血清酶类测定精要.ppt

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1、血清酶类测定,第一节 概述,血浆特异酶 为血浆蛋白的固有成分，含量高于其他组织，在血浆中发挥特定的催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入血，在一定条件下被激活起作用。与凝血有关的酶或酶原、ChE、Cp及LPL等。非血浆特异酶 外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌进入血浆的酶,包括P-AMY、P-LPS、前列腺ACP等。细胞内酶：存在于细胞内进行物质代谢的酶，随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液，细胞内外浓度差异悬殊，当其大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受损，最常用于临床诊断。,一、血清酶的来源,二、血清酶变化的病理生理机制,（一）细胞酶释放,1、细胞内外酶浓度的差异：,对于非血浆特异酶

2、，细胞内外浓度差可在千倍以上，因此只要有少量细胞坏死或者细胞有轻度病变，血中酶浓度就可能明显升高。,2、酶在细胞内定位与存在形式：,最容易释放入血的是胞质中游离的酶，而在细胞亚显微结构中的酶则较难溢出,3、酶蛋白分子量的大小：,酶的释放速度大致与酶的分子量成反比,（二）血中酶的清除：,一般以血中酶的半寿期来代表酶从血中清除快慢,AST 半寿期 175h ALT 半寿期 4710h,（三）酶合成异常：,1、合成减少：,2、合成增加：,对于血浆特异酶，细胞内酶合成下降是引起血中酶变化的重要因素,（1）癌细胞 LD（2）骨骼疾病 ALP（碱性磷酸酶）（3）前列腺癌 ACP（酸性磷酸酶）,（四）其他：

3、,测定值受抑制剂和活化剂影响,三、血清酶的生理变异,1.性别 少数酶如CK、ALP及GGT等有性别差异，与血清酶的 来源组织有关。2.年龄 血清酶的活性随年龄而变化，ALP和GGT到老年时可有 轻度升高。年龄差异也见于同工酶。3.进食 过量饮酒可使血清GGT明显升高。4.运动 多种血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT 等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及 骨骼肌所含的酶量有关。5.妊娠 胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、LD、LAP和ALT（少数）等，引起血清中这些酶活性升 高。6.其他 一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变 化及家庭因素有关。

4、,四、酶的区域化分布,五、酶活性测定在临床诊断中的应用,（一）在诊断肝胆疾病中的应用,反映肝细胞实质病变：ALT、AST,反映肝细胞合成功能：ChE、LCAT,反映胆道阻塞病变：ALP、GGT,反映肝纤维化病变：MAO,（二）在诊断急性心肌梗死中的应用,CK-MB，LDH1，AST,（三）在诊断急性胰腺炎中的应用,ALP,（四）在诊断骨骼疾病中的应用,AMY，LPS,（五）在诊断肌肉疾病中的应用,AST，CK，LDH，ALD,（六）在诊断前列腺疾病中的应用,同工酶,（七）在诊断肿瘤中的应用,ACP,第二节 临床常用血清酶活性测定,标本（血清或血浆）,临床酶学测定酶之前，标本还要经过采集、分离和

5、储存等一系列处理过程。而酶在血中处于一个动态变化过程，血液离开机体后还会有一定变化。因此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值的变化。,标本应避免溶血：,大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多，少量血细胞的破坏就可能引起血浆中酶明显升高。如红细胞内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高150、15和7倍左右，故测定这些酶时，样品应避免溶血。,及时分离血清（血浆）：,静脉采血后，必须在1-2h内及时离心，将血清与血细胞、血凝块分离，以免血细胞中的酶通过细胞膜进入血清而引起误差。,尽量用血清标本：,大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，临床上除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一般都应以血清

6、作为首选测定标本。,及时测定，如不能及时测定，应放入冰箱保存（但有些标本不能冷冻）,为防止酶蛋白变性，一般至少应在血清分离后的当天进行测定，否则应放冰箱冷藏,有些酶如LD及其同工酶(LD4和LD5)在低温(特别是20冰冻)可引起不可逆性失活，反而不如室温稳定（“冷变性”）。,氨基转移酶活性测定,氨基转移酶又称转氨酶，在机体内多达60余种，广泛存在于肝脏、心肌、骨骼肌、肾、脑、胰、肺、白细胞、红细胞中。其中以丙氨酸氨基转移酶(ALT或GPT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST或GOT)两种最为重要，它们催化机体内氨基酸的转氨基反应：ALTL-丙氨酸+-酮戊二酸 丙酮酸+L-谷氨酸 ASTL-天门冬氨

