硅纳米线表面的蛋白吸附调节分析研究功能材料专业.docx

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1、目录摘要1Abstract2第一章绪论31.1研究背景31.1.1蛋白与表面相互作用31.1.2硅纳米线的功能51.1.3聚合物表面接枝方法81.2课题的提出9第二章实验部分112.1实验的仪器和药品112.2.突变体无机焦磷酸酶(PPaSeE35C)的获取122.3DMBD的合成132.4硅纳米线的制备及改性142.5重组蛋白的表征及其在改性表面的吸附与脱附测试152.5.1SDS-PAGE凝胶电泳152. 5.2酶活性测定153. 5.3蛋白质在硅片表面的吸附与脱附16第三章结果和讨论174. 1DMBD的合成及表征173.2硅纳米线的SEM表征173.3硅接枝表面的聚合物厚度183.4

2、样品的水接触角测试193.5 蛋白的表征及表面对蛋白吸附测试203.5.1SDS-PAGE凝胶电泳203.5.2蛋白浓度标准曲线的测定203.5.3表面吸附蛋白质活性测试21第四章结论及展望224.1结论224.2展望22参考文献22致谢错误!未定义书签。硅纳米线表面的蛋白吸附调节摘要：蛋白质是生命活动的基础物质，蛋白质在生物体中无处不在。随着现代医学以及生物学的进步，蛋白质与表面的相互作用也引起了越来越多研究人员的关注。基于蛋白质与表面相互作用现象改性的表面也逐渐应用于医学以及生物学领域。如固定有聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNlPAAm）的表面可以用于天然与变性蛋白的分离。此外，该表面用于组

3、织培养基底可易于贴壁生长的组织完整脱落，同时关于表界面的研究在药物控制释放方面也起着积极作用o本文讲述了在硅纳米线阵列（SiNWAS）的表面以多巴胺介导用“Graftingfrom”的方法接枝了PH响应性聚合物聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯（PDMAEMA）,并用仪器测试对硅纳米线阵列表面进行了表征，最后用提纯的无机焦磷酸酶的突变体对该表面在不同PH环境下进行了吸附测试。结果显示表面接枝聚合物的厚度差异随时间延长或接枝次数增加而增加，制得的表面对蛋白活性吸附具有PH响应的特点。这种表面在蛋白质分离以及生物检测等生物领域有着潜在应用价值。关键字：硅纳米线阵列、PH刺激响应、表面改性、PDMAE

4、MAProteinadsorptionregulationonthesurfaceofsiliconnanowiresAbstract：Proteinisthebasicmaterialoflifeactivities.Andproteinsareubiquitousinorganisms.Withtheadvancementofmodemmedicineandbiology,theinteractionbetweenproteinsandsurfaceshasalsoattractedtheattentionofmoreandmoreresearchers.Basedonthephenome

5、nonofprotein-surfaceinteraction,Surfacesaremodifiedwithallkindsofproperties.Thesesurfaceshavealsobeenusedinmedicineandbiology.Forexample,thesurfaceonwhichPNIPAAmisimmobilizedcanbeusedfortheseparationofnaturalanddenaturedproteins.Inaddition,thissurfacecanbeusedforthesheddingofentiretissuepiecebypiece

6、.Previously,thesetissueattachedtothesurfaceofthesubstratecouldonlybedesorptedbydispersingintocells.Besides,thestudyonthesurfaceinterfaceplaysanactiveroleindrugcontrolledrelease.ThispaperdescribesthatthepH-responsivepolymerPDMAEMAwasgraftedonthesurfaceofsiliconnanowirearrays,usingdopamine-mediated“Gr

7、aftingfrommethod.Theinstrumentswereusedtocharacterizethesesurfaces.Finally,theproteinsadsorptiontestofthesurfaceindifferentpHenvironmentswascarriedoutwithapurifiedinorganicpyrophosphatasemutant.Theresultsshowedthatthedifferenceinthicknessofthepolymeronthesurfacesenlargedwithtimeorthenumberofgraftsin

8、creases,andtheresultingsurfacehasacharacteristicofpHresponsetoproteinadsorption.Thissurfacehaspotentialapplicationvalueinbiologicalfieldssuchasproteinseparationandbiologicaldetection.Keywords:Siliconnanowirearray,pHstimulationresponse,surfacemodification,PDMAEMA第一章绪论研究背景1.1.1蛋白与表面相互作用蛋白质和物质表面作用是自然界的

