细胞信号转导与肿瘤靶向治疗.ppt

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1、细胞信号转导与肿瘤靶向治疗,肿瘤严重威胁人类健康，其发病率有逐年上升的趋势。目前治疗方法主要有手术切除、放疗、化疗、生物治疗和内分泌治疗。发展方向：针对肿瘤相关信号途径的靶向治疗更具有发展前景。,细胞增殖、凋亡信号途径与肿瘤的发生及其靶向治疗,肿瘤的发生与细胞增殖和凋亡密切相关，细胞增殖和细胞凋亡是两个相反的生理过程，在正常情况下，两者都有严密的调控机制，以保证胚胎发育、个体成长及成体中新生的细胞替代衰老、死亡的细胞。在胚胎发育及个体成长阶段，细胞增殖占优势；在成体中，细胞增殖与细胞死亡达成平衡，这一平衡的破坏可导致肿瘤或其他细胞增生性疾病的发生。,一、细胞增殖信号通路与肿瘤发生及其治疗,（一

2、）细胞增殖的概念,细胞增殖（proliferation）是个体生长发育的重要过程之一，也是一种重要的生命现象。这种现象不仅存在于胚胎时期，而且在出生后仍然存在；它不仅在正常的生理条件下发生，而且也和某些疾病密切相关。细胞增殖主要受到生长因子(growth factors)的调控，涉及很多基因表达(gene expression)的变化和信号传导(signal transduction)途径的介导。任何一个环节失调(misadjustment)都有可能导致疾病的发生。,（二）细胞增殖信号通路与肿瘤发生及其治疗,生长因子受体是细胞膜上具有酪氨酸蛋白激酶（RTKs）活性的跨膜蛋白质分子。当有相应的生

3、长因子结合时，导致这些生长因子受体发生自磷酸化和构象变化，表现出酪氨酸蛋白激酶活性，使细胞内的信号蛋白分子磷酸化，与受体复合物的细胞内结构域结合，导致细胞增殖信号的传导。,细胞膜上的这些受体分子包括表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR）、血管内皮生长因子受体（VEGFR）等。在肿瘤组织中，由于其自身基因的突变或相应生长因子的刺激，它们常常处于持续激活状态。从而导致下游增殖信号途径的持续激活。与肿瘤发生有关的生长因子受体下游信号途径主要有：PI3K/Akt 和Ras/MAPK途径。,1.PI3K/Akt 信号通路,PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）是一个异二聚体激酶（家

4、族），由调节亚基p85和催化亚基基p110组成。p85是RTKs（VEGFR,EGFR 和 PDGFR）的磷酸化底物，RTKs磷酸化p85，并使PI3K募集到RTKs和激活。激活的PI3K催化PIP2磷酸化成PIP3。,细胞内PIP3的水平除了受PI3K控制外，同时也受PTEN（phosphatase with tensin homology）控制。PTEN可将PIP3转化成PIP2，负性调节PI3K/Akt信号途径，PTEN是一肿瘤抑制基因，在多种肿瘤中发生突变。,PIP3募集Akt（蛋白激酶B）到细胞膜内表面，然后Akt在Thr308和Ser473被PDK1、PDK2或PKC磷酸化而激活。

5、Akt本身也是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是一细胞内的重要信号蛋白质分子，Akt通过使BAD,FKHR(forkhead transcription factors)和 caspase 9磷酸化?而使它们失活，从而抑制凋亡、促进生存。此外，Akt也可上调NF-B、激活MDM2，而促生存、抑制凋亡。,除了调节抗凋亡信号途径外，Akt通过抑制GSK3（糖元合成酶激酶3）而直接促进细胞增生。Akt通过mTOR 信号途径促进细胞体积增大。肿瘤组织中PTEN活性的降低和Akt活性的增加与恶性程度增加和病人生存降低相关。,虽然Akt对细胞生存和增生起着重要的促进作用，但单一的Akt激活是不足以诱导肿瘤发生的，

6、只能诱导细胞生存和组织增生。只有当Ras和Akt等多条信号通路同时激活时，才能诱导肿瘤的发生。,2.Ras/MAPK 信号通路,Ras是一膜结合G蛋白，可激活MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）信号通路。激活的生长因子受体有一磷酸化的细胞内的酪氨酸残基，此残基通过与衔接蛋白（adaptor protein）如Grb2相互作用激活Ras。此外，法呢基转移酶（farnesyltransferase）将法呢基转移到Ras的羧基端也是Ras激活所必须的。激活的Ras募集Raf到细胞膜，使Raf能被其它激酶（Src激酶或PKC）磷酸化而激活。Ras在多种肿瘤中发生突变，持续激活，与肿瘤的发生密切相关。,当R

