生态背景决定土壤细菌多样性对施肥的响应.docx

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1、一、引言土壤微生物多样性能够调节自然和农田生态系统中的养分循环、作物产量和生态系统可持续性，进而维持生态功能。施肥是人类改造自然的大规模活动，影响陆地生态系统并引发全球变化，同样会对土壤微生物多样性产生重大影响。过量施肥会造成多种负面影响，甚至引发全球效应，如生产成本提高、对不可再生能源的高度依赖、水污染和土壤退化等。为此，学界围绕施肥对农田土壤微生物的影响已经开展数十年的研究，但是大多聚焦于局域或者区域尺度。在更大空间范围下，由于不同地区的土壤性质不同，施肥对土壤微生物多样性的影响也会不同。研究发现施用有机肥能够增加酸性土壤的微生物多样性，但却会降低碱性土壤的微生物多样性，而对中性土壤微生物

2、多样性没有影响。此外，施肥类型（如无机VS有机）也会对土壤微生物多样性产生不同影响。尽管前人也在大空间尺度下探究了养分添加对土壤微生物多样性的影响，但这些工作都是基于自然生态系统，且试验周期相对较短（小于4年）。目前对于较长时间尺度和较大空间范围下农田生态系统施肥影响的认知仍然有待提升，不同生态背景下土壤微生物多样性对长期施肥响应的方向和幅度也需要研究。本研究假设在大尺度环境梯度下，生态背景一一包括当地气候和土壤理化性质一一决定了土壤微生物多样性（丰富度、群落组成和物种水平）对施肥的响应。简而言之，本研究认为在不同的生态背景下，施肥对土壤微生物多样性的影响不一致。此外，还认为可能存在一些机会主

3、义型或者敏感型的微生物,它们受到肥料中养分和碳的刺激或者抑制，而不受生态背景的控制，进而对施肥表现出一致的响应。这些物种可以作为施肥影响土壤肥力的指示生物。揭示大尺度（如洲际）生态背景如何影响土壤微生物多样性对施肥的响应，以及识别响应一致的微生物类群，有助于准确预测全球变化下土壤微生物多样性变化以及功能分布。为此，本研究收集了中国10个20年以上的长期定位田间施肥试验基地（农作物主要是小麦和玉米）的表面非根际土（见附录A中的图Sl和表Sl）。试验站点的选择基于以下两个理由：过量施肥是中国农田生态系统主要关注的问题之一。比如，小麦和玉米的氮肥施用量可分别高达283kghm2a-和402kghm2

4、a-1o小麦和玉米是中国主要的粮食作物，其种植面积覆盖了中国大部分农业生态区小麦面积共2.45IO7hm2（占19.6%）和玉米面积共4.24XIO7hm2（占34.0%）,2017o每个试验站点的运行时间都在20年以上（见附录A中的图Sl和表S2）：ContrOl（不施肥）、氮钾无机肥（NK）和氮磷钾（NPK）以及有机无机配施有机粪肥（OM）和NPKM（OM+NPK）。这些试验站点覆盖了中国大部分气候类型、土壤特征和农业制度（见附录A中的图Sl）,为评估生态背景影响土壤微生物多样性对施肥的响应提供了理想的供试材料。本研究利用扩增子测序探究细菌丰富度、群落组成和优势物种类群（相对丰度在前10%

5、的物种）对施肥的响应（包括方向和幅度）。选择细菌群落作为研究对象基于两个理由：细菌是地球上最多样和最丰富的生物；在农业生态系统中，细菌是土壤肥力、土壤健康和植物生产力的重要引擎。二、材料和方法（一）长期施肥试验资料10个长期施肥试验站点的详细信息见附录A中的图Sl和表S1。站点以及施肥起始时间如下：新疆阜康荒漠生态系统试验站（FK）,始于1987年；河南封丘潮土农田生态系统试验站（FQ）,始于1989年；陕西长武黄土高原农田生态系统试验站（CW）,始于1984：江西鹰潭红壤农田生态系统试验站（YT）,始于1980年；安徽杨柳砂姜黑土农田生态系统试验站（Y1.）,始于1981年；安徽蒙城砂姜黑土

