淀粉酶活性测定实验报告.docx

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1、班级：植物092姓名：徐炜佳学号：0901080223淀粉酶活性的测定一、研究背景及目的酶是高效催化有机体新陈代谢各步反响的活性蛋白，几乎所有的生化反响都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的根基。晦活力由薛活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖汁键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为-淀粉酶和B-淀粉酶等。a-淀粉酶和B-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。B-淀粉酶存在于休眠的种子中，而a-淀粉

2、酶是在种子萌发过程中形成的。a-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,a-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之那么易穗发芽。目前,关于a-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不一样,国内外测定（X-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3,5二硝基水杨酸比色法和降落值法。这3种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的a-淀粉酶活性应该分别是延迟（内源）a-淀粉酶、萌动种子a-淀粉酶和后熟面粉的a-淀粉酶活性。测定方法优点缺点DNS灵敏、准确、准确度高,适宜准确测量小样品淀粉酶活性大小测定步骤较繁,不便分析大量样品,测定范围较窄凝胶扩散法简便、快速、省时、省力,消耗材料和药品

3、较少,不需要特殊仪器,测定范围较宽边界不清晰,灵敏度与准确度较低,不适宜准确测量淀粉酶活性的大小降落值法快速、省时、重现性好、平行性好、消耗的药品少,适宜于测量大量样品消耗的材料多,间接测定a-淀粉醐活性大小本实验的目的在于掌握a-淀粉醐和B-淀粉酶的提取和测定方法。二、实验原理萌发的种子中存在两种淀粉酹，分别是a-淀粉前和B-淀粉酹，B-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而a-淀粉前不耐酸，在pH3.6下那么发生钝化。木实验的设计利用B-淀粉醐不耐热的特性，在高温下（70C）下处理使得B-淀粉酶钝化而测定Q-淀粉醐的醐活性。醐活性的测定是通过测定一定量的酗在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的

4、，淀粉防水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者复原生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉砺活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酎的总活性。实验中为了消除非醐促反响引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酹的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酹的作用过程中，四支测定管及空白管不要混淆。三、材料、试剂与仪器实验材料：萌发的小麦种子（芽长1厘米左右）仪器：722光栅分光光度计（编号9906

5、95）DK-S24型电热恒温水浴锅（编号L-304056）离心机（TDL-40B）容量瓶：50ml1,100ml1小台秤研钵具塞刻度试管：15mlX6试管：8支移液器烧杯试剂：1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，参加80ml蒸储水，加热熔解，冷却后定容至100ml）；pH5.6的柠檬缓冲液：A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至IL）B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至IL）取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液；3,5二硝基水杨酸溶液（称取3,5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20mlIM氢氧化钠中，参加50ml蒸谯水，再参加30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸储

6、水稀释至IoomL盖紧瓶盖保存）；麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸储水中，小心移入100ml容量瓶中定容）；0.4MNaOH四、实验步骤1 .酶液的制备称取2克萌发的小麦种子与研钵中，加少量石英砂，研磨至匀浆，转移到50ml容量瓶中用蒸锚水定容至刻度，混匀后在室温下放置，每隔数分钟振荡一次，提取15-20分钟，于3500转/别离心20分钟，取上清液备用,2 .-淀粉酶活性的测定取4支管，注明2支为对照管，另2支为测定管于每管中各加酶提取液液1ml,在70恒温水浴中（水浴温度的变化不应超过土0.5）准确加热15min,在此期间B-淀粉酶钝化，取出后迅速在冰浴中彻底冷却。在试管中各

7、参加Iml柠檬酸缓冲液向两支对照管中各参加4ml0.4MNaOH,以钝化酶的活性将测定管和对照管置于40C（0.5C）恒温水浴中准确保温15min再向各管分别参加40C下预热的淀粉溶液2mL摇匀，立即放入40水浴中准确保温5min后取出，向两支测定管分别迅速参加4ml0.4MNaoH,以终止前的活性，然后准备下步糖的测定。3 .两种淀粉酶总活性的测定取上述酶液5ml于IOoml容量瓶中，用蒸储水稀释至刻度（稀释倍数视样品酶活性大小而定，一般为20倍）。混合均匀后，取4支管，注明2支为对照管，另2支为测定管，各管参加Iml稀释后的酶液及pH5.6柠檬酸缓冲液1ml,以下步骤重复Q-淀粉酶测定的第

8、及第的操作。4 .麦芽糖的测定标准曲线的制作取15ml具塞试管7支，编号，分别参加麦芽糖标准液（ImgZml）O.0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0亳升，用蒸储水补充至LomL摇匀后再参加3,5-二硝基水杨酸ImL摇匀，沸水浴中准确保温5min,取出冷却，用蒸馅水稀释至15ml,摇匀后用分光光度计于520nm波长下比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。样品的测定取15ml具塞试管8支，编号，分别参加步骤2和3中各管的溶液各1ml,再参加3,5二硝基水杨酸1ml,摇匀，沸水浴中准确煮沸5min,取出冷却，用蒸锵水稀释至15ml,摇匀后用分光光度计于52

9、0nm波长下比色，记录消光值，根据标准曲线进展结果计算。五、数据整理及计算麦芽糖标准液浓度mg/mlO0.10.30.50.70.91.0OD520工程a（测）a（测）a（对）a（对）a+（测）a+（测）a+（对）a+（对）OD520平行组数据均值OD52O样品麦芽糖浓度mg/ml上表中前4行数据为实验的原始数据。以表中前两行数据绘制标准曲线（见下页），计算上表中第4行数据（各样品的OD值）均值，填入上第5行中，根据标准曲线的方程，计算第5行OD值所对应的麦芽糖浓度，填入最后一行，如上表。根据以上的数据整理的结果，结合以下公式计算两种淀粉酷的活性：A一一-淀粉醐测定管中的麦芽糖浓度A，一一-淀