9、一种常见现象。在生物环境中，生物材料将会与许多不同的成分以及细胞体相互作用。由于大多数细胞的结构和功能取决于蛋白质的组装和活动，故而蛋白质是这些成分中和生物表面相互作用最关键的成分”。随着人们对蛋白质的认识，发现蛋白质与表面的作用涉及各种分子间作用力（如范德华力、亲疏水作用、静电相互作用、配位键合、分子识别等）Mo此外蛋白的吸附作用还受表面形貌以及空间阻力的影响。在蛋白质调控吸附中，我们主要考虑如亲疏水作用、静电作用以及表面形貌对蛋白吸附的影响。蛋白质分子在其空间表面上存在各种疏水的烷基以及亲水的皴基。此外因蛋白质还有大量可离子化的氨基、竣基以及其他可离子化的基团，这些基团的离子化将使蛋白质带

10、上电荷。当溶液环境PHpl（等电点）时，蛋白质带负电荷,PHPl时，蛋白质带正电荷。由于蛋白质各个基团相互间的静电作用力是维持其空间结构的重要作用力，而PH变化极容易改变这些基团的电性，这将使得基团间的位置将发生改变，导致蛋白质的活性空间结构改变。故而通过大范围的PH变化使蛋白质带电不适用于活性蛋白分离而适用于实验检测。上述的亲疏水基团、或带电的氨基、竣基等基团的空间位置共同形成有特定空间结构的结合位点组。由于结合位点组与蛋白质自身的空间位阻共同构成的空间结构通常复杂具有特殊性。而这一性质可用于蛋白质的特异性识别。就表面疏水性而言，一般认为改性表面的疏水性越强则其非特异性蛋白吸附就越强。如YU

11、an等人据此设计了聚氧化乙烯（PEC）/聚乙二醇（PEG）改性的亲水性表面。通过降低表面的疏水性来降低其表面蛋白的非特异性吸附。其原理可能是因为链压缩及PEG/PEO的结合水的“屏障”作用加剧了对蛋白质吸附的空间阻力。产生“屏障”作用的原因是亲水表面和水结合的趋势更强，蛋白质与水相比无法在氢键的结合竞争中胜出。而这一效应和蛋白质自身的氢键作用以及空间结构有关081。在等电点外的PH环境中，蛋白质净电荷不为零。根据静电相互作用，可通过改变表面接枝聚合物的电性来调节蛋白质的吸附。Wan等人利用聚丙烯酸(PAA)在pH=7.4时带负电荷的性质，在溶液环境中对带正电荷的细胞色素蛋白实现了吸附控制。表面

12、对蛋白质吸附的环境响应调节就是通过在表面接枝环境响应性聚合物实现的，这些接枝于表面的聚合物的环境响应最直接的体现在于聚合物自身的亲疏水性、带电性的改变以及表面链形态改变使得接枝物厚度的改变，进而引起表面浸润性的改变等。如Okano研究小组利用PNIPAAm改性表面发展了细胞片组织工程。PNIPAAm是温度响应性聚合物，其在温度较低时候受分子链内氢键作用，PNIPAAm将通过链内氢键结合大量水使得表面呈现亲水性质。而在较高温度时候分子链与水的氢键被破坏，分子链将脱水呈蜷缩状态，这将使得表面变得疏水同理PH控制的表面是通过在表面接枝PH响应性聚合物来达到上述的亲疏水以及聚合物刷带电性的改变。这种聚

13、合物主链上有大量的可离子化基团的聚电解质。通过将这类聚电解质接枝在表面即可实现PH响应W。如聚4-乙烯此咤(P4VP)等聚弱碱在低PH时分子链内带有大量正电荷，相同电荷使得分子链内静电排斥，分子链呈舒展状态。聚甲基丙烯酸(PMAA)这类聚弱酸则是图1表面和蛋白质的静电吸附示意图在在高PH时带负电，链呈舒张状态。而聚合物链的伸展和收缩带来直观的改变是接枝厚度的改变，接枝厚度的变化将影响表面的浸润性等。此外电性的改变都将对自带电的蛋白质的吸附起着重要作用。如Ionov制备了聚4-乙烯毗咤(P2VP)和聚丙烯酸(PAA)的混合聚合物刷，使得表面具有不同的PH响应性，在高PH时，P2VP能吸引带负电的

