包载马钱子碱聚乳酸 羟基乙酸共聚物纳米粒处方工艺优化及其特性研究.docx

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1、摘要：目的对包载马钱子碱(brucine)聚乳酸-羟基乙酸共聚物poly(lactic-co-glycolicacid),P1.GA(B-P1.GA)纳米粒进行处方与工艺优化。方法采用沉淀法制备B-P1.GA纳米粒，以平均粒径、多分散系数(PDI)、Zeta电位、包封率和载药量为评价指标，采用单因素考察法结合星点设计-效应面法(CCD-RSM)筛选B-P1.GA纳米粒的最优处方，并将最优处方进行表征及体外释放实验。结果最优处方选择丙酮作为有机溶剂，泊洛沙姆188(F68)作为稳定剂，超声时间为Imin,磁力搅拌速度为9007min,磁力搅拌时间为30min,F68用量为0.35%,载体用量为2

2、5mg,药物用量为1.Omg,有机相与水相的比为0.54。所制得的B-P1.GA纳米粒为淡蓝色乳光透明液体，粒径为(97.124.23)nm,PDI为0.0980.035,Zeta电位为(-27.300.31)mV,包封率为(69.241.42)%,载药量为(2.650.03)%o通过表征，纳米粒形态完整，通过体外释放实验得知，纳米粒体外释放拟合符合HigUChi方程。结论星点设计.效应面法可用于包载马钱子碱P1.GA纳米粒处方与工艺优化，且优化后的纳米粒具有缓释作用。马钱子碱(brucine)是马钱科马钱属植物马钱子StryChnOSnUX-VomiCa1.种子的主要活性物质1,具有显著性镇

3、痛、抗炎作用2,还具有抗肿瘤、中枢神经系统兴奋等作用3-4,是一种高效的抗肿瘤单体，可用于胃癌、肠癌、肺癌、肝癌、白血病等疾病的治疗，但是由于马钱子碱毒性大、水溶性差、体内代谢迅速，且马钱子碱的治疗剂量与中毒剂量较接近5,故传统制剂不利于马钱子碱发挥药效，从而使其在临床上的应用受到了极大限制。纳米技术在医学方面的应用研究一直备受瞩目，是近年正在发展的一种新型亳微粒类给药系统，可以降低药物的不良反应、延缓体内释放及具有良好的靶向性，纳米药物在改善药物活性及降低药物毒性方面具有独特优势，具有推动药学发展的巨大潜力6-8。目前，聚乳酸-羟基乙酸共聚物poly(lactic-co-glycolicac

4、id),P1.GA载体作为制剂辅料已被美国食品药品监督管理局和欧盟药品局批准用于临床，是制备纳米粒应用最广泛的生物可降解高分子材料，其对脂溶性药物具有较强的包裹能力，同时降解速率规律，可以实现药物的可控释放，在药物制剂领域中具有巨大的开发价值和市场9-11。星点设计-效应面法是近年来常用的一种设计方法，可以很好地完成二次项拟合工作，具有实验次数相对较少、精确度高、操作简单、优选条件预测性好等优点因此，本实验采用该方法结合单因素考察法进行包载马钱子碱P1.GA(B-P1.GA)纳米粒的处方与工艺优化，为马钱子碱进一步临床研究奠定了基础。1仪器与材料1.1 仪器WaterSe2695-2698高效

5、液相色谱仪系统，美国WaterS公司；FA1204B分析电子天平，生物技术有限公司；HJ-3恒温磁力搅拌器，仪器制造有限公司；ZetaSiZerNano-ZS90激光粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗机，超声仪器有限公司；1.VEM5低电压台式透射电子显微镜(TEM),QUANTUM量子科学仪器贸易有限公司。1.2 试剂马钱子碱对照品，批号，质量分数98%,食品药品检定研究院；泊洛沙姆188(F68),德国BASF公司；司盘40,科技有限公司；甲醇，色谱纯，公司；无水乙醇，分析纯，精细化工有限公司。2方法与结果2.IB-P1.GA纳米粒中马钱子碱含量测定2.1