10、粉前对照管中的淀粉前的浓度B一一（a-+B-）淀粉前总活性测定管中的麦芽糖浓度B，一一（a-B-）淀粉酹总活性对照管中的麦芽糖浓度计算结果如下：a-淀粉酶活性=（毫克麦芽糖克鲜重分钟（a-+-）淀粉醐活性=亳克麦芽糖克/鲜重分钟）B-淀粉酶活性=毫克麦芽糖克/鲜重分钟力六、结果分析七、思考题1、醐活力测定实验的总体设计思路是什么实验设计的关键你认为是什么为什么答：利用醐的专一性或防活力的影响因素抑制除待测配以外的其它能活性，通过测醐促反响的产率推算酶活力大小。关键在于抑制其它酶的活力而不影响测定防，这样可以减小或防止其它酶产物给测定结果带来的误差。2、本实验最易产生对结果有较大误差影响的操作是

11、哪些步骤为什么若何的操作策略可以尽量减少误差答：浸提步骤。70温度或15min时间控制不严格不准确那么可能导致B淀粉酶未完全钝化使测得活性偏大。应严格控制温度和时间。70水浴后需要立即冰浴，否那么B淀粉酶复性使测得淀粉酶活性结果偏大。向测定管中参加NaOH时应迅速，否那么酶与底物继续反响使结果偏大。3、-淀粉酶活性测定时70水浴为何要严格保温15分钟保温后为何要立即于冰浴中骤冷答：由于-淀粉酶不耐热，在70下处理一定时间可以钝化，严格保温15分钟可以到达理想的钝化效果，时间过长，a-淀粉酶活性也会受到影响；时间缺乏，-淀粉酶钝化不完全。保温后立即骤冷是为了通过剧烈的温变改变-淀粉酶的构造以防止

12、在随后的反响中复性，这样就保证了在随后的40C温浴的酶促反响中-淀粉酶不会再参与催化反响。此外我认为冰浴使酶迅速降温，便于严格控制高温处理时间的长短。4、pH5.6柠檬酸缓冲液的作用各管于40水浴准确保温15分钟的作用答：酶实验体系的PH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。参加pH5.6的缓冲液调至酶促反响的最适pH,同时稳定溶液的PH不至于在反响过程中大幅波动。40水浴准确保温15分钟为调整酶促反响的最适温度5、众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化-淀粉酶的活力而测a-淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化a-淀粉酶活力去测-淀粉酶活力呢这种设计思路说明什么答：B淀粉酶与

13、a淀粉酶的催化特性是有差异的。B淀粉酶主要作用于直链淀粉的a-1,4-糖背键，而且仅从淀粉分子外围的非复原性末端开场，切断至a-l,6-键的前面反响就停顿了；而。淀粉酶那么无差异地作用于直链淀粉与支链淀粉的a-1,4-糖汁键，所以B淀粉酶需要a淀粉酶淀粉支链的a-1,4-糖汁键后才能完全表达其催化能力。此外我认为在实验中温度比酸度更易控制，钝化Q淀粉酶难度远远高于B淀粉酶，而且假设提高酸度钝化a淀粉酶，那么回调最适PH时a淀粉酶也有可能由于复性恢复活力。这种设计思路说明在测定酶的比活力时要综合考虑各种可能出现的酶的性质以及它们之间的联系，也要考虑到实验操作的可行性。6、本实验中所设置的对照管的

14、作用它与比色法测定物质含量实验中设置的空白管有何异同本实验可否用对照管调分光光度计的100%T为什么答：消除非酶促反响（如淀粉酸性环境下加热水解）和非测定时间内的酶促反响引起的麦芽糖的生成带来的误差。两种都是为了消除非测定局部对光的吸收，空白组是为了消除溶液中溶剂等其它组分对光的吸收，而对照管是为了消除非测量所需反响所得的多余溶质对光的吸收。不可，因为标准曲线确实定是在空白的根基上的，得到的是OD值与麦芽糖含量的关系7、我们所测定得到的总酶活力减去所测定得到的a-淀粉酶活力是否就等于B-淀粉酶活力为什么你的结论说明什么答：不等于。因为B淀粉酶和a淀粉酶作用于a-1,4糖昔键，但二者都不能水解支

15、链的a-1,6-糖首键，而我们所测定得到的总酶活力是二者在与R酶的共同作用下测得的酶活力，R酶能够降解支链淀粉，断裂a-1,6-糖昔键,从而增大了B淀粉酶和a淀粉酶可水解的底物浓度，使测得的总活力大于B淀粉酶和a淀粉酶单独作用的酶活力之和。我的结论说明实验时要考虑各种酶协同作用的综合因素七、参考文献生物化学实验指导中国农业大学生物化学实验室中国农业大学自编教材根基生物化学赵武玲中国农业大学出版社3岳海凤L2,都庆炉2,薛香2小麦/淀粉酶活性测定方法比较（1.河南农业大学,河南郑州450002;2.河南科技学院,河南新乡453003）百度百科淀粉酶:/baike.baidu/viewZ2l2965.htm艾志录等不同品种小麦发芽过程中淀粉酶活力变化规律的研究中国粮油学报2006年6月第21卷第3期马永强等玉米萌发过程中淀粉酶性质的研究食品科学294297,2007,Vol.28,No.11