6、农田生态系统试验站（MC）,始于1982年；黑龙江海伦黑土农田生态系统试验站（H1.）,始于1987年；辽宁沈阳农田生态系统试验站（SY）,始于1979年；江西进贤红壤油料作物试验站（JX）,始于1986年；湖南祁阳红壤农田生态系统试验站（QY）,始于1990年。主要的施肥处理如下：control,不施肥；NK,施用尿素和硫酸钾，不施用过磷酸钙；NPK,施用尿素、硫酸钾和过磷酸钙；NPKM（50%氮来自堆肥，无机肥包括50%氮和磷钾）；OM（总氮量全部来自堆肥，加上与NPK处理相同的无机磷、钾肥）。（二）土壤取样和化学测量2015年收获季后采集中国10个长期施肥试验站点的表层非根际土。YT、Y

7、1.、CW、SY、MC、QY、JX每个施肥处理各有3个重复小区，而FQ、FK、H1.每个施肥处理各有4个重复小区，分别在每个小区内采取两个复合样品。混合10个10Cm深度的随机土芯，得到一个复合样品。所有工具都用75%的乙醇消毒。共采集284个土壤样品，用于后续土壤理化性质和分子实验分析。样品放入无菌自封袋中，一周内送往实验室保存于4。C冰箱。用于生物测定的土壤样品过筛（2mm目）后保存于-40。C冰箱中以进行DNA提取。用于土壤理化性质分析的土壤样品风干后过筛（100目），根据土壤理化分析（鲁如坤编）提供的方法测定土壤PH值，有机质（SOM）可溶性有机碳（DOC）、总氮（TN）、总磷（TP）

8、总钾（TK）有效氮（AN）,有效磷（AP）、有效钾（AK）、硝酸盐（N以一NCX的形式存在）和镂盐（N以一NH/的形式存在）的含量。土壤理化性质的详细信息见附录A中的表S2。（三）土壤DNA提取对每个样品，使用试剂盒FaStDNASPINKit（MPBiomedicals,美国）提取土壤总DNAoDNA样溶于501.Tris-EDTA缓冲液,用微量分光光度计（Nanodrop1000）定量，并保存于-40。C冰箱中待后续使用。（四）扩增子文库的制备及高通量测序利用16S扩增子测序表征细菌群落。对每个DNA样本，使用通用引物519F/907R对细菌16SrRNA基因的V4V5片段（约40ObP）

9、进行扩增。正向引物加入5bp己知碱基序列的分类标签以区分不同样本。随后进行聚合酶链反应（PCR）,501.反应体系包括：脱氧核甘三磷酸4瓜（2.5mmol1.）；21.正向和反向引物（IOmmoMj）；2UTaqDNA聚合酶（TaKaRa,日本）和11.DNA模板（50ng）。每一批次实验均设置以无菌水（ddH2）为模板的阴性对照以排除环境污染。反应进行35个循环（95C45s、56C45s和7260s）,最终在72下复性延伸7mino使用QIAquickPCRPurificationKit（Qiagen,德国）纯化试剂盒纯化PCR扩增产物，然后以等摩尔量进行混合。随后用TrUSeqDNA样品

10、制备试剂盒和MiSeq试剂盒（600个循环）进行测序。本研究所用的细菌16SrRNA基因序列已上传至日本DNADatabank数据库（DDBJ）中（索引号PRJDB9137）0（五）处理高通量测序数据原始双端序列数据用F1.ASH组装并用UPARSE算法处理。用CUtadaPt（Vl92）去除引物。去除平均质量分数低于25且长度低于300bp的序列，并使用UPARSE过滤嵌合体。基于97%的相似性阈值聚类得到分类操作单元（OPeratiOnaltaxonomicunit,OTU）,然后利用核糖体数据库项目（ribosomaldatabaseproject,RDP）classifier（v2.1

11、2）进行物种注释以确定细菌分类（置信度大于80%）。基于PyNAST算法以GreenGene数据库（vl38）为模板对OTU代表序列进行排序对齐，使用FaStTree构建系统发育树。最终，共获得20294908条优质的细菌16SrRNA基因序列，每个样本的序列数在40691到158122之间，中值为68470。由于不同样本间alpha（）和beta（）多样性的比较需要基于同样的采样深度，故将所有样本的序列统一抽平到40000条用于下游分析。（六）细菌丰富度、群落组成和响应施肥的指示生物使用响应率算法（logresponseratio,InRR）来表征，与不施肥对照相比施肥处理对细菌丰富度（OT