7、酸+-酮戊二酸 草酰乙酸+L-谷氨酸,A-NH2+B A+B-NH2,转氨酶,测定方法,一、速率法（连续监测法）原理,NADH在340nm处有特征吸收峰，连续监测NADH消耗引起的340nm吸光度变化,根据340nm处吸光度下降速率（A/min）计算ALT活性,参考方法,血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定,1.该ALT测定法中存在两个消耗NADH的副反应,评价,双试剂法：血清与缺少-酮戊二酸的底物溶液混合，37保温5min，使样品中所含内源性-酮酸（如丙酮酸）引起的副反应进行完毕。然后，加入-酮戊二酸启动ALT的催化反应，在波长340nm处连续监测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速

8、率(-Amin)，计算出ALT活力单位。（ALT测定的首选方法）,血清中存在的游离-酮酸（如丙酮酸）和增多的谷氨酸脱氢酶（GLDH）能消耗NADH，使测定值偏高。,2.在IFCC推荐的试剂盒中含有P5P，这是转氨酶的辅基，能使血清中ALT发挥最大活性。,（二）定时比色法（两点法）,国内采用的比色测定法有三种：赖氏法（30min）金氏法（60min）改良穆氏法（30min）三种方法的原理、试剂、操作步骤和酶作用温度都相似，单位定义和标准曲线绘制方法有差异。,赖氏比色法,原理：,选择在500-520nm处检测，丙酮酸苯腙的显色强度约为-酮戊二酸苯腙的3倍,活性单位,赖氏法以卡门单位报告测定结果,卡

9、门单位定义：血清1ml，反应液总体积3ml，25，波长340nm，比色杯光径1.0cm，每分钟吸光度下降0.001A为一个单位（相当于每升反应体系中0.1608mol NADH被氧化）。,方法评价,操作简便，不需要紫外分光光度计，易于普及，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。,2.不适用自动分析仪；试剂稳定性差,底物缓冲液不易保存(易长菌);由于赖氏法必须降低底物-酮戊二酸及2，4-二硝基苯肼的浓度，造成ALT测定不是在最佳条件下进行，反应中丙酮酸生成量与ALT活性不能呈现

10、良好的线性关系，这是赖氏法的最大缺陷。,参考区间,赖氏比色法：525卡门单位（反应温度为37）,速率法：男性：540 U/L（反应温度为37，试剂不含P5P）女性：535 U/L（反应温度为37，试剂不含P5P）,ALT广泛分布于全身各组织器官，尤以肝细胞中含量最多，其次是肾脏、心脏及骨骼肌，通常只有极少量释放入血液，所以血清中此酶的活力很低，当这些组织病变时，细胞坏死或通透性增加，细胞内酶大量释放入血，使血清中该酶活力显著增高。,临床意义,(1)肝胆疾病：急性病毒性肝炎、慢性活动型肝炎、脂肪肝、肝癌、肝硬变活动期、中毒性肝炎、胆结石、胆管炎和胆囊炎等。(2)心血管疾病：急性心肌梗死、急性心肌

11、炎、急性心力衰竭、脑出血等。(3)骨骼肌疾病：多发性肌炎、进行性肌营养不良等。（4）一些药物和毒物可引起ALT活性升高：如氯丙嗪、异菸肼、苯巴比妥、奎宁、水杨酸制剂及酒精、铅、汞、四氯化碳或有机磷等,ALT在肝脏疾病中的应用价值,ALT急性明显升高，常达200U以上，病情较重者可达400-600U以上，甚至更高，个别重型病人甚至可超过1000U。ALT越高，肝脏细胞损害越严重。,慢性活动性肝炎：ALT持续轻度升高几十或100U以上（100200U）,慢性肝炎,急性肝炎,重型肝炎,由于肝细胞发生大量变性，坏死，使ALT大量进入血液，因此，ALT迅速升高，高达数百1000U以上，如果ALT含量越高

12、，上升越快，说明肝细胞坏死严重，病情进展也越快。,当病情发展到一定的严重程度，肝细胞大量坏死，肝脏生产ALT的能力丧失，这时血液中的ALT降低，但是黄疸却持续升高（胆红素上升），这种现象即所谓“酶胆分离”，往往提示病情正在恶化，常是肝坏死征兆。,ALT增高程度与肝硬化的活动度和肝组织炎症改变及肝细胞损害程度相一致。对ALT进行监测有助于对肝硬化病情的判断。若是静止性肝硬化，则ALT维持正常；肝硬化病人的转氨酶出现较大幅度的升高，提示病情可能发展成活动性，须引起警惕。,肝硬化,肝癌,80%90%肝细胞都是在肝硬化基础上发生的，因此，在早期，ALT是否增高主要决定于肝硬化的活动程度。若是静止性肝硬

