2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究.docx

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1、2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达探讨2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达探讨编辑。作者：柴可夫黄晓玲钱俊文马纲【摘要】目的从分子水平探讨2型糖尿病湿热困脾证的中医证候实质。方法抽取2型糖尿病气阴两虚证患者静脉血，检测血糖，血脂及电解质，分别血液中的白细胞，提取总RNA,化学发光方法检测基因芯片，用ScanAlyze软件采集图像，GEArrayAnalyzer软件分析数据。对部分差异表达基因进行RTPCR和Westernblotting方法验证。结果2型挛糖尿病湿热困脾证患者血糖暴，血脂，电解质与健康人有显著差异，基因芯片检测发坤现和健康人差异表达基因共38条，其中上调的基因有24条，下调的基因

2、有14草条。并发觉湿热困脾证的特羔异性基因。通过RTPC蕙R和Westernbl+Otting方法反向验证IRS2和F0XC2基菰因，证明2型糖尿病湿热困堵脾证患者和健康人白细胞中纯存在IRS2和FOXC柒2存在差异表达。结论应用基因芯片筛选2型糖尿獐病湿热困脾证的差异表达基Y因，为2型糖尿病辨证论治曙供应新思路。【关键词】昏2型糖尿病;基因芯片；掩辨证分型糖尿病是一组由瞥遗传和环境因素相互作用而熊引起的慢性疾病。因胰岛素分泌肯定或相对不足以及靶舞组织细胞对胰岛素敏感性降吗低，引起糖、蛋白质、脂肪酥、水和电解质等一系列代谢耨紊乱为主要共同标记。本研坂究视察糖尿病湿热困脾证的堤基因表达差异，探讨

3、2型糖U尿病湿热困脾证的证候实质匕o1临床资料探讨对象开对浙江中医药高校附属第屯二医院糖尿病防治中心40欢O例糖尿病患者进行中医辨证分型，随机选取6例湿热潜困脾证患者，其中男性3例，女性3例，年龄30岁至酯65岁之间，年龄岁。另选涝取年龄与性别相匹配的健康仰人6例作比照，平均为岁。历健康比照组皆通过血糖检查痼解除糖尿病，通过病史调查赋和体检、血象、肝肾功能、握胸透、心电图等检查，解除奈其它内分泌疾病和各系统器箪质性疾病。现代医学诊件断标准依据1999年W呷HO专家询问报告诊断标准蛰,空腹血糖1.(126产mg/dl)；或糖耐量试验中服糖后2小时血糖/1.(200mgdl);或随机血糖1.(20

4、0咖1mg/dl)o中医辨三证标准参照2002年版释中药新药临床探讨指导原穴则中中药新药治疗糖尿共病的临床探讨指导原则,湿热困脾证,主症：胸脱腹诞胀，或食后饱满，头身困重。次症：体形肥胖，心胸烦麴躁，四肢倦怠，小便黄赤，貂大便不爽。舌脉：舌红苔黄嘈腻，脉滑而数。病例纳耘入和解除原则凡符合现代医学诊断标准和中医辨证标准，可纳入试验病例。解除败有糖尿病急性并发症；啤经确诊为1型糖尿病,其它既类型糖尿病及妊娠糖尿病者努：年龄在40岁以下或7磁0岁以上，妊娠或哺乳期妇一女；有严峻心、肝、肾等并发症，或合并有其它严峻区原发性疾病，精神病患者。中医辨证症状不典型，或驷者两型三型并见证型困难者蜗。2试验方法