6、.1 检测波长的确定称取适量的马钱子碱对照品，将其溶解到色谱甲醇溶液中，定容到合适的浓度，二级阵列管检测器上设置检测波长190400nm,进行检测。马钱子碱在223.3、265.7、301.2nm处有最大吸收峰，结合相关文献报道44的波长范围，确定265nm为马钱子碱的检测波长。2.1.2 色谱条件色谱柱为D汰maC18(250mmX4.6mm,5m);流动相为甲醇-水-乙酸-三乙胺(230：2.4:0.3)(30：70)；检测波长为265nm；体积流量Im1./min；进样量101.;柱温30。2.1.3 供试品溶液的制备从已经准备好的B-P1.GA混悬液中精确量取IOm1.溶液,将其加入1

7、5m1.色谱甲醇中，在40kHz、200W的环境下超声，时间为20min,使纳米粒破乳，将处理后的溶液用孔径为0.22m的过滤膜滤过后得到B-P1.GA纳米粒供试品溶液。用同样的方法制取P1.GA空白纳米粒溶液。2.1.4 对照品溶液的制备先精确称量3.1mg的马钱子碱，加入甲醇溶液使其定容至25m1.,作为对照品储备液，质量浓度为124.00gm1.o2.1.5 专属性考察分别取P1.GA空白纳米粒溶液、马钱子碱对照品溶液和B-P1.GA供试品溶液在“2.1.2”项色谱条件下进行检测，对其专属性进行考察，结果见图1。可以看到，在该色谱检测条件下辅料对主药马钱子碱的含量测定没有干扰，方法专属性

8、良好，因此符合测定要求。min图1P1.GA空白纳米粒（八）、马钱子喊对照品溶液(B)和B-P1.GA纳米粒(C)的HP1.C图Fig.1HP1.CofP1.GAblankuanopaicles（八）,biucieefeencesolution(B)andB-P1.GAnauopa(ides(C)2.1.6 线性关系考察精密量取马钱子碱对照品溶液10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31m1.,置于Iom1.量瓶中，配制出6种质量浓度的对照品溶液，分别为124.00、62.00、31.00、15.50、7.75、3.88gm1.,按“2.1.2”项色谱条件下进行检测，并记录峰

9、面积，以马钱子碱质量浓度为横坐标(X),色谱峰面积为纵坐标(Y),对其进行线性回归，得到线性回归方程为Y=15539X+39436,r=0.9997,结果表明马钱子碱在3.88124.00gm1.线性关系良好。2.1.7 精密度试验取124.00gm1.的马钱子碱对照品溶液，在“2.1.2”项色谱条件下Id内测定6次，连续测定6d(每天1次)，口内精密度和日间精密度RSD分别为0.87%和0.90%,说明日内、日间精密度良好。2.1.8 稳定性试验精密吸取同一份B-P1.GA纳米粒供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、10、12h时，按“2.1.2”项色谱条件进样测定。结果发现12h内马钱子

10、碱峰面积RSD为1.12%,表明供试品溶液在12h内稳定性良好。2.1.9 重复性试验分别取同一B-P1.GA纳米粒样品6份，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.2”项色谱条件下测定峰面积，计算得到马钱子碱质量浓度的RSD值为1.04%,表明该方法重复性良好。2.1.10 加样回收率试验精密吸取0.3m1.的空白纳米粒，共9份，分为3组，各组分别精密加入0.3m1.的低、中、高质量浓度(10、40、70gm1.)的马钱子碱对照品溶液，各3份，混匀。将处理后的溶液用孔径为0.22m滤膜滤过，并在“2.1.2”项色谱条件下进样检测并记录，计算加样回收率，结果3种质量浓度溶液的平均

11、加样回收率在98%101%,且其RSD值均小于2%,结果表明该方法符合检测要求。2.2包封率与载药量的测定方法选取几种常见包封率和载药量的测定方法，并对其优缺点等进行分析，选择出适宜的测定方法，不同测定方法实验结果见表1。表1不同测定方法的实验结果Table1Differentmeasurementmethodstestresults测定方法包封率/%RSD%载药量%1RSD，%低沿超速离心法65.540.981.502.730.041.47葡聚糖凝胶色谱法50981.913.752.460.228.94透析法43.181.192.762.440.104.102.2.1 低温超速离心法取出2m