14、蛋白质；PH降低时，带正电的蛋白质将会被PAA链所吸附U叫蛋白质吸附不仅取决于表面化学性质，还取决于表面的物理形貌“4叫已经观察到，不同的形貌或模式可以影响蛋白质吸附的分布或吸附量，并且可以影响随后的生物学反应，例如细胞粘附和增殖1。Yuan等使用天然荷叶作为模板，在PU表面复制荷叶表面独特的微观结构“刃。与平面的PU表面相比，具有荷叶状地形(PUL)的PU表面拥有更大的比表面积，这增强了该表面的疏水性，使得PLU表面能更广泛地吸附蛋白质。此外，通过在微米/纳米尺度上制造生物界面形貌还可以改善血液相容性电。例如，为了模拟血管的内表面，Fan等人开发了一个多尺度结构的聚二甲基硅氧烷(PDMS)表

15、面，具有交错的亚毫米脊和纳米突起。血小板粘附分析表明，所得到的表面在流动下表现出良好的血小板抗性画。为了增强表面的性质，我们预备在硅纳米线阵列的表面进行改性。1.L2硅纳米线的功能硅纳米线阵列是硅晶片表面的一层形貌结构如图所示P这种纳米级的微观结构极大地增加了材料的比表面积，使材料的表面能大大增加，具有这种拓扑结构的硅表面具有更高的化学活性。这种表面结构还将使得材料的表面性质更加突出。如氧化型SiNWAs表面的水接触角小于1,具有超亲水的性质。而荷叶表图2.硅纳米线在扫描电子显微镜下微观图。A为俯视图。B为侧视图】。面的拓扑结构具有超疏水的性质O硅纳米线的制备机理有气-液-固(VLS)生长机理

16、、氧化诱导生长机理以及腐蚀制备机理。VLS生长机理：是指预见性地根据硅和金属催化剂的相图选取硅和金属催化剂的共晶点，使硅和金属催化剂在超高温度下汽化，然后在相图的共晶温度范围附近生成共晶液滴，使得硅在混合液滴中饱和并不断析出，由于金属液滴是纳米大小的尺度限制了硅析出直径，使得析出的硅纳米线的直径也是纳米级的。只要能选取合适的金属催化剂合理的温度以及气源即可制备纳米级的颗粒或者柱状物122。图3是硅纳米线的生长过程示意图。图3.硅纳米线的生长过程。A是VLS生长示意图阳，B是氧化诱导生长示意图网。氧化诱导生长机理：该机理如图所示，由Lee等人提出，在没有金属催化剂的情况下，硅和二氧化硅或一氧化硅

17、在高温下汽化，由于硅过量，气体含量中将以Sio为主导。Sio在Ar保护气氛中碰撞形成SiCh和Si的纳米尺寸晶核。然后在晶核内部发生如下反应：Si+SiO2=2SiO(g)2Si0(g)=Si(n-s)+SiO2(s)图4.化学腐蚀催化剂Ag粒子长大相 切示意图与与硅晶腐蚀生成硅纳米二氧化硅在高温下不断吸收气氛中的硅和一氧化硅并在内部生成一氧化硅中间层，即第一步反应，随着硅的含量增加，在中间层又会发生第二步反应生成硅。因为晶核尺寸小，晶体生长主要受表面能影响。这使得晶体主要沿一特定方向生长形成硅纳米线。化学腐蚀法制备硅纳米线方法中以金属催化腐蚀的方法为主。Zhu课题组24.25用AgNO3作氧

18、化剂，在HF的溶解下制备了硅纳米线。其过程是Ag+和硅晶表面接触后被还原。被还原的Ag沉积在硅表面可以形成原电池结构，成为该反应的催化剂，使得硅晶腐蚀反应更快地进行，被氧化的硅能被HF溶解，这使得该腐蚀可以持续进行。Ag粒子随着反应时间的进行不断地长大并最终和其他的Ag粒子相切。最终形成的孔洞凹陷同样相切，最后腐蚀较慢的部分“突起”形成硅纳米线结构】。如图4所示。硅纳米线因其优良的电学性质，在研究中不仅常应用于纳米电子器件和传感器领域，还应用于太阳能电池以及热电转换材料%】。此外硅纳米具有较好的生物相容性，在生物医学方面也逐渐得到重视271。在生物传感器方面，垂直的硅纳米线阵列因其优良的理化性