13、化，则ALT维持正常，因为肝细胞发生癌变时，细胞并没有坏死破坏，ALT没有释放出来，因此，ALT没有升高，或ALT有轻度或中度增高。,血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性测定,测定方法,一、速率法（连续监测法）,NADH在340nm处有特征吸收峰，连续监测NADH消耗引起的340nm吸光度变化,根据340nm处吸光度下降速率（A/min）计算AST活性,参考方法,ASTL-天门冬氨酸+-酮戊二酸 草酰乙酸+L-谷氨酸 自发脱羧 丙酮酸,（二）赖氏比色法,参考区间,赖氏比色法：828卡门单位（反应温度为37）,速率法：840 U/L（反应温度为37，试剂不含P5P）,临床意义,1.AST广泛分布

14、于全身各组织器官，在心肌细胞内含量最多，当心肌梗死时，血清中AST活力增高，在发病后612h之内显著增高，在48h达到高峰，约在35d恢复正常。2.血清中的AST也可来源于肝细胞，各种肝病可引起血清AST的升高，有时可达1200卡门单位，中毒性肝炎还可更高。3.肌炎、胸膜炎、肾炎及肺炎等也可引起血清AST的轻度增高。,AST/ALT比值大小有助于临床判断肝病严重程度,急性肝炎的AST/ALT均值为0.56:1,肝硬化的AST/ALT均值为1.13：1,肝癌组AST/ALT均值为2.41：1,急性肝坏死组AST/ALT均值为3.61：1,肝细胞中的总含量：AST（主要存在于肝细胞线粒体内）ALT

15、（主要存在于肝细胞胞浆内）,肝细胞轻度损伤时主要是胞浆酶释放出来，血清中ALTAST；而肝细胞重度损伤时胞浆酶、线粒体酶均释放出来，血清中ASTALT；随着肝病由轻变重，AST/ALT的比值就由1变为1,血清碱性磷酸酶（ALP）活性测定,碱性磷酸酶(ALP或AKP)是一组底物特异性较低,在碱性条件下（最适pH为10左右）能水解很多磷酸单酯化合物的酶。ALP广泛分布定位于细胞膜表面，其含量依次为肝、肾、胎盘、小肠、骨骼等。血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼，主要用于诊断肝胆和骨骼疾病,测定方法,一、速率法原理,以对-硝基苯酚磷酸钠（PNPP）为底物，AMP或二乙醇胺（DEA）为磷酸酰基的受体。在碱

16、性条件下，ALP催化PNPP水解释放出磷酸基团，生成游离对-硝基酚（p-nitrophenol,PNP），PNP在碱性溶液中转变成醌式结构，呈现较深的黄色。根据405nm处吸光度增加的速率（A/min）推算出血清ALP活性单位。,1测定ALP活性受缓冲液种类的影响2.血清标本应新鲜，置室温(25)6h测定，ALP活性约增高1；置室温14d，ALP活性增高36；若冰冻保存，血清复溶后ALP活性升高可达30。3血清稀释度对ALP活性测定有影响。血清与底物缓冲液之比一般在1：501：100之间。稀释度低于1：50时，酶活力降低。4一般用血清与肝素抗凝血浆测定ALP活性。抗凝剂如EDTA-Na2、草酸

17、盐、柠檬酸盐等因能络合Mg2+而抑制ALP活性，故不能使用这类抗凝剂的血浆做于ALP活性测定。5ALP测定受年龄与性别、饮食、运动和妊娠等因素的影响。,注意事项,灵敏度高、线性范围宽（500U/L以上）和精密度高，是我国及IFCC的推荐方法,方法评价,二、金氏比色法原理,在pHl0的碱性条件下，ALP催化磷酸苯二钠底物水解，生成游离的酚和磷酸氢二钠。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林结合，并经铁氰化钾氧化生成红色的醌类衍生物，根据红色深浅计算出ALP活力的大小。,磷酸苯二钠比色法与更早的布氏法相比具有较大的优点，如水解速度快，保温时间较短、灵敏度较高、显色稳定、不需去蛋白、操作简单、快速。但与磷

