细胞信号转导进展G蛋白.ppt

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1、细胞信号转导进展,内 容,绪论第一章 细胞信号分子第二章 蛋白质的可逆磷酸化第三章 离子通道第四章 胞内受体的作用机制第五章 G蛋白介导的信号转导第六章 第二信使cAMP与cGMP 第七章 第二信使IP3,DAG与Ca2+第八章 酪氨酸蛋白激酶途径Ras-Raf-MAPK 信号途径PI3K/Akt 信号途径JAK/Stat 信号途径第九章 TGF-/SMAD信号途径第十章 细胞凋亡信号途径第十一章 Wnt信号途径第十二章 Hedgehog/Notch 途径,G蛋白介导的信号转导,GPCRG蛋白介导的跨膜信号转导小G蛋白,GPCR的分子结构,又称蛇型受体(serpentine receptor)

2、,只存在与真核生物中。通常由单一的多肽链或均一的亚基组成：跨膜区由7个螺旋结构组成；每个疏水跨膜区段由20-25个氨基酸组成，多肽链的N-端位于细胞外区，而C-端位于细胞内区；在第五及第六跨膜螺旋结构之间的细胞内环部分（第三内环区），是与G蛋白偶联的区域。,GPCR Art,mAchRA类GPCRs,Belongs to subfamily A18M1(CHRM1,ACM1)M2(CHRM2,ACM2)M3(CHRM3,ACM3)M4(CHRM4,ACM4)M5(CHRM5,ACM5)代谢型离子通道,mAchRs的组织分布和功能,5-HT受体A类GPCRs,Subfamily A175-HT2

3、A(HTR2A,5H2A)5-HT2B(HTR2B,5H2B)5-HT2C(HTR2C,5H2C)5-HT6(HTR6,5H6)Subfamily A195-HT1A(HTR1A,5H1A)5-HT1B(HTR1B,5H1B)5-HT1D(HTR1D,5H1D)5-HT1E(HTR1E,5H1E)5-HT1F(HTR1F,5H1F)5-HT4(HTR4)5-HT5A(HTR5A,5H5A)5-HT7(HTR7,5H7)5-HT3为离子通道型受体,B类GPCRs,C类GPCRs,Calcium-sensing receptor-related(CaS)GABAB receptors Metabo

4、tropic glutamate receptors(mGluR),代谢型谷氨酸受体RAIG(Retinoic acid-inducible orphan G protein-coupled receptors)Taste receptors Orphan receptors:孤儿受体，配体未知,C类GPCRs,Cys-richDomain,HeptahelicalDomain,AgonistsAntagonists,G-protein,C类GPCRs 的一般结构,HD,VFT,CRD,Venus FlytrapDomain,Allosteric Modulator,AM,mGlu1 VFT区

5、的晶体结构,Kunishima et al.,Nature,2000,OPEN without Glu,CLOSED with Glu,GABAB 受体异二聚体,代谢型GABA受体，由B1,B2两个亚单位组成。B1与配体GABA结合，B2介导G蛋白的激活。B2可单独转运至细胞膜，B1需与B2形成异二聚体才能转运至细胞膜。B1亚单位的VFT与GABA结合后，VFT关闭，引起跨膜部分的构象改变，激活G蛋白功能：神经递质释放的突触前抑制。,离子型GABA受体,mGluR,与离子通道型GluR(iGluR)不同，mGluR不是离子通道。位于突触前膜及突触后膜，与学习、记忆、焦虑及痛觉有关。功能：修饰离

6、子通道的活性改变突触的兴奋性，如神经递质传递的突触前抑制或诱导突触后应答,mGluR同源二聚体,G蛋白介导的信号转导,GPCRG蛋白介导的跨膜信号转导小G蛋白,参与G蛋白跨膜信号转导的信号分子,GPCRG蛋白（鸟苷酸结合蛋白）G蛋白效应分子第二信使蛋白激酶等一系列的信号分子,G蛋白,鸟苷酸结合蛋白（guanylate binding protein）的简称包括异源三聚体G蛋白和单体G蛋白/小G蛋白,Alfred G.Gilman,Martin Rodbell,1994年10月9日，在诺贝尔颁奖大会上，诺贝尔生理学奖授予给了Alfred G.Gilman 和Martin Rodbell，以表彰他