19、质以及电学性能可以作为生物传感器的修饰平台侬L更大的表面积和表面反应活性使对目标样品的浓度探测范围更大。同时.，硅纳米线阵列中硅纳米线和很多生物大分子的尺寸相当，这使预结合在SiNWAS上的配体分子更快地和靶分子结合并作出响应29Jo此外以VLS策略制备的SiNWAS为基础制成的场效应晶体管有着对生物、化学分子种类识别范围更广的性质。这些晶体管是先将SiNWS制成电极，随后在SiNWAs上固定生物活性配体。根据固定的生物配体的种类可以实现蛋白质结合、DNA杂交以及酶反应等。这些反应都可以转化成电信号用于检测卬】。此外，根据表面增强拉曼散射(SERS)的方法还可以制备出探测灵敏度可达单分子的传感

20、器。如SiNWASAgNPS拥有很大的比表面积，这十分有利于其在表面形成用于与样品分子结合的“热点”。而这种表面可以用于无免疫标记的SERS探测。该传感器对小鼠免疫球蛋白G的检测灵敏度可达50ng闻】，此外该传感器还可以对分子构象改变转换成谱图上特征峰的明显改变1291。将SiNWASAgNPs用作生物化学电极的时候32,其高比表面积和电导率使得其灵敏度更高。可用于检测磷酸盐溶液中的牛血清蛋白(BSA)口3当SiNWAs用作细胞培养时，该表面上的拓扑结构可以诱导哺乳动物形成更多的丝状伪足用以粘附。而硅纳米线会穿过细胞膜而不会使得细胞活性受到明显的损伤ML利用这一性质还可以在纳米线上修饰小分子药

21、物，将表面的纳米线用作药物载体，可以实现细胞水平给药。而在硅片上利用光刻技术形成特定的硅纳米线阵列形貌，这些特定形貌的硅纳米线阵列可以诱使哺乳动物细胞微排列【29】。在硅纳米线阵列表面修饰DNA受体时还可以对细胞实现无伤害的吸附，然后利用限制性核酸内切酶还可以使细胞无伤脱附）。而在硅纳米表面修饰一些如PNIPAAm响应性聚合物还可以加强表面对蛋白质或细胞的可逆吸附和脱附网1.1 .3聚合物表面接枝方法材料表面接枝方法分为物理方法和化学方法。物理方法有预吸附、聚合物涂层、等离子体沉积等，化学方法主要为Graftingto、aGraftingfromv。通常物理方法操作简单,但聚合物与表面作用力较

22、弱，这使表面的聚合物层易脱落,导致表面在后续的使用中性质差异较大。反观，化学接枝方法相对复杂，但表面和共价锚定的聚合物链作用力强，在多次使用后其表面性质保持良好。Graftingto”是预合成具有活性端基的聚合物链，聚合物链与经活化的表面通过化学反应相连接。如Cho等人预合成端基为筑基的PNIPAAm,并利用筑基和金表面形成形成AU-S键而将PNlPAAm接枝在金表面上J在聚合物链和材料表面接枝过程中，聚合物链在溶液中不规则蜷缩呈线团状，这使得聚合物链的活性端被掩埋而使得反应效率较低。此外接枝在材料表面的聚合物也因呈线团状而使得后续反应的空间位阻增大而降低表面聚合物的接枝密度3%“Grafti

23、ngfrom”是将材料表面活化后接枝聚合反应引发剂，将表面置于单体溶液中并加以引发条件，最后聚合物单体将在材料表面聚合、生长。由于Graftingfrom方法是在表面同一时间生长聚合物，这使得高聚物链生长过程中空间位阻较小而已生长的聚合物链发生弯曲的空间位阻较大。因此通过此方法可获得高密度的接枝聚合物链。并且可以通过控制表面引发剂的密度来控制接枝聚合物链的密度3久如Wu在聚氨酯表面通过化学反应预接枝含双键的小分子，然后通过引发自由基聚合接枝了高密度的PNIPAAmI381。如若聚合链合成反应复杂，则应预合成高聚物链通过“Graftingto”方法接枝在材料表面上。近年来随着多巴胺在材料表面修饰