18、酸对硝基酚速率法相比，准确度、精密度较低；操作比较繁琐,，灵敏度低。,方法评价,活性单位,ALP金氏单位定义是100ml血清，37与底物保温15分钟，产生1mg酚为1个金氏单位。,参考区间,金氏比色法：成人：313 金氏单位，儿童：528金氏单位,速率法：女性：112岁 15岁 40 150U/L 男性：112岁 25岁 40150U/L。,ALP检测主要用于诊断肝胆和骨骼疾病,临床意义,(1)肝胆系统疾病：,各种肝内、外胆管阻塞引起的胆汁淤积性疾病：ALP明显升高，且ALP升高与血清胆红素升高相平行，,肝内局限性胆道阻塞（如肝癌、肝脓肿）：ALP明显增高，血清胆红素大多正常。,累及肝实质细胞

19、的肝胆疾病（肝炎、肝硬化）：ALP轻度升高。,(2)骨骼疾病：,（3）妊娠后期及儿童生长期ALP生理性增高,由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放入血液中，引起血清ALP活力的增高。如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。,血清酸性磷酸酶（ACP）活性测定,酸性磷酸酶是一组对底物专一性不强、在酸性条件下水解各种正磷酸单酯的酶。ACP主要分布于前列腺、肝、脾、红细胞等，但以前列腺含量最为丰富，可为其它组织中酶活力的1000倍。血清中ACP主要来源于前列腺，称为前列腺ACP（PAP），它可被酒石酸抑制；非前列腺ACP，不被酒石酸抑制。正常男性血清中的A

20、CP约有1/31/2来自前列腺，其余则与女性血中的ACP一样可能来自血小板或破骨细胞。,ACP的测定底物、原理和方法与ALP 相似，只是反应pH为酸性。如利用磷酸苯二钠法和磷酸对硝基酚法等在酸性条件下测定ACP。国外多推荐使用磷酸麝香草酚为底物的比色法。由于ACP不稳定，酶活性测定困难，目前已发展一些免疫学方法特异而灵敏地测定ACP（特别是PAP）。因红细胞及血小板富含ACP，标本不能溶血且血标本采取后必须尽快分离血清（血浆）并立即测定。不同方法参考范围也不同。,测定方法,临床意义,前列腺疾病 血清PAP测定是诊断前列腺癌最重要的指标之一。在前列腺肥大、前列腺炎、急性尿潴留时亦可升高。酒石酸抑

21、制试验可区别PAP与非PAP。骨病 恶性骨肿瘤、变形性骨炎、多发性骨髓瘤、骨质疏松、代谢性骨病等轻度增高。肝病 肝癌、肝硬化肝炎时ACP增高。血液病 溶血性疾病、白血肉、血小板疾病等，ACP均有不同程度的升高。,血清-谷氨酰转移酶（GGT）活性测定,GGT是催化-谷氨酰基移换反应的一种酶GGT分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织中，其中以肾脏含量最多。血清中GGT主要来源于肝胆系统。GGT在肝脏中广泛分布于肝细胞的毛细胆管一侧和整个胆管系统，因此当肝内合成亢进或胆汁排出受阻时，血清中GGT增高。,测定方法,一、速率法,以L-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺为底物，双甘肽为谷氨酰基的受体，在

22、GGT的催化下，谷氨酰基转移到双甘肽分子上，同时释放出黄色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，根据405nm处吸光度增加的速率（A/min）推算出GGT活性单位,原理,本法准确度好；精密度好线性范围宽（460U/L）；操作简便；底物溶解度高、稳定性好，自身水解作用小，是IFCC的推荐方法。但对试剂纯度要求高,方法评价,以-谷氨酰-萘胺作为-谷氨酰基的供体，双甘肽作为受体，在GGT作用下，产生-萘胺，后者与重氮试剂反应，产生红色-萘胺-对-偶氮苯磺酸，其色泽的深浅与GGT活力成正比。,二、重氮反应比色法,原理,操作简便，颜色稳定，线性关系好，适合一般分光光度计应用，但底物水溶性较差，缓冲液和pH对结果影

23、响较大，现已较少应用。,方法评价,每100ml血清37作用2小时释放出1mol-萘胺为一单位,活性单位,参考区间,男性 1150U/L（37），女性 732U/L（37）,成年男性 317U/L，成年女性 213U/L,重氮反应比色法：,速率法：,临床意义,尿中GGT活性：,可能有助于诊断肾疾病,血清GGT用于诊断肝胆疾病,1.原发性或转移性肝癌 2.阻塞性黄疸3.病毒性肝炎和肝硬化4.乙醇性肝炎,血清淀粉酶（AMS/AMY）活性测定,人和动物只含-AMY，此酶以Ca2+为必需因子（除肝素外，各种抗凝剂可通过螯合Ca2+抑制AMS活性，故标本必须用血清或肝素抗凝血浆），其最适pH在6.57.5

