布病鉴别诊断标准.docx
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1、Bl5内蒙古自治区地方标准DB羊布鲁氏菌免疫抗体(M5-90426株)与感染抗体鉴别技术IdentificationtechnologyofBrucellaovisimmuneantibody(strainM5-9026)andinfectionantibody(征求意见稿)20XX-XX-XX 发布20XX-XX-XX实施内蒙古自治区市场监督管理局发布本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出并归口。本文件起草单位:内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、内蒙古金迈诗生物科技有限公司本文件起草人:郭宇、王建龙、陈君
2、彦、包玉山、特木尔巴根、萨茹拉、高登军、庄金山、王旭红、武琥琮、马立峰、郝剑锋、陈设。标准名称1范围本文件规定了羊布鲁氏菌免疫抗体(M5-90A26株)与感染抗体鉴别技术的术语和定义、缩略语、仪器设备、试剂、样品的采集、保存与运输、操作方法、结果判定的要求。本文件适用于羊布鲁氏菌免疫抗体(M5-90A26株)与感染抗体鉴别。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T18646-2018
3、动物布鲁氏菌病诊断技术NY/T541-2016兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1布鲁氏菌病BruceIIosis是由布鲁氏菌(Brucella)感染动物和人而引起的一种人兽共患传染病。目前已报道的布鲁氏菌属成员包括6个经典种、5个新鉴定种及部分未确定新种型的非典型布鲁氏菌。布鲁氏菌病在全世界范围内严重威胁动物和人类健康。世界动物卫生组织(WOrdOrganizationofAnimalHealth,WoAH)将布鲁氏菌病列为法定报告传染病,我国农业农村部发布的一、二、三类动物疫病病种名录将布鲁氏菌病列为二类动物疫病,国家卫生健康委员会将布鲁氏菌
4、病列为法定报告乙类传染病。3.2脂多糖Lip。POlySaCCharide,LPS作为布鲁氏菌细胞外模的重要组分,是布鲁氏菌主要病原相关分子模式之一,由寡聚糖核心两端分别连接疏水脂质A或。型多糖抗原组成。LPS作为布鲁氏菌表面最多的抗原结构,机体对其免疫应答产生的抗体是布鲁氏菌病各种诊断方法中的主要检测抗体。3.3膜间质蛋白PeriPlaSmiCProtein,BP26是一种可溶性的具有较强免疫原性的外膜蛋白,可由细胞内向细胞外释放。BP26蛋白的基因具有高度的保守性和免疫原性,是布鲁氏菌基因缺失活疫苗(15-90426株)的缺失基因。3.4酶联免疫吸附试验EnzymeLinkedImmuno
5、sorbentAssay,ELISA指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上,利用抗原抗体反应的高度特异性与酶标记技术相结合,进行免疫反应的定性和定量检测方法。DB4缩略语下列缩略语适用于本文件。4. 1HRP辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase);4.2 TMB3,3,5,5-四甲基联苯胺(Tetramcthylbenzidine);4.3 PBS磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline);4.4 OD光密度(OpticalDensity)o5主要器材4.5 酶标仪(含有45Onm滤光片)。4.6 (371)恒温培养箱。5. 3离心机。5.2
6、 4-20C冰箱。5.3 旋涡振荡器。5.4 可调微量移液器(量程为10100lx20-200lx30300l和1001000u1等),并配备与移液器相匹配的吸头。5.5 96孔酶标板。5.6 血清稀释板。5.7 封板膜。6主要试剂6.1 除规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,实验室用水应符合GB/T6682-2008的规定。6.2 包被抗原按照附录A中A.1配制。6.3 抗原包被缓冲液按照附录A中A.2配制。6.4 PBS(0.01molL,PH值7.4)按照附录A中A.3配制。6.5 封闭液按照附录A中A.4配制。6.6 20倍浓缩洗涤液按照附录A中A.5配制。6.7 样品稀释液按照附录
7、A中A.6配制。6.8 阳性对照按照附录A中A.7配制。6.9 阴性对照按照附录A中A.8配制。6.10 酶结合物按照附录A中A.9配制。6.11 TMB显色液为商品化产品。6.12 终止液按照附录A中A.10配制。7样品采集、保存与运输7.1 样品采集按照NY/T541进行,室温(18-25oC)下倾斜30。静置24h,待血液凝固有血清析出时,置4冰箱过夜,待大部分血清析出即为待检血清,必要时可低速离心(IoOOrmin离心1015minmin)t收集血清。样品采集应符合GB19489-2008规定。7.2 样品保存置于-20C贮存备用,使用前2小时取出解冻,避免血清反复冻融。若分离的血清需
8、当天使用,则置于4。C备用。若需长期保存,应置于超低温冰箱(-70C)。7.3 样品运输样品应置于2C8C保存,立即送至实验室;如果保存超过12h后运输,样品应冷冻(-2(Te)保存。8操作方法8.1 试剂平衡试剂在室温(18-250C)条件下放置至少30分钟,平衡至室温(18-250C)后使用,使用前充分摇匀。8.2 试剂配制将20倍浓缩洗涤液用蒸储水或去离子水进行20倍稀释,即为工作浓度的洗涤液。8.3 样品稀释在血清稀释板中,用样品稀释液将待测样品10倍稀释(即90l样品稀释液中加入10l待测样品),充分混匀,备用。8.4 抗原包被用包被缓冲液将纯化BP26蛋白稀释至0.5gml,将LP
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