7、们的重大发现：G-蛋白及其在细胞内信号传导中所起的作用。,G蛋白的活性调节,现已发现，在哺乳动物中，G蛋白的亚基有21种，亚基有5种，亚基有12种。不同的G蛋白能特异地将受体与相应的效应酶偶联起来，将特异的信息传递到细胞内。,异源三聚体G蛋白的种类,蛋白a亚基,Gas 与 Gai 的抑制剂,霍乱毒素(cholera toxin)能催化ADP核糖基共价结合到Gs的亚基上，抑制亚基的GTPase活性，从而抑制了GTP的水解，使亚基持续活化，导致患者细胞内Na+和水持续外流，产生严重腹泻而脱水。,百日咳毒素(pertussis toxin)使Gi蛋白亚基ADP核糖化，阻止亚基上的GDP被GTP取代，

8、使其失去对AC的抑制作用，使cAMP的浓度增加,促使大量的体液分泌进入肺，引起严重的咳嗽。,G蛋白的效应分子,某些离子通道,接受G蛋白的直接或间接调控。酶类:主要有腺苷酸环化酶(AC)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶A2(PLA2)、鸟苷酸环化酶(GC)和依赖于cGMP的磷酸二酯酶(PDE)。它们都能通过生成(或分解)第二信使，实现细胞外信号向细胞内的转导。,G蛋白调节的离子通道,（a）神经递质乙酰胆碱与心肌细胞的膜受体结合，使得G蛋白的亚基与、亚基分开；（b）激活的、亚基复合物同K+离子通道结合并将K+离子通道打开；（c）亚基中的GTP水解，导致亚基与、亚基重新结合，使G蛋白处于非活性状态，使K

9、离子通道关闭。,GPCR能够激活心肌质膜的K+离子通道打开,通过神经递质乙酰胆碱调节心肌收缩,GPCR介导的跨膜信号传递,磷脂酰肌醇信号通路,cAMP 信号通路,1化学感受器中的G蛋白气味分子与受体结合，激活腺苷酸环化酶，产生cNMP，开启cNMP门控阳离子通道，引起钠离子内流，膜去极化，产生神经冲动，形成嗅觉或味觉。2004年Axel和Buck因发现气味受体和化学感受器系统的组成而获诺贝尔生理或医学奖。,其他G-蛋白,其他G-蛋白,2视觉感受器中的G蛋白视紫红质为7次跨膜蛋白，由视蛋白和视黄醛组成。其信号途径为：光信号Rh激活Gt活化cGMP磷酸二酯酶激活胞内cGMP减少Na+离子通道关闭离

10、子浓度下降膜超极化神经递质释放减少视觉反应。,G蛋白介导的信号转导,GPCRG蛋白介导的跨膜信号转导小G蛋白,小G蛋白家族,特点：分子量小，2128kD的小肽，为单体功能：与G类似，起分子开关的作用与大G蛋白相同点：当结合GTP时成为活化形式当GTP水解成为GDP时(自身为GTP酶),则回复到非活化状态与大G蛋白不同点：主要受酪氨酸蛋白激酶的调节需要中介蛋白,Ras,Ras:大鼠肉瘤(rat sarcoma,Ras)的英文缩写原癌基因c-ras的表达产物通过脂肪酸链(异戊烯基)嵌入细胞膜中。Ras.GDP:无活性形式 Ras.GTP:活性形式,Ras的分类,哺乳动物：H-Ras,K-Ras(R