24、的应用使得材料表面改性愈加简易。一直以来材料表面改性都受限于如何在材料表面产生合适的化学活性位点。而且表面活化方法随底物材料性质的变化而变化，化学惰性抗粘附的材料更是加剧这一难度13纥仿生学家发现海洋贻贝可以不受材料种类的限制牢固地粘附于各种表面4-4，o进一步研究发现贻贝在粘附中主要依靠于分泌的一种粘附蛋白。而多巴(DOPA)是粘附蛋白粘附功能中起主要作用的分子42。DOPA(如图所示)含有邻苯二酚的结构，两个苯羟基在苯环大兀键上的吸电子作用使得1、2号上的碳原子更容易被亲核试剂进攻。又因为苯环上的酚羟基容易被氧化成酮式。DOPA又可以还原剂被亲电试剂进攻。此外DOPA还可以与路易斯酸碱发生

25、静电作用阳在实验室研究中常用性质相似的多巴胺(Dopamine)代替D0PA。在pH=8.5的三羟基甲基氨基甲烷和盐酸溶液(Tris-HCI)中环境中多巴胺的酚羟基极容易被氧化生成多巴胺醍，多巴胺醍再经过无色的内环化中间体，再进一步氧化成粉红色中间体，经重排后生成5,6-二羟基吧味，最后经交联、重排生成深褐色的聚多巴胺粘附在表面。这种粘附在表面的聚多巴胺表面仍然具有高活性的端基。链端的羟基可以将贵重金属，如金、银、伯等离子还原并使其镀在聚合物层表面上，此外聚多巴胺还可以与硫醇以及氨基等发生迈克尔加成以及席夫碱反应【判。如Wang小组用DOPa-DETC作光引发剂粘附在金表面，并利用光引发反应接

26、枝了PNIPAAmmLDOPA图5.DoPA分子示意图，及DOPA粘附示意图岫。1.2 课题的提出随着医疗及组织工程等行业的理论发展，材料自身的表面性质已很难满足相关的应用需求。在现代医疗过程中，蛋白质和表面的相互作用常见于如关节置换、血管支架、金属心脏瓣膜、药物的控制释放等。在植入体中不合适的表面性质极容易引起不良的组织反应，如致癌、发炎、免疫排斥、血栓等。表面改性赋予了材料更理想的表面性质。如表面接有肝素的抗血栓支架，用于药物控制释放的抗血栓凝胶，对人造的金属关节的表面修饰一些生物相容性材料以及添加一些生长因子，可防止周边组织病变，还有利于组织在表面的愈合贴附。而在组织工程中，一些细胞如皮

27、肤细胞贴壁生长，培养完成后，用酶处理后脱落的组织易分散成细胞悬浮液，这些细胞悬浮液很难用于外科移植。经改性的温敏表面有易于组织脱附，可收集到细胞间粘附形成的组织。表面改性的出现使材料表面的物化性质可以和符合力学要求的基底材料相复合。即将表面聚合物刷和材料主体的复合。使得材料的表面性质更加符合现代生物医学的设计应用需求。本文介绍的PDMAEMA型PH响应控制蛋白质吸附与脱附的表面是一种非特异性的蛋白质静电吸附表面。这种表面可应用于一些蛋白的活性分离。此次设计用金属溶液腐蚀法在基底材料硅表面生成了具有更高的表面活性硅纳米线。并用多巴胺对表面接枝了光引发剂。并在此基础上用光聚合的“Graftingf

28、rom”的方法在硅片表面生长出了PH响应的聚合物刷PDMAEMA。然后用椭圆偏振仪、扫描电子显微镜等仪器对实验中的产物或表面进行了表征。并对最终制得的表面进行了蛋白质的吸附和脱附的测试。希望此次设计对利用多巴胺在硅纳米线表面接枝PDMAEMA有一定的积极意义。第二章实验部分此次设计中使用的突变体无机焦磷酸酶（PPaSeE35C）是通过对突变的目标大肠杆菌进行扩增最后提纯的蛋白。而在硅纳米线表面用于聚合的光引发剂DMBD（DOPa-DETC）复合体是预合成的。在下面的实验部分将对这两个方面作简单介绍。此外，硅纳米线是通过金属化学腐蚀的方法制备，实验中利用DMBD作光引发剂，在紫外光的照射下接枝了