12、1.的B-P1.GA纳米粒混悬液，并将其放置在离心机中，在离心半径40Cm,15000rmin转速下离心30min,将沉淀的纳米粒收集，再用蒸锵水超声使其分散，继续离心，重复3次，然后用孔径为0.22m的过滤膜滤过，计算其包封率和载药量。2.2.2 葡聚糖凝胶色谱法取出2m1.B-P1.GA纳米粒混悬液，将其添加到已经经过处理的SePhadeXG50凝胶柱上，用蒸储水洗脱2min,收集纳米粒，然后用孔径为0.22m的过滤膜滤过，计算其包封率和载药量。2.2.3 透析法将装有2m1.B-P1.GA纳米粒透析袋置于透析外液为含20%乙醇pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，用转速为100Ormi

13、n的磁力搅拌器搅拌4h,取透析内液，用孔径为0.22m的过滤膜滤过，计算其包封率和载药量。包封率及载药量计算公式为包封率=(W2W1)W2,载药量=(W2W1)W3,其中Wl为测得的游离马钱子碱含量，W2为马钱子碱总投料量，W3为B-P1.GA纳米粒总量。由表1可知，通过低温超速离心法得到的药物包封率与载药量最高，最低的是透析法；而且，透析法耗费的时间较长，所以不排除存在纳米粒中药物释放的可能；葡聚糖凝胶色谱法的RSD值较大，可能因为某批次样品稀释过程中导致药物泄露，使得包封率和载药量的数值不稳定；低温超速离心法测得包封率和载药量较高且偏差值较小；因此，本课题最终确定使用低温超速离心法对纳米粒

14、的包封率进行检测。2.2.4 P1.GA纳米粒处方工艺优化2.3.1 制备方法的选择选取几种常见的制备方法，并对其制备过程及优缺点进行分析，选择出B-P1.GA纳米粒适宜的制备方法，不同制备方法实验结果见表2。表2不同制各方法实躲结果(Hs.”3)Table2TestresultsofdifferentPIePamCionmethods(XS,11三3)切各方法平均校4nmPDIZeta电位AnV包封率必载药量%沉淀法86643260.1450010-282.5min时，对B-P1.GA纳米粒制备的影响，结果见表5。随着超声时间的增加，平均粒径和Zeta电位均是先减小后增大，而其包封率和载药量

15、都是先增大之后减小。根据推测可能是因为超声时间的增加会使得纳米粒重新聚结，导致药物泄漏，粒径增大，包封率和载药量变小，所以本实验最后确定超声时间为1.0mino235磁力搅拌速率的考察保持其他条件不变，考察300、600、900、1200、15OO7min5个搅拌速率对B-P1.GA纳米粒制备的影响，结果见表6。当磁力搅拌速率在900rmin时平均粒径最小，纳米粒的分布相对均匀，体系稳定，包封率和载药量均处于最大值。所以，本实验磁力搅拌的速度确定为900rmin05不同超声时间实囊结果(7s,w=3)Table5Testresultsofdifferentultrasonictime(XS,1

16、1=3)超声时间/min均校生mPDIZetaSmV包封串载药量/%0.5110.243090.1070.019-6.010.3140.922981.580.091.074532.080.2510.007-23.O9O.1361621.05238O.O31590.612.630.1720.021-6.750.6153.442.602.040202.096.532.780.2240.013-6.320.3448.722.O41.880.102.5112473.12OBl0.009-5.8901845.的士1351.450.32表6不同磁力搅拌速率对BP1.GA纳米粒的影响(is.w三3)Tabl

17、e6Effectof(IUfel堂IHSdITingrasonB-P1.GA(xis.n3)搅拌速率/(rminT)平均粒径ZnmPDIZeta电位/InV包封率7%载药量.%30092.863600.2l40.019-15.3906259085.312.3OO.O5(500102.621为0.1850.032-17.0201361.713.1823802390069.722.710.2370.005-25.570.19(.2O4.35254037120098.512.450.1520.009-12.440.8754915.722.010.091500103.&土45101120.053-9.

