特殊医学用途配方食品中低聚半乳糖的测定—离子色谱法编制说明.docx

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1、中国出入境检验检疫协会团体标准特殊医学用途配方食品中低聚半乳糖的测定离子色谱法编制说明南京海关动植物与食品检测中心2023年12月特殊医学用途配方食品中低聚半乳糖的测定离子色谱法（征求意见稿）编制说明一、工作简况1 .任务来源特殊医学用途配方食品中低聚半乳糖的测定离子色谱法是根据中国出入境检验检疫协会团体标准管理办法的规定，经立项评审和公示等程序获得中国出入境检验检疫协会批准立项，“中检协（2023）2号”发文批复的立项号（P/CIQA-126-2023）。本标准由中国出入境检验检疫协会提出并归口，由南京海关动植物与食品检测中心主持编写，协作单位上海安谱实验科技股份有限公司，海南天壮营养工程有

2、限公司。2 .目的意义特殊医学用途配方食品（以下简称特医食品）是为了满足进食受限、消化吸收障碍、代谢紊乱或特定疾病状态人群对营养素或膳食的特殊需要，专门加工配制而成的配方食品，在临床治疗的营养支持中起着重要的作用。最早起源于20世纪50年代美国针对宇航员研发的特殊膳食，70年代逐渐在欧美流行，并相继出台了系列相关标准和配套管理文件。19世纪80年代特医食品开始进入我国，但由于我国特医食品注册制度的不完善以及相关法律法规的滞后，仅以“药品”名义在医院流通，导致我国特医食品产业发展缓慢，大众对特医食品的认知度普遍不高。2016年我国提出“健康中国2030”规划纲要和国民营养行动计划（2017203

3、0年），均明确要开展临床营养行动。我国特医食品产业虽然起步较晚，但产业规模增长迅速，市场总产值已从2016年的25.9亿元增加到2020年的77.2亿元。低聚半乳糖作为天然属性的益生元，能够选择性地促进人体肠道内双歧杆菌等有益菌的增殖，抑制肠道内腐败菌的生长，从而减少有害代谢产物的形成、预防肠癌的发生、防止便秘、降低血清胆固醇含量、促进矿物元素吸收、预防脯齿、增加机体免疫力及改善脂质代谢等多种特定的生理功能在特医食品中具有广泛的应用前景。截止至2022年9月，已被批准注册的88款特医食品中，其中有6款添加了低聚半乳糖。受限于目前国内外没有特医食品中低聚半乳糖的标准检测方法，许多特医企业不能研发

4、添加低聚半乳糖的相关特医产品。亟需建立方便可靠的特医食品低聚半乳糖测定方法，以推动特医产业健康稳速发展。3 .主要工作过程主持单位和协作单位共同完成标准的制定，主要包括以下几个阶段：(1)调研与立项：2022年1月-2022年12月，进行了标准立项征求意见和论证工作，联合提出对特殊医学用途配方食品中低聚半乳糖的测定离子色谱法的团体标准进行制定的立项申请，并于2022年12月立项。随后成立了标准起草工作组，明确了项目负责人，制定了详细的工作计划，开展本标准制定的各项工作。(3)起草标准初稿：2023年1-4月，确定标准制修订方案和工作计划，并开展了方法学验证形成标准初稿。(4)标准修改与完善：2

5、023年5-9月，工作组对标准初稿进行研究讨论和提出修改意见，尤其是针对样品基质、提取方法深入研究，并根据提出的方法，进行新基质的方法学验证，对标准进一步修改和完善，以确保标准具有实用性和广泛适用性。(5)形成征求意见稿：2023年10-12月，根据前期反馈结果，工作组对标准进行修改和完善，形成了本标准的征求意见稿。二、标准编制原则和确定标准的主要内容1 .确定团体标准主要内容本标准遵循GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则进行编写。其主要内容包括：(1)封面：按中国出入境检验检疫协会团体标准对封面的格式要求编写。(2)前言：按国标规定的格式编写。前言表明，本