29、PDMAEMA。2.1实验的仪器和药品实验仪器：FA20104电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），SG120/750TS/F真空手套箱（苏州威格设备科技有限公司），KQ-100E型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），IMS-30制冰机（常熟市学科电器有限公司），85-2型恒温磁力搅拌器（巩义予华仪器有限责任公司），全温振荡培养箱（英国RSBiotech公司），微量移液器（美国Gilson公司），Milli-QBiocel超纯水仪、离心超滤管（美国Millipore公司），S-4700扫描电子显微镜（SEM）,可见光谱仪（美国Thermo公司

30、），高速离心机（德国Hermle公司），空气恒温摇床（上海新苗医疗器械公司），超净工作台（苏州净化公司），超低温冰箱（日本Sanyo公司），透析膜（北京索来宝公司）等。实验药品：甲基丙烯酸二甲氨基酯（DMAEMA）（98%）、抑制剂清除剂、澳化亚铜（98%）、柠檬酸三钠盐二水合物、盐酸多巴胺（98%）、4-（氯甲基）苯甲酰氯（97%）、二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物（95%）等来自美国Sigma-Aldrich公司。蛋白陈、酵母提取物来自英国OXOlD公司。琼脂粉来自北京Solarbio公司。过氧化氢（30%）、甲醇、氢氟酸、硝酸、磷酸二氢钾、盐酸、丙酮、硫酸、二甲基甲酰胺（DMF）、氯化钠、

31、磷酸二氢钠等其他试剂皆为国药分析纯。2.2.突变体无机焦磷酸酶(PPaseE35C)的获取目标菌的培养：配置1.2LLB培养液(1%蛋白陈，0.5%酵母粉，0.5%NaCl,pH=7.0)并灭菌。挑选适量的目标菌并用LB培养液于无菌EP管中加入24L50mgmL_1Amp及48L6.25mgmL1Tet摇匀，于恒温摇床中复苏。复苏完成后将细菌溶液转移到1.2L的培养液中加入2.4mL50mgmL1Amp及4.8mL6.25mgmLTet摇匀后，摇床中扩大化培养留样。加入1mL诱导剂IMIPTG摇匀，摇床中培养，留样。将细菌液分装在6个50mLEP管中4,600OrPm离心IOmin。弃去上清液

32、，细菌沉淀于-70下保存。目的蛋白的提取和纯化：用1mM咪唾、磷酸二氢钠(Na2H2PO4)缓冲溶液和菌体沉淀制成细菌悬浮液，加入20mg溶菌酶，轻晃EP管使溶菌酶溶解。然后，冰上静止5minO超声破碎6min,留样。412000rmp离心30mino收集上清液分装成3管，并留样。最后，弃去沉淀。每管上清液加入1mL清洗后的介质，4摇晃结合1ho然后4700imp离心3min。留取结合上蛋白的介质，并对该上清液用新的介质再结合，每次用新介质结合，共3次。收集每次的介质，最后将上清液留样后弃去。对收集到的9管介质用20mM的咪噗缓冲液清洗，4700np离心3min弃去上清液。对留取的介质再重复清

33、洗2次以出去杂质蛋白。将清洗后的介质分装于18个1.5mL的EP管中,每管加入ImL25OmM的咪哇缓冲液冰上静置20min,4700rmp离心1mino收集洗脱液并留样。用250mM的咪噗缓冲液重复洗脱并收集每次的洗脱液共4次。用无菌过滤器过滤并留样。超滤纯化后留样。移取纯化蛋白到5mLEP管中加纯水到5mL,分与3个EP管-20保存。2. 3DMBD的合成将硼砂(5.80g,15mmol)和水(150mL)加入到圆底烧瓶中，通氮气30min。转移至手套箱，先加入多巴胺(2.85g,15mmol)静置15min。力入碳酸钠(1.6g,15mmoL),密封。从手套箱中取出，在冰浴、氮气氛围下缓