24、之间，卤素和其他阴离子有激活作用。,血清中的AMS主要有胰型(P型)和唾液型(S型)及其亚型同工酶组成,人体中胰腺含AMY最多，唾液腺也分泌大量AMY。,AMY分子量较小，易由肾脏排出，半寿期很短（约2h），所以病变时血清AMY增高持续时间很短。,测定方法,天然淀粉底物方法：,（分子组成）确定底物方法：,碘-淀粉比色法,目前应用最多的方法是以人工合成的麦芽多糖为底物的方法,如2-氯-对硝基苯麦芽三糖苷（CNP-G3）和亚乙基封闭的对硝基苯麦芽庚糖苷法（亦称EPS法），以后者最常用，也是IFCC的推荐方法。,原理,一、EPS法,对硝基苯酚生成量在一定范围内与AMY活性成比，在405nm可以进行连

25、续监测即可测出AMY的活性。,方法评价：,试剂稳定，水解产物确定，化学计量关系明确，是最常用的AMS测定方法，也是IFCC的推荐方法。,二、碘-淀粉比色法,原理,-淀粉酶,淀粉 葡萄糖+麦芽糖+糊精,+碘液,兰色复合物,血清(尿)中-淀粉酶催化淀粉分子中-1，4-糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖及含有-1，6-糖苷键支链的糊精。在底物充分（已知浓度）的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合，生成蓝色复合物，其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管(此处亦相当于标准管)比较，从而推算出AMS的活力单位。,活性单位,100ml血清(尿)中的淀粉酶，在37 15min水解5mg淀粉为1个单位(U)。,成

26、本低、检测不需要昂贵仪器、试剂稳定、操作简便；但重复性差、准确率低,方法评价：,参考区间,EPS法：,碘-淀粉比色法：,临床意义,血清(尿)AMS活性是诊断胰腺疾病的重要指标。,升高 急性胰腺炎、流行性腮腺炎；急性胆囊炎、肠梗阻、胰腺癌、胆石症、溃疡病穿孔及吗啡注射后。降低 肝炎、肝硬化、肝癌；肾功能障碍。,血清脂肪酶（LPS）活性测定,脂肪酶(Lipase，LPS)是胰腺外分泌酶。LPS可被巯基化合物、胆汁酸、Ca2+及辅脂肪酶等激活剂激活，而被重金属、丝氨酸所抑制。血清中LPS主要来自胰腺，少量来自胃肠粘膜。,测定方法,比浊法（以橄榄油悬液为底物），以连续监测法为常用。分光光度法：酶偶联显

27、色比色法（多用1,2-甘油二酯为底物）采用人工合成底物1,2-二月桂基-rac-丙三氧基-3-戊二酸试灵酯设计的连续监测法。此法为一步速率法，具有简便、快速、灵敏、稳定和抗干扰能力强等特点。,临床意义,主要用于诊断胰腺疾病，在急性胰腺炎发作后212h，血清LPS可显著升高，24h至峰值，4872h可能恢复正常，但随后又可持续升高815天。血清LPS在急性胰腺炎时活性升高的时间早，上升幅度大，持续时间长，故其诊断价值优于AMY。在酗酒、乙醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝胆疾患等血清LPS也可有不同程度的升高。,血清单胺氧化酶（MAO）活性测定,单胺氧化酶(MAO)是一组催化多种单胺类化合物氧化

28、脱氨的酶，其底物特异性不高。在有氧条件下，MAO能催化多种伯胺，如酪胺、多巴胺和色胺等脱去氨基，生成相应的醛、NH3等,MAO有MAO-，MAO-及MAO-三型，血清MAO-活性升高常见于器官纤维化，特别是肝硬化和肢端肥大症;血清MAO-活性升高常见于大面积肝坏死，是诊断肝硬化的重要指标。,测定方法,速率法,以苄胺为底物，在O2和H2O参与下，MAO催化生成苄醛、NH3和H2O2，产生的NH3再在谷氨酸脱氢酶催化下，与-酮戊二酸和NADH反应，生成谷氨酸和NAD+。在340nm波长下监测NADH吸光度的下降速率，即可计算出MAO活力。,醛苯腙法,底物苄胺在MAO作用下氧化生成苄醛，苄醛与2，4