11、as4A,Ras4B),N-Ras1960s,Jennifer Harvey与 Werner Kirsten发现大鼠肉瘤中存在病毒，分别命名为HRAS、KRAS病毒。NIH的Edward M.Scolnick 及其同事在HRAS,KRAS病毒中发现具转化、致癌活性的癌基因。1982年,哈佛的Geoffrey M.Cooper，NIH的Mariano Barbacid、Stuart A.Aaronson及MIT的 Robert Weinberg 在人癌细胞中发现具转化活性的ras 基因。N-Ras:首先在人成神经细胞瘤(neuroblastoma)中发现。,Robert A.Weinberg,F

12、ounding member of MIT Whitehead Institute for biomedical research.A pioneer in cancer research mostly known for its discoveries of the first human oncogene the ras oncogene that causes normal cells to form tumors,and the isolation of the first known tumor suppressor gene-the Rb gene.1.The Biology of

13、 Cancer,by Robert A.Weinberg,June 2006,(Garland Science Textbooks),864pp.2.One Renegade Cell(Science Masters)by Robert A.Weinberg,October 01,1999,170pp.3.Racing to the Beginning of the Road:The Search for the Origin of Cancer,by:Robert A.Weinberg,May 01,1996(Harmony Books)270pp.4.Genes and the Biolo

14、gy of Cancer(Scientific American Library)by:Harold Varmus,Robert A.Weinberg,October 01,1992,215pp.5.Oncogenes and the Molecular Origins of Cancer(Monograph Ser No.18),March 01,1990,Cold Spring Harbor(R.A.Weinberg,Editor)270pp.,Ras的一级序列,G-domain:166 aa,前164 aa 高度同源绿色：相同残基淡紫色：保守替代残基黄色：高度可变残基红色：突变致癌残基C

15、端：除Cys186外，其他残基高度可变,Ras的翻译后修饰,C端CAAX box中的Cys在胞质中发生异戊烯化修饰，插入ER膜在ER膜上，-AAX被蛋白内切酶切除新的C末端残基Cys发生甲基化修饰甲基化的Ras转运至质膜,进一步发生棕榈酰化修饰 未经异戊烯化修饰的Ras位于胞质中，无活性,Ras的活性调节,Ras与GTP、GDP的结合受RasGEF(鸟苷酸交换因子，guanine nucleotide exchange factors)与RasGAP(GTPase activating protein，GTP酶激活蛋白)的调节。GEF分两类：活化型GEF(Guanosine nucleotid

16、e dissociation stimulators,GDS)抑制型GEF(Guanosine nucleotide dissociation inhibitors,GDI）,Ras的激活与失活,Ras基因突变,在人类肿瘤中，原癌基因ras的突变较为常见，占肿瘤基因突变的20-30%。它们的产物能抑制细胞凋亡，加快癌细胞转移。H-Ras变异蛋白可见于膀胱癌和肾癌。而在几乎所 有的乳腺癌中都可看到变异的K-Ras。另外在肺癌，大肠癌和直肠癌中都可见其身影。K-Ras的作用很可能是通过Ras-Raf-MEK-ERK途径实 现的,这条途径不但能促进血管生成，还会诱发癌细胞的浸润和转移。Constit

17、utive active mutations:P-loop中的G12V突变使Ras对GAP不敏感，从而处于持续性激活状态。参与催化的残基Q61K突变，降低Ras水解GTP的速度。Dominant negative mutations:S17ND119N,Ras 超家族,Ras超家族成员100种，根据氨基酸序列、结构及功能分为10个亚家族：,Rho-GTPases,分类：Rho:RhoA,RhoC,RhoG,RhoHRac:Rac1,Rac2,Rac3Cdc42:Cdc42,TC10,TLC(TC10-like),Chp,Wrch-1RhoD:RhoD,RifRhoH/TTF RhoBTB:Rh