7、af分子上的酪氨酸残基被Src激酶或PKC磷酸化时，Raf被激活。Raf的下游分子是MAPK，其中最为突出重要的是 MEK-1 和MEK-2，它们被Raf磷酸化而激活，随后它们又磷酸化激活下游分子ERK-1 和 ERK-2，磷酸化的ERK-1 和 ERK-2转位到细胞核，激活许多核内靶分子。,ERK可激活很多靶分子，包括topoisomerase II-和p90RSK，p90RSK是一丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可磷酸化激活很多转录因子如CREB（cAMP反应元件结合蛋白）、ER-、I-B/NF-B 和 c-Fos等。这些转录因子可启动多种癌基因的转录，促进细胞周期、细胞增殖、新生血管生成、抗凋亡

8、。,3.靶向PI3K/Akt 和 Ras/MAPK 通路的肿瘤治疗,目前有很多治疗策略针对肿瘤细胞的生存信号通路，包括针对生长因子及其细胞表面受体的单克隆抗体、小分子激酶抑制剂、细胞内信号蛋白质分子的特异性抑制剂等。,单克隆抗体,针对循环系统生长因子的单克隆抗体可降低肿瘤细胞过度表达的生长因子受体的活性，同时针对生长因子受体的抗体可防止受体与配体的结合和受体的激活，是防止生长信号通路激活最源头有效的方法。如Bevacizumab（贝伐珠单抗）是针对VEGF的人源化单抗，Cetuximab（西妥昔单抗）是针对EGFR细胞外配体结合域的单抗。,小分子激酶抑制剂,小分子RTK抑制剂可与ATP相竞争地

9、结合到受体分子的酪氨酸激酶结构域上，抑制RTK的酪氨酸激酶，阻止RTK介导的信号传导。此外，Sorafenib是多种激酶的抑制剂，可抑制Raf、VEGFR、PDGFR-和 c-Kit等激酶的活性，导致MEK 和 ERK活性的下调。,细胞生存信号抑制剂,Sirolimus 及其类似物 everolimus、temsirolimus 和 AP23573是mTOR的小分子抑制剂。Tamoxifen是非类固醇抗雌激素，用于治疗雌激素受体阳性的乳腺癌。此外，Tamoxifen也可抑制PKC活性，对PI3K/Akt信号途径有抑制作用。Enzastaurin是PKC抑制剂，也可抑制GSK3,ribosoma

10、l S6 和 Akt 的磷酸化，从而抑制PI3K/Akt信号途径。,Tipifarnib 和 lonafarnib是法尼基转移酶抑制剂，抑制Ras法尼基化，导致Ras/MAPK信号通路的抑制。Bortezomib是蛋白酶体抑制剂，可抑制NF-kB的活性，与lonafarnib联合，可导致p-Akt水平的下调。,Wnt是一分泌型糖蛋白家族，激活信号传导，稳定-catenin（连环蛋白）。Wnt/-catenin 信号通路失调导致许多靶基因（c-myc,cyclin D1、metalloproteinases 和 VEGF）持续转录，细胞增生和肿瘤发生。,4.Wnt/-catenin 信号通路与肿

11、瘤的发生及其治疗,Wnt/-catenin 信号通路,在没有Wnt刺激时，-catenin的丝氨酸/苏氨酸残基被Casein激酶和GSK-3磷酸化，支架蛋白Axin 和APC促进-catenin与激酶的相互作用，这些蛋白质分子形成-catenin 降解复合物，使磷酸化的-catenin 被-TrCP识别、泛素化、被蛋白酶体降解。此时，Tcf 与Groucho相互作用，形成复合物，抑制Wnt 靶基因的转录。,当有Wnt刺激时，诱导Dsh磷酸化，GSK-3活性降低，抑制-catenin磷酸化和降解，使-catenin在细胞质内积累，转位到核内，与Tcf结合，解除其转录抑制作用，激活靶基因转录。肿瘤