6、标准的提出并归口单位为中国出入境检验检疫协会；本标准的起草单位为南京海关动植物与食品检测中心，协作单位上海安谱实验科技股份有限公司。(3)标准主体内容：包括范围、规范性引用文件、术语和定义、方法提要、仪器和设备、试剂与溶液、实验方法、结果计算、附录。2 .范围本文件规定了特殊医学用途配方食品中低聚半乳糖的离子色谱测定的方法。本文件适用于特殊医学用途配方食品中低聚半乳糖的测定。3 .试样前处理条件优化(1)试样处理方法优化：液态特医食品液态特医食品前处理过程采用超声提取，简单快捷，分别对比不同超声提取时长对提取效果的影响，结果发现提取时长为5min、Iomin、15min时，结果发现超声提取IO

7、min为最适。对比前处理过程不同提取试剂水、磷酸盐对提取效果的影响，结果发现水或磷酸盐缓冲液提取结果无明显差异，故选取更为简单方便的水作为提取试剂。特医食品一般基质较复杂，特别是全营养特医食品，蛋白质含量较高，有效去除蛋白是前处理较为重要的步骤。本方法采用乙月青沉淀蛋白的方法，分别对比蛋白沉淀试剂用量乙盾：提取液7:3,5:5和3:7,结果表明，5:5沉淀效果最佳，故选取蛋白沉淀试剂用量乙旗：提取液比例为5:5。由于特医食品基质的复杂性，有效去除杂质保证分析试样在离子色谱分析柱中的分离不受干扰尤为重要，对比不同型号净化小柱（HLB、CI8、OnGuardRPlI）评价除杂的效果，结果表明，HL

8、B除杂不够完全，Cl8与OnGUardRPn效果无明显差异，但由于OnGuardRPII使用成本昂贵，故选用更为经济适用的C18净化小柱。对比原料是否需要与样品一同进行前处理，结果表明液态特医食品，仅需将原料过C18小柱净化即可，无需进行提取及蛋白沉淀步骤。粉剂特医食品粉剂特医食品选取60水浴提取更有助于粉剂在提取液中的分散，对比60水浴分别提取IOmin、20min、30min,结果发现增加水浴时长对检测结果没有明显影响。为节省前处理时间、节约能耗，故确定水浴时长为IOmin。对比前处理过程不同提取试剂水、磷酸盐对提取效果的影响，结果发现水或磷酸盐缓冲液提取结果无明显差异，故选取更为简单方便

9、的水作为提取试剂。分别对比蛋白沉淀试剂用量乙睛：提取液7:3,5:5和3:7,结果表明，5:5沉淀效果最佳，故选取蛋白沉淀试剂用量乙睛：提取液比例为5:5。对比不同型号净化小柱（HLB、Cl8、OnGuardRPlI）对除杂的效果，结果表明，HLB除杂不够完全，C18与OnGUardRPIl效果无明显差异，但由于OnGUardRPl【使用成本昂贵，故选用更为经济适用的C18净化小柱。对比原料是否需要与样品一同进行前处理，结果表明粉剂特医食品，需将原料同样品一起进行提取及蛋白沉淀，并过C18小柱净化。4 .仪器条件的优化分别测试低聚半乳糖原料在离子色谱分析柱柱温25、30C、35C时的响应、峰分

10、离效果，结果表明不同温度下低聚半乳糖响应差异不大，考虑到季节变化以及实验室环境，将柱温确定为30（图1）。图130C柱温所得低聚半乳糖谱图三、试验验证的分析、综述报告方法线性关系：以低聚半乳糖为定量外标，在10gmL200gmL浓度范围内,相关系数R2大于0.999,线性关系良好。方法准确度和精密度：该方法的空白样品回收率：液态特医食品为96.5%103.4%、粉剂特医食品为101.6%-104.4%,实际样品6次平行实验结果的回收率RSD在1.0%10%范围区间，说明该方法精确度较好，能够满足特医食品中低聚半乳糖的准确测定。方法重现性：方法验证基础上，起草工作组组织本实验室外的3家实验室进行

11、验证，5名专家签字确认，结果符合验证比对要求。具体方法验证情况见附件一、附件二、附件三。四、技术经济论证，预期的经济效果本标准的制定对国家来说，有助于推进特医食品相关标准健全化；对行业来说，有助于促进低聚半乳糖在特医食品中的应用，实现特医食品行业稳步快速发展；对企业来说，有助于创造更多的经济效益；对普通民众来说，更多的标准规范，可以增强其获得感、幸福感和安全感。五、采用国际标准的程度及水平，与现行有关法律法规和强制性标准的关系无相关国际标准。本标准相关技术要求不低于强制性国家标准的相关技术要求。六、重大分歧意见的处理经过和依据无。特殊医学用途配方食品中低聚半乳糖的测定离子色谱法团体标准起草工作