18、oBTB1,RhoBTB2;Miro:Miro-1,Miro-2Rnd:Rnd1,Rnd2,Rnd3(RhoE),不能水解GTP,通常抑制Rho-GTPase信号途径功能：肌动蛋白细胞骨架的动态调节，包括细胞形态、极性、运动、囊泡运输、伪足形成等细胞生长、增殖、分化、ROS(reactive oxygen species)的产生及存活由来自GPCR,integrins及 growth factor 受体的信号所激活,细胞骨架(Cytoskeleton),Cell Motility,肌动蛋白细胞骨架的动态调节,Rho:形成张力丝(stress fibers)Rac:membrance ruffl

19、ing,lamellipodium(层状伪足)CDC42:filopodia(丝状伪足),Focal Adhesion,Red:stress fibersGreen:focal adhesions,Focal Adhesion Complex,Integrin:整合素介导细胞与细胞间的相互作用及细胞与细胞外基质间(fibronectin,vitronectin,collagen,laminin中的RGD三肽序列)的相互作用由(120185kD)和(90110kD)两个亚单位形成异二聚体迄今已发现18种亚单位和9种亚单位,它们按不同的组合构成25余种整合素Talin,Paxillin,Vincu

20、lin:focal adhesion markersSrc:non-recpetor tyrosine kinaseFAK:focal adhesion kinase,张力丝的形成Rho,Filopodia,Macrophage,Fibroblasts,Lamellipodia,Fibroblasts,Early Spreading,Huveneers,S.et al.J Cell Sci 2009;122:1059-1069,RhoGAPs and RhoGEFs,RhoE,在1996年被发现的RhoE饰演着抑制癌症的角色。与其他游移于激活/失活状态的G蛋白不同，RhoE持续与GTP结合，一

21、直处于激活状态，所以其功能的上下调节靠的是其表达水平。根据另一项研究，RhoE不 仅在细胞增殖方面起到调节作用，则在细胞迁移方面发挥着其功能，甚至将某些癌细胞引向细胞凋亡。Ludwig Institute for Cancer Research的研究人员发现,RhoE会在生长因子的刺激和DNA损坏的情况下表达增高，因此有可能成为癌症的生物标记。RhoE能阻止肌动蛋白的 聚合和应力纤维的形成，因此细胞迁移的能力减弱。RhoE成为癌症治疗的又一新目标。,Ras 超家族,Ras超家族成员100种，根据氨基酸序列、结构及功能分为10个亚家族：,Rab-GTPases 与囊泡转运,Rab-GTPases

22、,Ras-associated binding(Rab)proteins 从酵母到人高度保守人：60种酵母(S.cerevisiae)：11线虫(C.elegans)：29果蝇(D.melanogaster)：26功能：蛋白质与磷脂分子在不同膜结构之间的转运囊泡转运(vesicle trafficking)，包括囊泡的形成、肌动蛋白/微管依赖性的囊泡转运、与受体膜的融合以及囊泡之间的信号传递。,Rab-GTPases 的亚细胞分布和功能,CCV,clathrin-coated vesicles;EE,early endosomes;ER,endoplasmic reticulum;LE,lat

23、e endosome;PM,plasma membrane;RE,recycling endosome;SV,synaptic vesicle;TGN,trans-Golgi network;U,ubiquitous,Rab-GTPases,6个b片层，5个a螺旋，10个loops(l)红色：Rab 特异性残基(RabF1-5)；深紫色：Rab亚家族特异性motif(RabSF1-4)；蓝色：高度保守的核苷酸结合motif(G1-3);PM:phosphate/Mg2+结合motif C端同源性小，参与Rab-GTPases的亚细胞定位，而鸟苷酸结合位点高度保守,Rab-GTPase Cycl

24、es,Rab 在内质网合成后，首先与Rab escort protein(REP)结合形成稳定的复合体。Rab C末端的Cys motif 在Rab 香叶酰香叶基转移酶(Rab geranylgeranyl transferase,RabGGT)的作用发生异戊烯化，RabGGT 由a,b亚单位组成。REP将Rab转运至供体膜(donor membrane)后，与Rab解离，参与下一轮循环(蓝色箭头)。,Rab-GTPase Cycles(Contd),在供体膜上，无活性的Rab.GDP在RabGEF作用下与GDP解离，同时与GTP结合，成为有活性的Rab.GTP,后者在RabGAP的作用下回复