18、600.7149924(1.920.11236磁力搅拌时间的考察保持其他条件不变，考察10、20、30、40、50min5个磁力搅拌时间对B-P1.GA纳米粒制备的影响，结果见表7。当磁力搅拌时间为30min时，纳米粒的分布相对均匀，粒径的大小变化不大，包封率和载药量都最大，所以本实验最后确定的磁力搅拌时间为30min。表7不同磁力搅拌时间实畛结果(土Tabk7Tescresultsofdifferentmagneticsri11ingrime(xs,w-3)SftfrtM1.inin乎均粒柠mPDIZetaUfrmV仅时率?%我药量/%1065.142910.1830.012-15.7302

19、648281.221.830.0220709410101910.009-19.6405256.713.072WO.133089.01220.10.010-10.3709063.602942.460.074093292.84O.1O9O.OO5-5.470.7350.773.741960.155092892.03O.1O3O.OO3-7.820.9249042.681880.06237稳定剂F68用量的考察保持其他条件不变的前提下，将F68用量设置成0、0.05%、0.10%、0.50%1.O0%系列不同的用量制备纳米粒。考察F68用量对B-P1.GA纳米粒制备的影响，结果见表8。随F68用量的

20、逐渐增加，平均粒径逐渐变大，但包封率和载药量均呈先变大后又变小的趋势，由此可知，F68用量对B-P1.GA纳米粒制备的影响较大，而在F68用量为0.5%左右包封率载药量较大，所以本实验最后确定F68用量为0.50%左右，需进一步优化。表8稳定剂F68不同用实验结果(3士九=3)Table8Test!,esultsofdifferentstabilizerconcentrations(xts9n3)F68用量/%平均粒物i三PDIZeta电仞mV包封率名载跖量/%069200990.1320.009-15.620.1753.071.142.(MO.150.0572.09il.9602240.02

21、0-18.630.2154.162.012.080.010.1070.612.1901770.016-2I.140.1061.601.912.3500405079.621.9701740008-19.9002662.711.632.420.1110084.913.600.0870.004-10.430.1453952312.080.062.3.8 载体P1.GA用量的考察保持其他条件不变，选择10、20、30、40、50mg5个P1.GA用量对制备B-P1.GA纳米粒的影响，结果见表9。平均粒径和Zeta电位先变小后变大，包封率先变大后变小，载药量逐渐变小，可见载体P1.GA用量对B-P1.G

22、A纳米粒的制备影响较大，载体用量在20mg时，包封率最大，所以需对载体用量进一步优化。表9不同载体用实验结果(Gs,”=3)Table9Testresultsofdifferentcaierdosages(xJ,-3)P1.GAHlftlmg平均粒径三PDIZeta电闻mV包封率7%栽药量，%10786030901240.014-16.6904154.123.6154OO.1O20742940102230020-21.M0.7265.592.112.540043079200.890.2190.008-20.240.1162P71.492Jl0.124080.012.130.1740.027-1

23、7.950.2357333.901390.095098.833.470.1860.018-15380.5650362.810980.032.3.9 药物用量的考察保持其他条件不变，通过改变药物用量，判断药物用量对B-P1.GA纳米粒制备的影响。分别制备0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg5个药物用量的纳米粒，结果见表10。随着药物用量的增加，平均粒径逐渐变大，Zeta电位先变小后变大，包封率和载药量先变大后变小，药物用量在1.omg时，包封率和载药量均最大，所以本实验最后确定的药物用量为1.Omg。2.3.10 有机相与水相体积比的考察保持其他条件不变，将有机溶剂与水的体积比作为变量，分

24、别设置5个比例1：1.5、1：2、1：3、1：4、1：5考察对制备的B-P1.GA纳米粒的影响，结果见表11。有机相与水相比例的逐渐减小，使得平均粒径和Zeta电位值先变小后又逐渐变大，分布均匀，体系稳定，包封率和载药量均逐渐增大后减小。因此，当有机溶剂和水的比例在1：2时，纳米粒的状态最好，可进一步优化。表10不同药物用实聆结果（T5.-3）Table10Testresultsofdifferentdosageofdgs(xJ.n三3)药物用量吨平均粒生mPDIZeta电位nV包封率/%费药量%0.568901.330.2390.009-8.930.6744221.661.690.031.0