12、U数量）的影响，包括变化的幅度和方向。该项分析使用R软件（v331）的工具包Metafe）r进行。以Bray-CUrtiS距离来量化群落物种组成差异,使用非度量多维标度（NMDS）进行可视化，并通过置换多元方差分析（Permanova）检验不同处理间微生物群落组成的差异。Permanova得出的F值代表细菌群落结构的差异程度。针对常见丰富类群（相对丰度前10%的OTU,合计占总序列数的87.5%）,基于InRR量化施肥处理下其相对丰度的变化情况,并将其划分为4种响应策略：在9个位点以上相对丰度均增加的微生物（即95%置信区间InRR0）被归为“机会主义型；而在9个位点以上其相对丰度均减少的微生

13、物（即95%置信区间InRR0）被归为敏感型；在每个位点中相对丰度均没有显著变化的微生物（即95%置信区间InRR跨越零）被归为“耐受型；在不同站点间其相对丰度变化趋势不一致的微生物被归为“背景依赖型“。使用iTO1.（InteractiveTreeOf1.ife）工具（https:itol.embl.de）绘制细菌分类群的系统发育树和每个分类单元在施肥后的响应策略。（七）数据分析单因素方差分析（ANOVA）用以评估施肥的影响，使用诚实性显著差异(honestlysignificantdifference,HSD)进行事后比较(post力OC)O分别进行Pearson和Mantel分析，评估细

14、菌群落（即丰富度和组成）与环境变量的相关性。P0.05和P0.9）和低RSMEA（0.05）表示模型准确性高。三、结果与讨论（一）生态背景决定细菌多样性对施肥的响应首先评估了中国10个代表性试验站点的土壤细菌丰富度对施肥的响应图1（八）o这些站点代表了不同的气候条件如不同的年均气温（MAT）和年均降雨量（MAP）和土壤性质（如土壤PH）（见附录A中的表SI）,且试验设置包括了无机和有机两种典型施肥处理（见附录A中的表S2）。结果表明，生态背景（站点环境）和施肥策略决定细菌丰富度对施肥响应的方向和幅度见图Ka）和附录A中的图S2,即土壤微生物多样性的响应与当地的土壤性质、气候条件和施肥策略有关图

15、1（b）、（c）o该结果与研究结论有所不同，其主要原因可能源自于以下差异：施肥时间不同（施肥时间：小于4年vs20年）；施肥类型不同（如无机vs无机有机配施）；生态系统类型不同（如自然生态系统vs农业生态系统）。本研究拥有更大的空间范围以及更多的施肥类型，使得研究结果相对于前人的工作更加的全面和准确。众所周知，大尺度下气候状况（如MAT和MAP）和土壤性质驱动土壤微生物群落多样性、结构和生态功能，并决定微生物对环境变化的响应。例如，在MAT和MAP高的酸性土壤中，施用有机肥能够增加微生物多样性，而与之相反，在MAT和MAP低的碱性土壤中微生物多样性则下降。图1.（八）中国10个长期定位施肥试验

16、站点（FK、FQ、CW、YT、Y1.MC.H1.、SY、JX和QY）有机无机配施NPKM和（或）OM和无机施肥NPK和（或）NK对细菌丰富度的影响（InRR）。水平误差棒表示95%置信区间。根据土壤PH梯度对所有样点进行着色。（b）10个站点细菌群落物种丰宫度变化与土壤PH值（经Ig转换）的相关性。（C）纬度、经度、气候、土壤特性以及施肥类型对10个试验站点细菌丰需度变化的直接和间接影响。箭头线条的宽度与该路径相关系数的大小成正比，并辅以数字表示。实线和虚线分别表示正负关系。R：解释的方差比例。df：自由度。条形图展示了SEM结果中施肥和当地生态背景对细菌群落物种丰需度变化的标准化总效应（直接