12、组2023年12月附件一液态特医食品中低聚半乳糖的测定方法学验证1 .专属性为考察空白溶剂（稀释剂）、空白辅料是否存在干扰。以空白溶剂、粉剂特医食品空白样品、低聚半乳糖系列工作溶液分别进行进样分析，记录色谱图（图1图3）O结果表明空白溶剂不干扰测定；空白辅料基本不干扰测定。图2低聚半乳糖50gmL浓度谱图2 .检出限和定量限将低聚半乳糖原料对照品配制成不同浓度进行测试，当浓度为10gmL时，信噪比S/N为4.3,满足SN3;当浓度为20gmL时，信噪比S/N为10.9,满足S/NN10。由此可知，低聚半乳糖离子色谱法检出限为10gmL,定量限为20gmL.* 1 J wOO俗。加。3。IOOM

13、ORst.TimmlnPeekN4rnCTypSrNPoMtOffM(CO)3k)p(cnCurve(C2)CoV.Dt.%2002GOS1OLOW435462016800000999271AVERAGE:461991ao300000900271图310gmL低聚半乳糖谱图及信噪比S R -00 .RLTknminPMkNamoC.TypPoInUOffst(CO)Skp(CDCurw(C2)C811.Dt.%20.2$GOS1OCOff10.9546201680OOOO89271AVERAGE:,fil16803ooo999271图420gmL低聚半乳糖谱图及信噪比3 .线性及范围分别取空白

14、溶剂、系列标准工作溶液进行测定，以低聚半乳糖标准工作液的浓度为横坐标(X),低聚半乳糖特征峰峰面积为纵坐标(y),进行线性回归分析，计算线性相关系数，结果详见表1。表1线性范围标准工作溶液(gmL)梯度02050100150200峰面积038.4591.24176.99257.88336.94线性方程y=1.6803x+4.6214R2=0.9993由上述结果可知，低聚半乳糖离子色谱法在20gmL200gmL浓度范围内，R2大于0.999,线性良好。4 .正确度和重复性在液态特医全营养食品空白基质中进行3水平、6平行的加标实验，同时在液态特医全营养食品实际样品中进行6平行实验，计算实验结果回收

15、率和精密度，以评估方法的正确度和重复性，结果详见表2、表3。表2空白基质的加标回收和精密度结果空白样品含量g100g添加量g100g称样量g检出值g100g回收率R%回收率范围%RSD%0.9520.6196.51.0010.6099.41.0240.59101.4/0.601.0050.5896.596.5703.41.831.0170.59100.21.0210.61103.4100.9100.4101.9101799.8-101.90.8199.8100.01.0090.91102.11.0020.8898.41.0160.91102.30.9098.6-102.31.341.0030.

16、8898.61.0240.88100.21.0060.8998.9表3实际样品的6平行精密度结实际样品含量g100g添加量g100g称样量O检出值g100gRSD%1.0110.881.0210.891.0230.87/01.0160.912.111.0080.881.0010.92以上结果表明，添加量为0.60、0.80、0.90gl(X)g时，回收率均在95%105%之间,回收率良好，符合GB5009.295-2023中不同浓度对方法正确度的要求。附件二粉剂特医食品中低聚半乳糖的测定方法学验证1 .专属性为考察空白溶齐I（稀释剂）、空白辅料是否存在干扰。以空白溶剂、粉剂特医食品空白样品、低

17、聚半乳糖系列工作溶液分别进行进样分析，记录色谱图（图5图7）。结果表明空白溶剂不干扰测定；空白辅料基本不干扰测定。图5空白溶剂谱图图7低聚半乳糖50Ug/mL浓度谱图2 ,检出限和定量限取低聚半乳糖标准工作溶液最小浓度逐级稀释，直至信噪比3:1为检出限；信噪比10:1为定量限。当浓度为3.22gmL,信噪比S/N为3.1,满足Sb3;当浓度为10.37gmL时，信噪比S/N为10.0,满足S/NN10。由此可知，低聚半乳糖离子色谱法粉剂特医食品检出限为3.22gmL,定量限为10.37gmL3.线性及范围分别取空白溶剂、系列标准工作溶液进行测定，以低聚半乳糖标准工作液的浓度为横坐标(X),低聚