12、中Wnt信号通路分子常有遗传的、后生的异常表达变化，针对此信号通路的治疗策略将是阻止-catenin-Tcf 复合物的形成，抑制Wnt 靶基因的转录。,靶向Wnt/-catenin 通路的肿瘤治疗,靶向Wnt/-catenin 通路的主要治疗策略是增强-catenin 的蛋白酶体降解过程，抑制其在细胞质积累、转位到核内、激活靶基因的表达。,-catenin蛋白水平的调节,Wnt/-catenin信号通路的许多蛋白都是负调节分子（如APC 和Axin），具有抑制肿瘤的功能。APC分子的-catenin 结合域足以具有肿瘤抑制活性，基于这一结构基础，构建了重组腺病毒Ad-CBR，可组成性表达APC

13、分子的-catenin结合域。Ad-CBR可抑制-catenin的积累和核转移，抑制-catenin/Tcf的反式激活作用，使肿瘤细胞生长抑制、凋亡，是一有效的抗肿瘤药物。,此外，负调节因子Idax、Axam 和ICAT可抑制APC、-catenin 和 Axin 发生突变的肿瘤细胞增生，具有治疗肿瘤的作用。,-catenin蛋白酶体降解过程的激活,-catenin在细胞质中的积累是Wnt/-catenin信号通路激活的关键，细胞质-catenin稳定性由Skp1/Cull1/F box(SCF)泛素化装置调节。基于这一观点，E-cadherin 的-catenin结合域与-TrCP泛素化蛋白

14、连接酶形成重组分子，使稳定的-catenin突变体被募集到SCF 泛素化装置上，致使被泛素化和降解。,反义核酸、RNA干扰降低-catenin的表达,Wnt信号通路异常的肿瘤大多表现出-catenin 水平增加，反义核酸、RNA 干扰可消除或降低-catenin 水平，从而阻止肿瘤组织过度激活的Wnt信号通路。,抗癌药的作用,目前，有很多抗癌药正在试验中，有些已被FDA批准使用，其中最为突出的是非类固醇抗炎症药物（NSAIDs），包括选择性的COX-2（环加氧酶）抑制剂。肿瘤细胞-catenin 高水平与COX-2过表有关，NSAIDs的肿瘤治疗作用与其对COX-2的直接抑制作用有关。,临床前

15、试验表明 NSAIDs 和其它几种抗癌药可靶向 Wnt信号通路，包括Indomethacin、Sulindac 及其代谢物、Aspirin 及其衍生物、Glivec/Gleevec、Bcr和 Endostatin。,Bcr对Wnt/-catenin 通路有负调节作用，可与-catenin形成复合物，对c-Myc表达具有负调节作用。Endostatin是一血管生成抑制蛋白，对APC突变的大肠癌细胞中的Wnt/-catenin 通路具有抑制作用，诱导凋亡。,GnRH（促性腺激素释放激素）类嵌合蛋白 近年在肿瘤靶向治疗研究中的一个策略之一是构建和使用嵌合蛋白，嵌合毒素是一类可以识别和摧毁过表达某种受

16、体的肿瘤细胞的靶向药物，这些分子是用基因融合技术构建的、由靶向结构和细胞杀伤结构组成。目前已经开发出一类以GnRH类似物为靶向结构的嵌合蛋白。由于大多数肿瘤表达 GnRH受体，因此，GnRH类嵌合蛋白可以靶向并杀伤肿瘤细胞，在肿瘤治疗中具有很好的发展前景。,Dab2 蛋白的缺乏可导致核内-catenin水平增高和-catenin/Tcf/LEF-1诱导的基因转录，因此，使肿瘤细胞过表达Dab2也是一种有效的治疗策略。CHOP(GADD153)属于C/EBP转录因子家族，可与C/EBP家族中的其它成员分子形成二聚体，影响它们的DNA 结合及反式作用功能。研究发现，CHOP能与Tcf 结合，从而抑

17、制Tcf 结合到DNA 反应元件上，因此，CHOP是Wnt/Tcf 通路的特异性抑制因子。,二、细胞凋亡与肿瘤发生及其治疗,细胞凋亡（apoptosis）是1972年由Kerr JFR 等首先提出的，是指在一定的条件下，细胞接受某种信号的刺激后，自行控制发生的自杀死亡过程。这是机体清除多余、变异或癌变细胞的一种主动的生理过程，在保持机体的自身稳定，调节细胞增殖和恶性肿瘤的发生发展中起重要作用。,（一）细胞凋亡的概念,细胞在发生凋亡过程中体积变小，胞浆浓缩，胞膜皱缩，形成泡状突起，胞核固缩，染色质浓染致密，呈斑块或边际呈月牙状，进而胞膜内陷，将细胞自行分割为多个有膜包绕的凋亡小体。这些凋亡小体被