25、70.132190.1620.021-18.920.1460.110.912.310.111.575881350.0820005-13.610.0346.081.631.770.022.098.451770.1210.011-12.B02342.721.371720.142.51063217900780.023-12.010.48312821616100811不同有机相水相比例实验结果（fs.”=3）TaHe11Testresultsofwaferrat100fdifferen(OlXankphases(XiStw=3)有机相与水相体枳比年均粒竹PDIZeta.(v7mV包封率7%我药量%1l

26、.577.633.8301140004T3260.3351.710.992000041272.311.0902170.013-20.041.0265.121J82.5OO.O21374.7610.1910.017-15.770.0450941.711.920.111488.121.7702480.006-138913347.310.181.810.0215103.573.670B80.010-12.090.5840.221.131.580.162.4星点设计-效应面法（CCD-RSM）优化处方2.4.1 实验设计在前期对于影响B-P1.GA纳米粒各种指标的单因素考察基础之上，发现载体P1.GA

27、用量、有机相与水相体积比、稳定剂F68用量对处方考察指标影响较大，所以本实验需要针对这3个因素进行更加深入的CCD实验设计。本实验共从5个角度对其进行衡量，其中包括中心点、析因设计点、极值点。当r=1.682,各个变量范围的实际大小和标准大小见表12o本实验将包封率和载药量作为响应参数，分别用Yl和Y2表示，然后进行CCD实验，实验结果见表13o表12各变量的围实际值标准化值Table12Realvalueandcodeofeachvariablescope水平载体P1.GA用量（八）mg稳定剂F68用量(B)/%有机相与水相体积比(C)-1.68210.000.050.33-116.080.

28、140.40025.000.280.50+133.920.410.60+1.68240.000.500.67表13CCD的实险设计及结果Table13Designandresultofcentralcompositedesignaau影响因素响应值百验”AingB%Cn%y133.920.140.6051.421.96216.080.410.6063.172.42316.080.140.6048.691.88433.920.410.6060.012.31516.080.140.4061.872.35625.000.280.5069.212.69710.000.280.5060.182.3183

29、3.920.410.6069.272.65925.000.280.3367.402.581016.080.410.4067.192.571133.920.140.4057.172.191240.000.280.5067.602.621325.000.280.5063.642.461425.000.280.5064.022.471525.000.280.6765.482.501625.000.280.5062.802.381725.000.280.5062.972.421825.000.280.5061.292.351925.000.500.5069.232.652025.000.050.504

30、7.201.812.4.2模型拟合及方差分析分析软件为Design-ExpertV8.0.6,以包封率(Yl)、载药量(Y2)分别对A、B、C实验数据进行二次多项式回归方程拟合。二次多项式拟合方程：Y1=71.42-0.042A+6.41B+0.72C-1.14AB+1.34AC+4.27BC-3.60A2-5.61B2-0.93C2(r2=0.9158,P=0.0001)；Y2=1.86-9.15310-3A+0.06IB+0.01IC-0.016AB+0.026AC+0.09IBC0.071A20.120B2一0.018C2(r2=0.8851,P=0.0001)o从r2和P的计算结果可以

31、看出，二次多项式的拟合相对较好，因此可用此模型对B-P1.GA纳米粒的处方进行分析和预测，其分析实验结果分别见表14。由表14可知，YKY2模型项PV0.001,说明回归方程的关系是极显著的。对于Yl模型方程B、BC、A2、B2都是显著项，是Yl的显著影响因素，交互影响因素3D效果图与等高线图见图2。对于Y2模型方程B、BC、A2、B2都是显著项，是Y2的显著影响因素，交互影响因素3D效果图与等高线图见图3。袤14H和】、方差分析实3结果Tabk14Yiand】、analysisofariancec(results因素自由度平方和均方Yi平方和均方YjFiHP也显著性F(ftPgWStt模里9