29、-二硝基苯肼反应生成醛苯腙，在碱性溶液中呈红棕色，在470nm比色测定。,临床意义,血清MAO活性测定是检查肝纤维化病变的重要指标,血清MAO-活性升高主要见于肝硬化和肢端肥大症（器官纤维化患者血清MAO活性升高与结缔组织代谢亢进有关）；血清MAO-升高则主要见于大面积肝坏死（爆发性肝炎患者血清MAO活性升高与MAO从坏死的肝细胞线粒体上脱落有关）,血清乳酸脱氢酶（LDH）活性测定,乳酸脱氢酶(LD或LDH)催化乳酸氧化成丙酮酸，同时将氢转移给辅酶NAD+而成为NADH。L-乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+LD是一种含锌的糖酵解酶，广泛存在于人体各组织中，以肝、心肌、肾、肌肉、红细胞含量较

30、多。组织中LDH活力约比血清高1000倍，红细胞内LDH活力较血清约高100倍（溶血可引起LDH明显升高）。LDH有5种同工酶。,pH8.89.8,pH7.47.8,测定方法,目前根据LDH催化反应方向的不同，有两大类测LD方法：以丙酮酸为底物（反应方向PL）的逆向反应(称LD-P法)以乳酸为底物（反应方向LP）的顺向反应(称LD-L法)我国多采用目前IFCC参考方法LD-L法，用连续监测法进行测定。,一、乳酸为底物的速率法（LD-L法）,原理,方法评价,乳酸盐和NAD+底物液的稳定性比丙酮酸盐和NADH 底物液的稳定性大，试剂若冰冻保存，前者可稳定6 个月以上，而后者只能保存数天；保持线性速

31、率反应的时间范围较宽重复性比LD P 法好。,LD-L法与LD-P法相比的主要优点：,注意事项,由于逆向反应速度比正向反应速度快，所以测定方法不同，正常值也有差别，LDP 法的参考值约二倍于LDL 法。,不同的LDH同工酶对冷的敏感性有差异。LDH4和LDH5对冷特别不稳定。在低温(特别是20冰冻)可引起不可逆性失活，反而不如室温稳定（“冷变性”）。故血清标本应存放在室温中，室温存放2 3 天将不出现活性的丧失。如果血清标本必须存放较长时间，应加入NAD 或谷胱甘肽后保存于4 环境中以降低LDH4和LDH5的失活速率。,标本采集：用血清或肝素抗凝血浆测定LDH活性的效果令人满意，草酸盐抗凝剂对

32、LDH活性有抑制作用。标本应严格避免溶血。,乳酸脱氢酶在有辅酶I(NAD+)存在的情况下，催化乳酸脱氢生成丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成丙酮酸-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色。其颜色深浅与丙酮酸浓度成正比，同样处理丙酮酸标准液进行比色，即可求得LDH的活力单位。反应式如下：,二、比色法,原理,LDH 乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+,丙酮酸+2，4-二硝基苯肼 丙酮酸-二硝基苯腙+H2O,NaOH,活性单位,100ml血清在37，与底物作用15min，产生lmol丙酮酸为1个金氏单位。,参考区间,乳酸为底物的速率法：,109245 UL,比色法：190437金氏单位,临床意

33、义,LDH测定常用于心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。LDH与LDH同工酶测定有助于判定LDH的组织来源(见LDH同工酶测定)。LDH与CK-MB、AST联合可判定心肌梗死的病程。,LDH活力增高主要见于以下疾病：,1心血管疾病 LDH由于分子量较大，在常用心肌酶中升高最迟，心肌梗死患者在发生胸痛后812hLDH开始升高，2448h达高峰，升高水平通常为正常的34倍，最高可达10倍。因其半寿期较长，增高持续时间可维持7d左右或更长。此时其他酶已恢复正常，在亚急性心肌梗死诊断上有一定价值。LDH中度升高见于心肌炎，伴有肝淤血的心衰，重度休克及缺氧。2肝病 伴有黄疸的中毒性肝炎患者，LDH可

