作早期乳腺癌预后不佳的指标之一，亦是选择早期和晚期癌症最正确治疗方案的关键因素(例如，使用赫赛汀Herceptin®进行HER2蛋白靶向治疗)目前，原位荧光杂交(HSH)和银染原位杂交(SISH)是用于预后情况和药物有效性评估的常规方法。但是上述方法存在诸多缺点，包括冗长繁琐的染色和切片制备过程、需要专业的技术培训、检测本钱较高。同时传统方法在某些具有挑战性的情况下进行结果判断时会引入一定程度的主观因素。皇家萨里郡医院致力于探索采用数字PCR(dPCR)作为SISH的替代方法用于HER2拷贝数检测，以改善技术和本钱。数字PCR将样本模板分散到众多单独的PCR反响器中，其中一局部反响器含有目标分子(已扩增)，另一局部那么不含有目标分子(未扩增，称为阴性)。PCR扩增后，利用阴性反响局部计算样本中目标分子的绝对数量，无需参照标准品，可实现对目标DNA分子的绝对定量。因此，相比目前用于评估HER2基因扩增的SISH方法，该技术能够降低主观性，提升标准化水平，而且可节省超过75%的本钱。5 .MicroRNA前体定量越来越多的证据说明，microRNA是参与几乎所有生物学过程的根本元件。成熟microRNA可介导microRNA依赖性的基因沉默。尽管microRNA前体是microRNA生物发生和加工的根底,但现有的大多数检测方法仍致力于成熟microRNA的检测，针对microRNA前体的检测却很少。microRNA前体检测面临的挑战主要归因于其较低的丰度、必须使用参照转录本，以及序列相似性造成的干扰。1.ifeTechnologies开发的基于硅芯片的QuantStudio3D数字PCR系统可以大大提升mir-9初级前体转录本检测的精确度。检测原代神经细胞培养物中同一microRNA的3个不同的前体-miR-9(Pri-miR-%1、2和-3),结果显示，采用QUantSuIdioTM3D数字PCR系统可以轻松克服传统microRNA前体检测方法面临的挑战。研究证明短期和长期酒精暴露，可以触发培养细胞中miR-9前体的变化。检测可重复性极高，精度范围为1.26-2.33%。其中一种miR-9前体嵌于蛋白质编码的mRNA转录本内，而其他两种前体那么是长的非编码转录本，这些结果说明了数字PCR(dPCR)方法的通用性。数字PCR的市场前景数字PCR是近年来迅速开展起来的一种定量分析技术。迄今为止.已有FluidigmxBio-Rad等几家公司相继推出了数字PCR产品,这些产品已经在单细胞分析、癌症早期诊断和产前诊断等研究领域显示出巨大的技术优势和应用前景。根据全球知名咨询公司Frost&SuIlivan的研究分析师KarolinaOlszewska表示："dPCR的高灵敏度让它成为多个应用的理想选择,包括拷贝数变异、稀有突变检测以及核酸序列的绝对定量。数字PCR因其精确性、重复性以及在诊断和制药应用上的潜力而引起了行业的极大关注。在这一高速增长、前景广阔的市场,Bio-Rad在数字PCR上的投资是富有成效的J据Frost&Sullivan预计z2011-2016年间数字PCR仪器市场将以52%的年均复合增长率增长。Frost&Sullivan发布的美国qPCR和dPCR仪器市场的分析报告指出，美国的实时定量PCR和数字PCR仪器市场正处在不同的增长阶段，但两者都保持竞争活力。尽管qPCR市场很成熟，但其竞争力正在扩张，因为几个大牌的生命科学公司进入此市场,希望扩展它们的基因组学流程方案。同时，新兴的dPCR市场也在快速增长，早期采用者增加，而供给商也在扩展技术应用,以拓宽应用范围。dPCR作为一项新技术，仪器定价仍然较高，让很多实验室望而却步。dPCR目前的客户仅限于制药和生物技术公司，以及一些资金充裕的大型科研实验室。据DeCiBio预计,2016年生命科学仪器市场预计$458亿,中国是最强驱动力。一个高增长的技术领域是数字PCR,该技术的复合增长率将飙升至90%,从2011年1000万美元升至2016年2.5亿美元。