18、其他细胞吞噬，细胞内物质不会外漏，也不会引起周围组织的炎症。,肿瘤不仅是细胞增生性疾病，同时也与细胞凋亡有关。正常成体中的细胞增殖与凋亡是平衡的，当增殖大于凋亡时，这一平衡破坏将导致肿瘤和其它增生性疾病的发生，肿瘤细胞表现出过度增生和抗凋亡的特性。,（二）细胞凋亡信号通路与肿瘤发生及其靶向治疗,细胞凋亡是一个及其复杂的过程，涉及到细胞内信号传递，酶活化，蛋白质合成以及基因表达等一系列细胞代谢的主动过程。首先，凋亡的启动需要有诱发因素，包括生理因素和非生理因素。生理因素如肿瘤坏死因子，甲状腺素，糖皮质激素等。非生理因素有化疗，辐射，毒性物质等。这些因素均可激发或诱导与凋亡有关的一系列基因的转录，

19、从而影响细胞凋亡的进程。,细胞凋亡信号通路,细胞凋亡是由细胞内的caspases（胱天蛋白酶）介导的，caspases分为上游启动和下游执行者，上游启动者有caspases-8、9、10，下游执行者包括caspases-3、6、7。caspases以无活性的酶原形式被合成出来，通过蛋白水解或相互聚集（级联放大）而被激活，水解细胞骨架蛋白等细胞内蛋白质分子，导致细胞缩小、外形改变、细胞凋亡。,细胞凋亡主要可通过两条信号通路进行：内源性和外源性通路。内源性通路由BCL家族的促凋亡分子BAX和BAK促进线粒体分子Cyto C释放启动的；外源性通路由配体激活的细胞表面死亡受体启动的。,内源性通路线粒体

20、途径,内源性通路通常是由细胞损伤（化疗药物或射线）和应激启动，由P53传导实现的。BCL2家族分子通过抗凋亡和促凋亡在细胞凋亡内源性通路中发挥着重要的作用。抗凋亡的BCL2家族分子（BCL2、BCLX和MCL1)与促凋亡分子BAX 和BAK相互作用，抑制线粒体Cyto C 的释放，从而抑制凋亡的发生。,当细胞的DNA发生严重损伤时，通过激活p53上调BAX和BAK的表达，BAX和BAK在线粒体上形成通道，使线粒体中的Cyto C 释放到细胞液，与细胞液中APAF1（凋亡蛋白酶激活因子1）结合并使之活化。APAF1又结合caspase-9，导致其水解活化。caspase-9、APAF1 和Cyt

21、o C构成的复合体称apoptosome（凋亡体），该复合物激活caspase-3、6、7，导致细胞凋亡。,此外，小分子蛋白Smac 也可从线粒体释放到细胞液，Smac可使凋亡抑制分子IAPs：XIAP、IAP1、IAP2 和 Survivin 失活。XIAP是caspases抑制剂；其它的IAP可促使 caspases 泛素化并降解；Survivin 是一促生存分子，在肿瘤细胞中的特异性表达。,内源性通路死亡受体途径,内源性通路由细胞表面死亡受体的配体激活，因此又称之为死亡受体途径。这些受体分子包括TNF受体（肿瘤坏死因子受体）、FAS1以及TRAIL（TNF 相关凋亡诱导配体）/Apo2L

22、的受体，配体分子（TNF、Fas L或TRAIL）与它们相应的受体结合后，激活受体分子的死亡结构域，死亡结构域募集衔接分子FADD（FAS-associated death domain protein），FADD的死亡效应域募集并激活caspase-8、10，激活的caspase-8、10水解并激活caspase-3、6、7，导致细胞凋亡。,内源性和外源性凋亡途径可交互联系，共同作用越过细胞的凋亡阀，导致细胞发生凋亡。,在很多肿瘤中抗凋亡的BCL2家族分子（BCL2 和 BCLX）过表达。此外，IAPs（survivin、XIAP、IAP1和IAP2）在临床肿瘤标本和肿瘤细胞株中也常常过表达