32、1327.40014749012.09000003极显著03800.042856000012极显著A10.0240.0241.958xKT，0.96561.1441(j1.1441(302300.6385B11.130561.13046.0000.00010.0510.05110.5200.0088极显著C17.1807.1800.5900.4608AB110.370103700.8500.37812.112X10,2.112X1(,0.4300.5252AC114.340143401.1800.30375513*1()T5.5131(31.1300.3126BC1145.9501459501

33、197000061极显著00670.06713.67000041极显着Aj1186980186.980153300.0029M三00720.07214.79000032极显著B21453.300453.30037.1600.0001极&著0.2000.20040.2500.0001极显著C2112.54012.5401.0300.33464509XK)T4.509x10-3OaO0.3588残差10121.980122000.0494.8741(3图3人响应面图与等高线Fig.3Contourand-esponsesurfacediagramofH2.4.3 响应面优化与预测根据上述实验结果可

34、以看到，公共区域中效应面响应值较高部分为最佳的区域，由DeSign-EXPertV8.0.6软件设计优化各因素，最终确定包封率、载药量最高的处方条件是A=25mg,B=0.35%,C=0.54,Yl=72.42%,Y2=2.77%o2.4.4 优化后处方验证综上所述，B-P1.GA纳米粒最优处方是丙酮作为有机溶剂，F68作为稳定剂，超声时间为Imin,磁力搅拌速率为900rmin,磁力搅拌时间为30min,F68用量为0.35%,载体用量为25mg,药物用量为1.Omg,有机相与水相体积比为0.54。优化后处方验证结果见表15,可以看出，预测值和实测值之间的相对偏差相对偏差=（预测值一实测值）

35、/预测值在5%以下，表明优化后的处方验证试验的预测值与实测值基本相吻合，经过CCD-RSM进行预测，结果显示其效果较好，因此，可以描述效应面和影响因素之间的关系。按优化后的工艺及处方制备3批B-P1.GA纳米粒样品，PD1.平均粒径、Zeta电位、包封率及载药量测定结果见表16,外观见图4。由表16可知，3批样品批间的各项指标变化差异小，重现性良好；由图4可知，B-P1.GA纳米粒为淡蓝色乳光透明液体。表15验证结果Gs,”=3）Table15Resultsofprocessvalidation(X5,=3)指标预测值/%实际值/%相对偏差;%包封率72.4269241.424.39载药量2.

36、772.650.034.33*16验证结果(S,3)Table16Resultofprocessvalidation(XS,三3)批次平均粒柠nmPDIZeta电付nV包封率仅栽药量，%1929806200560016-26.920.2771240382.690.032102930480.0970068-27.690468.130.472.620.07395.450.350.1410.022-272905268.350.642.640.042.4.5 P1.GA纳米粒的表征取适量最优工艺条件下制得的B-P1.GA纳米粒溶液在其中取出401.溶液滴在铜网上（用支持膜覆盖），将多余的液体用滤纸吸净

37、，放置在自然环境中待其风干。向其中加入浓度为2%磷鸨酸染色约30s,将其放在电镜下观察，结果见图5。该纳米粒的形态为类球形，各个粒子之间的分布相对均匀且没有明显的粘连现象。用激光粒度分析仪测定平均粒径及Zeta电位，结果见图6、7o图4B-P1.GA纳米粒样品外观Fig.4AppearanceofB-P1.GAIuinoparticles图5B-P1.GA纳米粒透射电镜图(X25000)Fig.5PictuieOfB-P1.GAnanoparciclesbyTEM(X25000)iiooioioboo粒径mn图6B-P1.GA纳米粒的粒径图Fig.6PaiticlesizedistributionofB-P1.GAnanoparticlesZeta电位/mV图7B-P1.GA纳米粒的Zeta电位图Fig.7ZetapotentialdistibutionofB-P1.GAnanopailicles2.6B-P1.GA纳米粒体外释药实验体外试药研究采用动态透析法。首先精密称取B-P1.GA纳米粒冻干品（相当于马钱子碱为5mg）,用5m1.生理盐水稀释，当二者完全处于混合状态后将溶液置于处理过的透析