17、效应+间接效应）。结果表明，在全国范围内土壤酸度（即土壤pH,土壤微生物变化的主要驱动因子）主导了细菌丰富度对施肥的响应见图1（b）和附录A中的表S3。酸性土壤中的细菌丰富度对施肥更敏感，尤其在降水量大和（或）土壤肥力高的地区。在中性（如Y1.和MC）和酸性（如SY和QY）土壤中（见附录A中的表SI）,施用无机肥导致土壤酸化或者进一步酸化（见附录A中的表S2）,从而大幅降低了细菌丰富度（见附录A中的表S4）。前人研究也发现酸性环境抑制微生物生长，从而降低土壤细菌多样性。同时大量研究也报道了施用无机肥降低了酸性和中性土壤中的微生物多样性。相比之下，碱性土壤对化肥施用导致的酸化有一定的缓冲作用，因

18、而其微生物多样性变化不大如YT、FK和CW；图1（八）、附录A中的图S2、表S2和S4。土壤PH值是表征生态背景的综合性代用指标，是较大空间范围内土壤细菌群落变化的重要相关因子或驱动因素。因此，以土壤PH值为综合代用指标，有助于全面揭示施肥制度和生态背景对土壤细菌多样性的影响机制。SEM结果量化了生态背景（即气候和土壤特性）和施肥制度对细菌丰富度图1（C）和细菌群落组成变化（见附录A中的图S3、S4和表S5）的直接和间接影响。该模型解释了土壤细菌对施肥响应的大部分变异细菌丰富度变化InRR模型的R87.3%,图I（C:）；群落组成变化模型的R?=62.8%,见附录A中的图S4。在所有的环境变量

19、中，土壤PH与年均降雨量、年均气温以及土壤肥力均紧密相关（见附录A中的表S6）,其对细菌丰富度对施肥响应程度的影响也最为重要见图1（c）和附录A中的表S6。同样，生态背景（MAT、MAP、土壤pH和TP）也影响了细菌群落组成对施肥的响应（见附录A中的表S7-S9）o具体而言，在全国范围内，细菌群落组成的变化也根据站点和施肥类型不同而有差异，且与施肥对土壤酸度的影响密切相关（见附录A中的表S6）o研究结果进一步表明，在10个试验站点中，有机肥对细菌丰富度的影响要小于无机肥（t检验P=0.038）见图1（八）及附录A中的图S2和表S6。即使如此，生态背景依然影响着细菌丰富度对有机肥的响应。对于大多

20、数酸性土壤如QY和JX（见附录A中的表S2）来说，有机肥降低土壤酸度（即提高土壤PH）并增加土壤细菌丰富度。该结果再次验证土壤酸度调控细菌丰富度对施肥的响应这一结论。此外，与施用无机肥相比，施用有机肥向土壤中投入了大量外源碳，能够刺激更多的微生物谱系，进而降低生态背景引起的差异。SEM结果进一步强调了与生态背景相关的土壤肥力包括总碳、磷和钾含量（见附录A中的表S3、S4、S9和SlO,同样影响细菌丰富度和群落组成对施肥的响应。细菌丰富度对施肥的响应机制与作物品种无关。小麦（FK和CW）或者玉米（H1.、SY和JX）并不影响土壤细菌丰富度对无机肥G检验P=0.43）或有机肥（t检验P=O.48）

21、施用的响应。综上所述，本研窕表明施肥对土壤微生物多样性的影响因当地生态背景的差异而有所不同。在全国范围内，酸性土壤微生物多样性更易受施肥的影响，且无机肥比有机肥的影响更大见图1（C）和附录A中的图S4。Opportunistic2.3%02%Sensitive03%0.7%Tolerant78%126%Ccxitextdependent896%865%OrganicInorganicUfestrategyOpportunisticSensitiveToterantAcidobactenaActinobadenaBacteroidetesChloroflexiFirmicutesPlanctom

22、ycetes13.4%117%44%4.4%7.6%114%85%103%25%54%54%291%Alphaproteobactefia9.0%Betapcoteobdcteria4.4%Deltapfcxeobacteria5.8%Gammaproteobacteria3.5%Others26.2%图2.优势微生物（相对丰度占比前10%）对施用无机肥（外环）和有机肥（内环）的响应策略。表格展示了施肥后4种响应策略微生物的百分比。门水平微生物对应的值表示各门类下“机会主义型、敏感型”和耐受型三种分类群合计所占的百分比。各门类颜色与系统发育树分支颜色相对应。系统发育树中的饼图显示了无机（外部饼