34、慢滴加CMBC(2.2mL,15mmol)o冷却IOmin,最后放入手套箱中，室温搅拌下过夜。浓盐酸酸化至PH0.02mL10%APo同样按上述顺序依次加入药品。迅速加入下胶的两板之间，加满后插上梳齿，静置30min。取20L提纯后的目标蛋白于20L的EP管中，加入5L的IoadingbUffer溶液，于100水浴加热10min,maker煮5min,槽中放入制备好的胶，倒A750mLSDS电泳缓冲液，拔下梳齿，分别点样至SDS-PAGE凝胶，接通40V电源，蛋白跑至黑线以下后转80V电源电泳。待跑出胶时停止电泳，取出胶并用染色液染色2h,再用脱色液脱色，脱色完成后拍照。2.5.2酶活性测定用

35、50LlMTris-HCl（pH=8.0）、50LIMMgCl2，加入不同体积的10mMKH2PO4最后用水补至1000L来配置不同浓度梯度的KH2PO4溶液。分别取100L个加入0.4MCA,800LAAM和80L1MCA混合后测A355o可得活度标准曲线。缓冲蛋白体系：5LIMTris-HCl(pH=8.0)、5LIMMgeI2、76LH2O、10L蛋白液。AAM溶液：10L七钥酸镂：2.5M硫酸：丙酮=1:1:2将4L的50mMNa4P2O7加入到EP管中，加入96L缓冲蛋白溶液，30加热IOmin,加入10L0.4M的柠檬酸、800LAAM,摇晃2min,加入80L1M柠檬酸，取200

36、L的所得溶液加入96孔板。以水作空白对照，放入酶标仪测A335。将所测值代入标准曲线即得酶活。2. 5.3蛋白质在硅片表面的吸附与脱附首先，取10gml/的蛋白以及90L相应pH(6.0-10.0)的50mMTris-HCl混合加入到接枝完成的硅片上，吸附半小时。随后，利用相应PH的TriS-HCl溶液冲洗3次，每次浸泡2min,吸干水分后测活。在吸附好蛋白的片上加入4LPPi,随后加入96L缓冲溶液(86L水，1M相应PH的Tris-HCl溶液5L,IMMgCl5L0水浴30下反应10min0之后吸取脱附后的反应液80L加入8L0.4M柠檬酸，加入640LAAM(2.5MH2SO41.5mL

37、七铝酸铁1.5mL丙酮3mL),摇晃2min后加入64LIM柠檬酸终止，取200L测定355nm下的吸收值。第三章结果和讨论3.1DMBD的合成及表征Chemicaldiftpm图7.DMBD的核磁共振氢谱(分子中各基团信号已在图中标出)oDMBD即DOPa-DETC,是为了将DETC这一聚合物光引发剂通过DOPA接枝到将要改性的表面上。使得表面可以引发聚合DMAEMA。按照上述实验步骤我们先用下述步骤合成了DMBD(DOPA-DETC)这一分子。为了验证该分子的合成，我们对生成物用核磁共振氢谱表征，结果如图。DoPa-DETC的IHNMR谱显示存在属于二乙基二硫代氨基甲酸节酯(-C6H4-C

38、H2-S-(C=S)-N(CH2CH3)部分的儿茶酚单元的特征性化学位移(6至7ppm)。这表明DMBD的成功合成。3.2硅纳米线的SEM表征图8.扫描电镜下的硅纳米线形貌。此次试验的表面结构是通过金属离子溶液腐蚀的方法在硅片上产生了纳米线级的微观形貌，硅纳米线的长度的增加可以通过延长反应时间来实现。图8是对所制硅片用扫描电子显微镜（SEM）对该表面进行形貌表征所得图像。图中硅纳米线取向相对统一，长度约为5.0m,同时硅纳米线有许多折断与偏倒，这应该是在对硅纳米线清洗过程中硅片重叠、翻覆所致。硅纳米线微观结构大大增加了材料的比表面积，使得硅表面活性增加。利于后续接枝反应的进行。3. 3硅接枝表

39、面的聚合物厚度实验中我们在硅纳米线表面接枝了光引发剂DMBD,并在此基础上通过光引发聚合接枝了PDMAEMA,由于接枝后的表面仍然有许多活性基团可再次引发DMAEMA的聚合反应，故后续实验中又通过再聚合增加了聚合物层的厚度。O.,SiQMBD Si-P*41 Si-Pra42 Si-Prad32015105 (UrU VmDPWJ图9椭圆偏振光谱仪下硅纳米线的表面的聚合物接枝厚度。最后用椭圆偏振光仪对表面进行了表征，结果如下：接枝DMBD的硅纳米线表面仅有约2.5nm的厚度且长度差异较小。第一次接枝的表面厚度约5-6nm之间，厚度浮动较小，第二次接枝表面厚度在7-12nm左右，第三次接枝厚度在