34、达正常10倍。LDH升高亦可见于病毒性肝炎、传染性单核细胞增多症、肝硬化等。3恶性肿瘤 70有肝转移的肿瘤患者及2060无肝转移的肿瘤患者有LDH水平升高。霍奇金病、腹部及肺部肿瘤、胚胎细胞肿瘤、白血病等亦有LDH升高。4其它疾病 溶血性疾病、肾病、进行性肌营养不良、肺栓塞亦伴有LDH升高。,测定血清及胸腹水中LD含量常用来鉴别其为漏出液抑或渗出液，若胸水LD血清LD0.6、腹水LD血清LD0.4为渗出液，反之为漏出液。,LDH是由H（心型）和M型（肌型）两种不同亚基组成的四聚体，形成5种结构不同的同工酶。按电泳速度命名。,血清乳酸脱氢酶同工酶测定,心肌，肾和红细胞中以LDH1和LDH2最多骨

35、骼肌和肝中以LDH4和LDH5最多肺，脾，胰，甲状腺，肾上腺和淋巴结等组织中以LDH3最多,测定方法,测定LDH同工酶的方法主要有5类：电泳法；离子交换柱层析法；免疫学法；抑制剂法；酶水解法等。其中电泳法为应用最早且目前应用最广泛的方法，在电泳法中有琼脂糖电泳法、乙酸纤维素膜电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳和全自动电泳（也是一种琼脂糖电泳）等。,参考区间,健康成年人血清中LD同工酶存在如下规律：LD2LDlLD3LD4LD5部分正常儿童血中可见LDlLD2。,临床上测定LD同工酶有助于相应组织病变的诊断。,临床意义,心肌梗死和心肌炎：以LD1和LD2升高为主，LD1升高最为显著，LD1/LD21，即

36、所谓“反转比率”现象，且持续的时间长，故视为诊断AMI的一个特异指标。,骨骼肌和肝细胞损伤：LDH5增高且LDH5LDH4，是诊断肝细胞坏死的敏感指标。,其它：肺、胰、脾、淋巴结坏死和炎症及各种恶性疾病时LD2、LD3、LD4升高；溶血性疾病时LD1和LD2升高，但仍为LD2LD1；恶性肿瘤如转移到肝脏往往伴有LD4、LD5升高。,血清肌酸激酶（CK）活性测定,肌酸激酶(CK)催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之间的磷酸转移的可逆性反应，反应平衡点与体系pH有关。,CK广泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑。红细胞不含CK，轻度溶血不影响结果。,pH9.0Cr+ATP CrP+ADP

37、 pH6.7,测定方法,CK活性测定可利用正向反应，也可利用逆向反应，由于以磷酸肌酸为底物的逆向反应速度快，约为正向反应速度的6倍，所以采用逆向反应进行测定较为普及。测定方法有比色法（如肌酸显色法）、速率法(酶偶联法)和荧光分析法。其中以速率法最常用，有两种工具酶及指示酶参与反应。IFCC测定CK的参考方法为速率法(酶偶联法)。,一、速率法(酶偶联法),可在340nm波长下测定NADPH生成速率而计算CK活性浓度。,二、肌酸显色法,磷酸肌酸和二磷酸腺苷(ADP)在肌酸激酶催化下，生成肌酸和三磷酸腺苷(ATP)。肌酸与双乙酰(2，3-丁二酮)及-萘酚结合生成红色化合物。在一定范围内，红色深浅与肌

38、酸含量成正比，从而可求得血清中CK活力。在反应体系中加入Mg2+作激活剂。半胱氨酸供给巯基，保持CK活性中心必需基团不被氧化。氢氧化钡和硫酸锌沉淀蛋白并中止反应。,临床意义,骨骼肌中CK含量较高，在各种类型的进行性肌萎缩时CK活性均可增高。,临床上主要用于诊断心肌梗死。急性心肌梗死后36h就开始急剧升高，可高达正常上限的1012倍，2030h达高峰。CK对诊断心肌梗死较AST、LDH的特异性高，但此酶增高持续时间短，在24d后就恢复正常。病毒性心肌炎时，CK活力也明显升高，对诊断及判断预后有参考价值。,CK总酶与CK同工酶联合测定可判定CK的来源(见CK同工酶测定)。,血清肌酸激酶同工酶测定,

39、在细胞质有三种同工酶：,CK-BB（CK-1）脑型同工酶 脑、前列腺、肠、肺、膀胱、子宫、胎盘及甲状腺占优势，正常血清CK-BB含量极少，用一般方法测不出。CK-MB（CK-2）心型同工酶主要分布于心肌中，正常血清含有少量的CK-MB，不超过总活性的5%。CK-MM（CK-3）肌型同工酶,（氧化型中间型还原型）,（CK-MB1CK-MB2）,（CK-MM1CK-MM2CK-MM3）,骨骼肌及心肌占优势，正常血清绝大部分为CK-MM的活性,肌酸激酶（CK）分子是由M亚基和B亚基组成的二聚体。,在细胞线粒体内的另一种同工酶：CK-Mt（CK-4）,CK-Mt存在于细胞的线粒体膜上，在正常血清中CK