18、半乳糖特征峰峰面积为纵坐标(y),进行线性回归分析，计算线性相关系数，结果详见表1。表7线性范围标准工作溶液(gmL)梯度102050100150200峰面积0.99452.01035.121410.073914.821920.1763线性方程y=O.1002x+O.O188R2=0.9997由上述结果可知，低聚半乳糖离子色谱法在10gmL200gmL浓度范围内，R2大于0.999,线性良好。4 .正确度和重复性在粉剂特医全营养食品空白基质中进行3水平、3平行的加标实验，同时在粉剂特医全营养食品实际样品中进行6平行实验，计算实验结果回收率和精密度，以评估方法的正确度和重复性，结果详见表8、表9

19、。表8空白基质的加标回收和精密度结果空白样品含量g100g添加量g100g检出值g100g回收率R%回收率范围%RSD%0.20103.90.190.19101.6101.6-103.90.970.20103.50.39103.6/0.380.39103.0103.0-103.60.240.39103.20.47104.40.450.46102.2102.2-104.40.910.47103.9表9实际样品的6平行精密度结实际样品含量g/100g添加量g/100g检出值RSDg/100g%0.360.35/00.373.790.370.390.35以上结果表明，添加量为0.19、0.38、0.

20、45g/100gM,回收率均在95%105%之间,回收率良好，符合GB5009.295-2023中不同浓度对方法正确度的要求。5 .中间精密度由不同检验员在不同日期，取空白溶剂、供试品溶液进样分析，记录色谱图，以标准曲线法计算供试品溶液低聚半乳糖含量，并计算以上6份供试品溶液与重复性6份供试品溶液的低聚半乳糖含量测定结果的RSD,结果详见表10。表10精密度试验结果检验日期2023.10.312023.11.10含里(g100g)0.360.360.350.340.370.350.370.340.390.350.350.35RSD(%)(n=12)3.9附件三再现性（实验室间方法验证）本方法经

21、过合肥海关技术中心、浙江省检验检疫科学技术研究院、镇江海关综合技术中心等单位，根据标准草案进行实验室间方法验证，对液态特医食品空白基质进行3水平、6平行的加标实验，回收率均在95%105%之间，RSD均V10%,结果符合要求，见表表13。并通过合肥海关技术中心、浙江省检验检疫科学技术研究院、镇江海关综合技术中心、南京众普生物科技有限公司、张家港海关综合技术中心等单位的专家进行方法评价。表11单位A空白基质加标结果空白样品含量g100g添加量g100g称样量g检出值g100g回收率R%回收率范围%RSD%1.0160.7399.21.02730.74101.31.0190.76103.40.75

22、1.0280.75103398.5103.41.581.0060.7498.91.0140.7398.51.010.95101.21.0060.9398.31.0160.94100.4/0.951.0240.93100.198.3101.61.011.0220.94101.61.0080.9398.31.0011.1398.11.0031.1398.91.0311.12100.81.151.0171.15101.798.0103.51.561.0241.16103.51.018IJl98.0表12单位B空白基质加标结果空白样品含量g100g添加量g100g称样量g检出值g100g回收率R%回收

23、率范围%RSD%1.0320.61104.81.0060.60101.41.0280.5695.70.60LOO40.61101.695.7-104.82.951.0190.59100.71.0100.5998.61.0000.7998.81.0120.7999.90.9940.7997.9/0.801.0100.81101.798.8-103.71.701.(X)50.83103.71.0110.81102.51.0140.8999.81.0250.90102.11.0120.92103.90.901.0190.8596.796.7-103.92.461.0170.89100.51.0210

24、.8798.7表13单位C空白基质加标结果空白样品含量添加量称样量检出值回收率R回收率范围RSDg100gg100gggI00g%1.0230.61103.51.0290.5798.41.0060.5896.60.601.0260.5797.596.1-103.52.501.0240.5696.11.0170.59100.01.0200.7798.41.0080.81101.71.0010.7796.5/0.801.0250.7899.696.5-101.71.601.0150.7898.41.0290.78100.11.0100.91102.()1.0130.89100.71.0020.8998.90.901.0230.89100.998.9-102.01.101.0260.89102.01.0280.88100.1