25、到无活性的Rab.GDP形式。被激活的Rab可与结构和功能各异的效应分子相结合，包括供体膜上的cargo sorting complexes、参与囊泡转运的动力蛋白(motor protein)以及调节囊泡与受体膜融合的tethering complexes。囊泡与受体膜融合，释放所转运货物；Rab.GDP在GDP解离抑制蛋白(GDP dissociation inhibitor,GDI)的作用下，从受体膜回到供体膜上，参与下一轮循环。,囊泡转运,在供体膜出芽部位，Rab与效应分子形成复合物；出芽部位与供体膜分离，形成转运囊泡。转运囊泡脱去包被蛋白，通过动力蛋白中介分子(motor adapt

26、er)与动力蛋白结合。动力蛋白水解ATP提供能量，使转运囊泡沿微管向受体膜方向运动。供体膜上的v-SNARE与受体膜上的t-SNARE相互识别，形成tethering complex。v-SNARE插入受体膜中，供体膜与受体膜融合，释放所转运物质。GDF:GDI displacement factorSNARE:soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor,SNAREs介导的膜融合,v-SNARE is comprised of two proteins:synaptobrevin&VAMP(Vesi

27、cle Associated Membrane Protein)t-SNARE is made up of the proteins:syntaxin and SNAP-25 Conformational changes occur in the v-SNARE-t-SNARE association A fusion protein complex is formed with SNAP25 which binds to syntaxin and VAMP The fusion protein complex disrupts the lipid bilayers leading to bi

28、omembrane fusion,问 题,异源三聚体G蛋白是否与小G蛋白相似，其活性也受GEF及GAP的调节？,RGS超家族,Regulator of G-protein signaling，1996年首次发现。RGS蛋白具有特征性的由120个氨基酸组成的“RGS-box”domain，与G蛋白的Ga亚单位结合，大大增强Ga亚单位的内在GTPase 活性，削弱G蛋白介导的信号转导，因此被认为是G蛋白的GAP。人基因组：37个编码基因，分为10个亚家族。,RGS亚家族结构示意图,RGS同源关系树,RGS的GAP活性,G蛋白的生物学意义,G蛋白系统是许多信号传递途径的中心环节，因此也就成了众多药物

29、和毒素攻击的靶位点。市面上的很多药物，如Claritin和Prozac，以及大量滥用的毒品：可卡因，海洛因，大麻等，通过与G蛋白偶联进入细胞发挥其药性。,新药开发的有效靶点,目前世界药物市场上有1/3的小分子药物是GPCR的激活剂或拮抗剂。世界上前20位销售额最高的药物中，有12种药物的作用靶标是G蛋白受体相关药物，这些药物包括充血性心力衰竭药物Coreg、高血压药物Cozaar、乳腺癌药物Zoladex、焦虑药物Buspar、精神分裂药物Clozaril。,目前，鉴定出的G蛋白偶联受体的新药有几百种。例如，在镇痛剂研制中发现，CGRP受体拮抗剂hCGRP(8-37)可辅助治疗疼痛和改善吗啡耐受。2006年4月21日，公布在JBC的一项研究表明，抑制一种叫做血红素加氧 酶-1（一种与铁代谢有关的酶）能够缓解Kapos肉瘤的生长，Kapos肉瘤病毒基因中含有能编码一种叫做病毒G蛋白偶联受体的序列，而该受体在肿瘤的发育中起关键作用。,小结,GPCR结构、分类G蛋白介导的跨膜信号转导cAMP信号通路磷脂酰肌醇信号通路小G蛋白：Ras：Ras/Raf/MAPK信号通路Rho：细胞骨架的动态调节Rab：囊泡转运RGS：G蛋白GAP,