数字PCR的操作步骤2013年下半年，Life-technologies推出的QuantStudio3D数字PCR系统采用最简单的工作流程，只需极少的手工操作步骤和极短的操作时间。该系统的核心是一块包括20000个反响孔的硅芯片，每块芯片运行一个样本，在一次实验中可同时分析两个靶点。每个QuantStudio3D芯片试剂盒包括12块芯片及盖子、12个上样刮板和3个浸液注射器及针头。PCR预混液的制备与实时荧光定量PCR反响相同，将TaqManAssay.DNA或cDNA样本以及预混液参加一支试管内混匀步骤1。此外，QuantStudio3D芯片是独立包装的一次性耗材，可最大程度降低样本受到污染的危险。上样刮片也是一次性使用，简化了芯片上样过程。制备好反响混合物后，使用自动芯片加载系统上样，翻开加载系统，将翻开的芯片放置于上样底座上步骤2;将上样刮片置于加载系统臂的固定装置上步骤3；将芯片盖子放置于仪器转臂的固定装置上步骤4；将反响混合物加至上样刮片步骤5；按下按钮，分配器自动将反响混合物分配至芯片的20000个反响孔内步骤6，然后密封芯片步骤7芯片密封剂可以在紫外光下发生固化，密封剂经自动上样设备上的紫外装置激活，对芯片进行密封；密封后可以在带有双平板模块的热循环仪上对芯片进行扩增,在热循环仪上进行扩增需要约2个半小时步骤8；QUamStUdiotm3D数字PCR系统一次读取一块芯片步骤9,需要30秒完成读数在芯片读取过程中，仪器读取芯片唯一的标识符，捕获扩增样本的荧光信号，芯片读数中会捕获所有反响孔的ROX.FAM和VIC通道荧光图像，数据输出为FAM和VIC通道的计数拷贝数/微升；通过ROX信号确认反响孔中是否存在样本；最后，将数据写至用户定义的目标位置一仪器、USB驱动器、联网效劳器等，使用QUantStUdiOTM3DAnalysisSuiteTM现有的软件根块,可以对实验结果进行进一步的数据和图像分析。步骤2步骤3步骤4Fluidigm公司2006年底推出的Bio-MarkTM基因分析系统由Bio-MarkWPCR系统整合了高性能计算机、IFC微液流芯片耗材、IFCCOmrOller将生物样品、反响试剂导入到IFC微液流芯片中和数据分析软件四局部构成。IFC微液流芯片有2种:DynamiCArray48.48动态芯片和96.96动态芯片和DigitalArray(12,765数字芯片和48.770数字芯片。数字芯片将预混液样品与PCR试剂分成数百个单独的PCR反响，开展数字PCR分析。整个过程分为五步：准备芯片；将每个样品预混液移液至芯片的独立入口；将芯片放入IFCController,利用软件界面迫使分析组分进入单独的反响板；将芯片放入BioMark系统，开展热循环和荧光检测；利用分析软件来查看和分析扩增曲线。与上面两者相比，浙大的SPC芯片系统图2采用自吸式分液进样芯片，进样方法简便，无需外源动力。ZJU自吸式分液进样芯片既是耗材又有自动分配反响液的功能。相当于简化了QuantStudio3D数字PCR系统的步骤2-步骤7,也无需像Fluidigm公司一样利用IFCComroller仪器进样。图2ZJU自吸式分液进样芯片本钱分析数字PCR的流程比传统的qPCR更简单，但通量较低,根本每块芯片上千个反响单元都是针对单一样本的分析，而荧光检测技术的局限性限制了多个芯片的同时检测。结论生物学的根底研究和分子技术的前进伴随着更精确和更灵敏的测量技术开展。dPCR具有测量独立性与无需任何校准物的特点。因此，该技术是潜在的核酸测量基准方法，并从原理上为核酸计量提供了保证19。相比其他方法，dPCR作为绝对定量方法能准确定量目标DNA和提供可靠的定量数据4。商业化dPCR仪器（如Fluidigm公司的BioMarkSystem）的大量出现进一步推动和扩大了该技术的开展和应用范围。参考文献:1. 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