23、。这些抗凋亡分子水平的增加，使肿瘤细胞具有较高的凋亡阀值，表现出抗凋亡活性。因此，抑制肿瘤细胞的抗凋亡活性是有效的治疗策略。,靶向内源性凋亡信号通路的肿瘤治疗,临床前的研究表明，BCL2、XIAP和Survivin的下调，Smac 的上调，可启动肿瘤细胞株和移植瘤凋亡，同时也增加肿瘤细胞株和移植瘤对放疗或化疗的敏感性。细胞内抗凋亡分子与促凋亡分子的比例似乎比它们的绝对量更为重要。,目前，主要用三种治疗策略来抑制抗凋亡信号，靶向内源性凋亡途径，包括反义寡核苷酸、小分子抑制剂和模拟分子。此外，有几种具有广谱作用机理的药物也具有抑制抗凋亡信号的作用，如 proteasome 抑制剂、HSP90 抑制

24、剂等。,反义寡核苷酸,反义寡核苷酸可与特异mRNA序列杂交，通过依赖RNase-H的mRNA降解过程，抑制抗凋亡分子的翻译表达。反义寡核苷酸通过细胞吞噬作用被摄入胞内，易被胞内的核酸酶降解，只有很少比例能保留发挥作用。因此，需要反复静脉或皮下注射，以弥补它的短的半衰期。,Oblimersen是第一代抑制BCL2的反义核酸。SPC2996也是BCL2的反义核酸，具有高亲和性、抗核酸酶的性能。LY2181308是 Survivin 的反义核酸。AEG35156是XIAP的反义核酸。,小分子抑制剂和模拟分子,BCL2家族的抗凋亡成员分子（BCL2、BCLX 和 MCL1）有一个疏水的能与促凋亡分子的

25、BH3结构域结合的“口袋”，Gossypol是从棉籽中提取的一种多酚，可与BCL2、BCLX和 MCL1 的疏水“口袋”结合，抑制它们的功能。Gossypol能诱导肿瘤细胞凋亡，与放疗或化疗药物（docetaxel、topotecan、carboplatin、etoposide）联合具有更好的疗效。,Obatoclax(GX15-070)和ABT-263能与BCL2家族的抗凋亡成员分子结合，对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用。Smac 模拟分子可与IAPs分子的凹槽结合，抑制其功能。体内外研究表明，Smac 模拟分子能使肿瘤细胞对促凋亡信号更为敏感。GDC-0152 是一Smac模拟分子，又称IAP

26、 拮抗剂。,26S蛋白酶体通过降解泛素化的蛋白质，对细胞内的蛋白质分子种类和水平具有重要的调节作用，对蛋白酶体的抑制具有直接的促凋亡作用。Bortezomib是一种小分子蛋白酶体抑制剂，它可以通过保护NF-B的抑制分子I-B的降解而降低NF-B的水平，也可增加FAS1、P53和BAX的水平，对多种肿瘤细胞具有促凋亡作用。同时，Bortezomib还可以上调TRAIL受体的表达，使肿瘤细胞对促凋亡刺激更为敏感。,Proteasome 抑制剂,抑制抗凋亡信号的其它策略,Terameprocol 是转录抑制剂，通过结合到一些基因（Survivin）的启动子上，抑制其表达。YM-155可在mRNA和蛋

27、白质水平上抑制 Survivin的表达。HSP-90是Survivin的分子伴侣。因此，HSP-90 抑制剂17-AAG和 shepherdin可抑制 Survivin 的功能，具有促凋亡作用。,靶向死亡受体途径的治疗策略,针对死亡受体途径，有两个直接促凋亡的治疗策略：TRAIL受体激动性抗体和重组的促凋亡配体分子。,Mapatumumab(HGS-ETR1)是人源化的针对TRAIL-R1的激动性抗体。临床前的研究表明，它可诱导TRAIL-R1阳性的多种肿瘤细胞株和肿瘤移植物凋亡。目前，至少有四种针对TRAIL-R2的激动性抗体Lexatumumab(HGS-ETR2)、Apomab、AMG-655 和LBY-135。,TRAIL受体激动性抗体,重组的促凋亡配体分子,重组的人TRAIL(rhTRAIL)以p53非依赖的方式启动多种肿瘤细胞凋亡，对非瘤性细胞几乎没有影响。APO010是重组的人Fas L，是由Fas L的胞外结构域与胶原的部分结构域形成的融合蛋白。TNFerade是一复制缺陷型腺病毒，由放射诱导启动子调控表达人TNF-，TNFerade 注射到瘤体内，放疗诱导TNF-表达，与放疗协同诱导肿瘤细胞凋亡。,小 结,综上所述，肿瘤的发生发展与肿瘤细胞增殖能力增强、抗凋亡密切相关。因此，在抑制肿瘤细胞增殖的同时，诱导凋亡的发生是肿瘤治疗目前正在开发和利用的前瞻性治疗策略。,