40、-Mt是不出现的。当线粒体崩解时，线粒体膜的小碎片进入血液，故CK-Mt成低聚状态。,临床意义,不同组织受损、坏死，血清中就有不同的CK同工酶增高,血清中CK-MB升高是公认的诊断AMI和确定有无心肌坏死的重要指标,此同工酶对心肌梗死的特异性可高达100。CK-MB的特异性超过了AST、LDH、CK，甚至超过LDH1。急性心肌梗死发病24h血清CK-MB即开始上升(CK-MB大于15UL)，先于CK总活性的升高，1224h达到峰值，如无并发症3d后恢复至正常水平。AMI时血清CK-MB/CK总活性大于6，最高值可达1238。若下降后的CK-MB再度上升，提示有心肌梗死复发。,CK亚型测定在早期

41、诊断AMI的价值,CK-MM1CK-MM2CK-MM3，CK-MB1CK-MB2。,正常血清中各亚型的含量：,组织型的MM3和MB2大量释放入血，CK-MM3/CK-MM1和CK-MB2/CK-MB1比值超过1.0，此变化明显早于CK和CK-MB的升高。CK-MB2/CK-MB1在AMI发病后1小时达到峰值，CK-MM3/CK-MM1在3小时达到峰值。显然CK亚型分析在早期诊断AMI的特异性和灵敏度方面优于CK总酶和同工酶。,AMI时：,当前常规测定CK同工酶多用电泳法和免疫抑制法，但免疫抑制法会受到巨CK（巨CK1是CK-BB与免疫球蛋白复合物;巨CK2即CK-Mt）或CK-BB异常增高时的

42、干扰，实践证明电泳法和CK-MB单克隆抗体免疫法与免疫抑制法有互补作用，可最终确定有无巨CK或CK-BB 的干扰。CK同工酶亚型（CK-MM亚型和CK-MB亚型）多用琼脂糖凝胶高压电泳和等电聚焦电泳等。,测定方法,原理：用羊抗CK-M抗体与病人血清共同温育，血清中的CK-M亚基全部被抑制，测定剩余的非CK-M活性，即代表CK-BB和CK-MB中的B亚基及CK-Mt活性。由于健康人和心脏、肌肉疾患病人血清中CK-BB和CK-Mt量极低，故一般忽略不计，这些样品中的非CK-M活性实际上代表CK-MB中的B亚基活性，乘以2即为CK-MB活性。,一、免疫抑制法测定CK-MB,注：采用此法测定CK-MB

43、，可能出现CK-MB大于总CK的情况,原因：在某些肿瘤、脑损伤或严重平滑肌损伤时，血清中CK-BB异常增高或出现巨CK（巨CK1是CK-BB与免疫球蛋白复合物;巨CK2即CK-Mt）时，CK-BB及巨CK中B亚基活性同CK-MB中B亚基一起被检测后乘2，检测出来的CK-MB活性结果自然明显高于真实值，甚至出现CK-MB活性大于CK总活性的可能。,此时，需用直接对CK-MB的单克隆抗体法或电泳法来鉴定,二、单克隆抗体法测定CK-MB,原理：是将CK-MB单克隆抗体包被于塑料小管内的底部或塑料小球上或乳胶小球上，用来捕获CK-MB，然后用免疫酶标法或荧光法测定CK-MB的质量或直接测定酶活力等多种方法，还有用金标记半定量法。,三、琼脂糖电泳法,原理：各种肌酸激酶同工酶在琼脂糖凝胶上电泳时具有不同的电泳速率，彼此得以分离。按电泳速度由快至慢依次为：CK-BB、CK-MB、CK-MM、CK-Mt。电泳毕，用酶、辅酶、底物覆盖温育后，在光密度计340nm进行荧光扫描检测。,临床酶学测定之前，标本的采集、处理与贮存有何注意点？,简述ALT常用测定方法及其临床意义。,血浆特异酶,外分泌酶,“酶胆分离”现象,简述LDH及其同工酶测定的临床意义,名词解释：,简答题：,思考题,简述在血清ALT测定中标准曲线呈抛物线的原因。,CK同工酶,