23、图）和有机（内部饼图）施肥卜.各门类微生物响应策略的分布情况。本文中，机会主义型”和敏感型”类微生物群分别是指在90%的站点中对施肥具有持续枳极（相对丰度增加）和消极（相对丰度减少）响应的微生物；“耐受型”是指在90%的站点中对施肥没有显著响应的微生物。系统发育树中排除了“背景依赖型”微生物，即除以上三种类型之外的微生物。（二）部分细菌类群对施肥具有相同的响应按照之前的方法，进一步挑选群落中相对丰度前10%的优势细菌物种（总计占群落相对丰度的87.5%）（见附录A中的图S5）,在物种层面评估细菌对不同施肥的响应（图2）。根据对施肥的响应策略，将微生物划分为4种类群：机会主义型，定义为在90%的

24、站点中对施肥有一致积极响应（即相对丰度增加）的微生物类群；敏感型，即在90%的站点中对施肥均有一致消极响应（即相对丰度减少）的微生物类群；耐受型，在90%的站点中对施肥均无显著响应的微生物类群；背景依赖型，除以上三种类型之外的微生物类群，即其相对丰度变化在不同位点不一致。结果表明，土壤中的确存在少量微生物类群对施肥的响应一致，它们分别是”机会主义型微生物（有机肥施肥中2.3%和无机肥施肥中0.2%）和“敏感型微生物（0.3%和0.7%）（见附录A中的图2和表Sll）。与不施肥的土壤相比，施肥后养分和碳输入可能诱导“机会主义型微生物的富集。SEM结果表明长期施肥对机会主义型微生物类群相对丰度的影

25、响要大于生态背景所造成的区域差异包括气候和土壤性质，图3（八）和图3（b）机会主义型微生物类群主要隶属于变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（BateroideteS）见图2和附录A中的图S6,它们都是富营养型微生物，因此在施肥后的富营养环境中更具有竞争优势。例如，氮素的添加刺激了NitrOSoSPira和NitrOSOSPhaera；而拟杆菌门中的Chitinophagaceae厚壁菌门中的Bacilli和变形菌门中的光合细菌（RhodopseudomonasRhodospirillaceaeRhodospirillales）对有机肥中的碳输入有积极的响应（图2）,能够成为高肥

26、力土壤的优势微生物。因此，这些机会主义型微生物类群可以用来表征土壤高肥力，进而评估和指导农业管理方式。敏感型微生物类群主要隶属于寡营养型的Acidobacteria和Actinobacteria（见图2和附录A中的图S6）。施用有机肥和化肥均会增加土壤有效态氮，进而抑制土壤氮循环微生物。因此，研究发现NitroSPirae、PlanCtOmyCeteS和PrOteobaCteria门中与氮循环相关的分类群，如RhiZObiales、MyXoCoCCaIeS和Burkholderiales（见图2和附录A中的图S6）均被施肥所抑制，也被归类为敏感型。这些物种可用作农业实践对土壤肥力负面影响（如氮

27、肥的过量施用）的潜在预警指标。综上所述，研究结果表明，机会主义型和敏感型微生物分类群可作为农田土壤肥力的生物指标，指示人类活动对土壤肥力的影响。图3.地理位置（经纬度）、气候、土壤性质与施肥措施有机肥（八）和无机肥（b）对“机会主义型”微生物的影响。条形图显示了由SEM得出的施肥和当地生态背景对“机会主义型“微生物的总效应（直接效应+间接效应）。四、结论基于中国10个20年以上具有代表性的田间定位施肥试验，本研究明确了生态背景主导土壤微生物多样性对施肥的响应，包括响应的方向和幅度。在这个空间尺度下，酸性土壤中微生物多样性对施肥的响应更加敏感；由于化肥能够加剧酸性土壤的酸化，因此化肥对土壤微生物多样性的影响程度要大于有机肥。此外,土壤中存在部分细菌类群,它们不受生态背景的影响，对施肥表现出一致的响应。这些微生物可以作为土壤肥力变化的生物指标。以上发现可以更好地用于预测全球变化下土壤微生物多样性的潜在变化和分布。此外，本研窕还有助于进一步完善现有的理论框架，即大尺度（如本研究的洲际尺度）下生态环境控制土壤微生物多样性对人为扰动的响应（如幅度和方向）。