40、13-19nm左右（图9）。表面接枝物厚度的增加验证了表面聚合DMAEMA后的表面仍然具有可再次引发聚合反应的活性端基，通过多次聚合反应增加接枝物厚度的方法可行。而接枝物厚度差异越来越明显则可能是多次反应厚度差异的叠加，也有可能是聚合表面引发活性位点被屏蔽使得表面活性降低。可预知接枝物厚度越厚则该现象越明显。图10.SN(a)和SN-PDMAEMA(b)的TEM图像。用透射电镜(TEM)测试的结果同样如图所示。从图10上可以明显的看到相较于未修饰的SN,SN-PDM在SN周围包裹着一层聚合物层，证明了改性表面的成功制备。同时测得聚合物层的厚度约为13nm,这也与椭圆偏正测得的结果相近。3.4

41、样品的水接触角测试SN畴.W喙孙MQDZ如的3图11.表面的水接触角测试结果。表面的浸润性将直接影响蛋白质在表面的蛋白质吸附。如图11,用金属化学腐蚀制备的硅纳米线阵列的表面经羟基化后能与水形成氢键，具有超亲水的性质，其水接触角小于5。而经DMBD修饰的表面，其水接触角有明显提升。这表明DMBD被成功修饰在表面上了。而对于与修饰相对疏水的PDMAEMA后的表面，其疏水性有了明显的提升，这表明PDMAEMA的成功修饰，同时也说明了经修饰后的表面将更疏水，也更有利于蛋白质在表面上的吸附。而后续再接枝的SN-PDM-2和SN-PDM-3则表明聚合物的接枝厚度对表面的疏水性影响达到饱和。3.5 蛋白的

42、表征及表面对蛋白吸附测试3. 5.1SDS-PAGE凝胶电泳如图所示2IKDa分子量的蛋白 质即是目标蛋白一无机焦磷酸酶。细 菌破碎液1、破碎上清液2中未出现 可见的目标信号可能是由于溶液目 标蛋白浓度太低未能被检测出。3表 明经结合后的清液仍然存在部分目 标蛋白。4的上清液经浓缩后浓度增 加目标信号开始增强，5的信号比4 的增强许多，这说明经过浓缩，蛋白 质浓度明显增加。6部分杂质信号明 显降低,这表明通过超滤除去了部分 杂质蛋白。同时也表明了滤后的浓缩 后的蛋白仍有部分杂质蛋白。图12.无机焦磷酸突变体的SDS的凝胶 电泳。（M： marker ;1 ：细菌破碎液;2： 破碎液上清;3：与

43、介质结合3次后的上 清液;4：第一次洗脱液;5：无菌滤膜滤 涌6,超逑后的蛋白溶满八）3. 5.2蛋白浓度标准曲线的测定Bradford法测蛋白浓度是利用考马斯蓝蛋白质染料，考马斯蓝在游离状态时最大光吸收在488nm,与蛋白质结合后为青色，最大吸收值在595nm处。且吸收值和浓度成正比关系，利用此性质可以测蛋白质浓度。作标准曲线如下。08- - - -6 4 2 00-0-0 06K OowWsqvy=0 644x*0 02405 Rx=O 97991000204060810Coocentration(mmL)图13.蛋白质浓度的标准曲线3. 5.3表面吸附蛋白质活性测试按照上述实验步骤，对突变无机焦磷酸酶对硅纳米线改性表面进行了吸附测试，并测试器活度，所得结果如下，无机焦磷酸酶在pH=8时活性最高。而在pH=10时活性降到了最低。这是PH破坏了蛋白质的结构使得蛋白活性的降低。而相对活性则能显示酶吸附在表面上的相对含量。结果表明pH=8时吸附量是最大的，而在PH二6时吸附量在50%左右，这表明改性的表面对蛋白吸附有PH响应。60-ASEWq4 MQL图14.蛋白质在表面上吸附和脱附后的活性（八）,以及相对活性(B)。第四章结论及展望4.1 结论在