5、一般状况测量身高，体重。计黛算体重指数/身高。生蔓化检测全部受试对象均于上午8时前空腹抽取肘静脉血Ioin1,用于测空腹血榆糖、血脂、糖化血红蛋白、右胰岛素反抗指数、血钙、血历钾等生化检测。基因芯片检测白细胞的提取与痪RNA的纯化随机选取其中3名湿热困脾证糖尿病患者和3名健康人抽取静脉血韬5ml,用红细胞裂解液分辛离白细胞，采纳Trizo帆1一步法抽提总RNA,用浮分光光度计在260nm和楼280nm分别测定吸光度纪，A260/A280比值在为较纯的RNA,可用于芯片检测。芯片杂交经检测合格后的总RNA可用于合成双链DNA进行畔纯化。然后进行化学发光检稔测的Ampo1.abeliIng1.PR

6、标记，变性的cDNA探针全部加入预热癖的GEAprehyb中，诣混匀，放在60C待用。铺弃去杂交管中的GEApr睨ehyb溶液，加入含探针能的GEAhyb混合液至杂蜒交管中，60C下6rp鞭m杂交。化学发光检测滕洗膜后加入链亲和素偶联三的碱性磷酸酶，再洗膜4次棘，加入CDPStar化学发光底物至杂交管中，室汆温孵育2mi11o用滤纸去除多余的CDPStar溶液，用X射线胶片曝光。图像采集和数据分析运酣行ScanAlyze软件,将灰度TlFF格式图片跺的点阵转化为数字型数据，僻运用芯片配套软件GEAr狞FayAnalyzer对策原始数据进行去背景计算以八及比较运算。逆转录7.聚合酶链反应方法验证

7、部分锡差异表达基因。引物设鲁计将RNA反转录合成C踹DNA,用Primer5奈软件设计，由上海生物工程镶技术有限公司合成。扩增濡引物PrimerbpIR好S2F0XC2ac史tin上游5,TTga痕Ggcggctaagtc滦T3下游5TCC鹦CAGgATgCTgTT眉gC3上游5CCTTCTACCgCGAG嚏AACAAG3,下游5埃CCGgGTCGAg黄CGTCCAGTAG3上游5,ATGCCA面TCCTGCgTCTG芨3,下游5,ACTCC蟒TgCTTGCTGATC辜C339352056雾6扩增反应条件：FOXC294oC5min薮；9430s；50s只；72lmin；72落5min；共30

8、个循环IRS294C5mi篙n；9430s；5TOs；72Clmin;725min；共30个讥循环actin94oC5min;94C30抵s；50s；721徉min；72C5min营；共30个循环扩增产物萦取101的acti搬n和101目的基因在琼脂糖（含/ml）上电泳鎏,紫外灯下视察结果并照相唐,吸光度扫描仪扫描后PC鞍R条带用软件进行定量分析白，结果为基因表达量对樵actin内参的比值，以上结果重复3次,取平均值竦OWesternb野lotting检测IRS艇2蛋白的表达抽提蛋白、制备PAGE胶、膜在5噢%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结柯合。加入HRP标记的二级酌抗体以结合

9、一级抗体及HR乡P标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜惫1小时。KCTM化学发光讽试剂盒中两种试剂等比例混裕合为反应液，将膜置于反应液中室温孵育5mino去除过量的溶液，将膜夹在两减塑料薄膜之间，以X光胶片美曝光。图片扫描保存为电脑文件，并用IrnageJ分析软件将图片上每个特异条伪带灰度值数字化。统计率学分析各组试验数据以（耙XS）表示，采纳SPS畚S软件处理，以OneWa扫yAN0VA方法进行方差分析，P3结果糖尿履病湿热困脾证临床基本资料银间的关系湿热困脾证组B种MI、HbAlc均高于健鲸康比照组，其间差别有统计尿学意义（P表1糖尿病湿热困脾证与健康比照组BM妙KHbAlcaS

10、I的-1.比较与健康组比较,*P乾表2糖尿病湿热困脾证与匠健康比照组TG、HD1.锁C、1.D1.C的比较与墨健康组比较，*P表3糖尿病湿热困脾证与健康比照组BMKHbAlcI三SI的比较与健康组比较陇，*P基因芯片检测结果总RNA提取结果总R峨NA紫外分光0D26/0象D28在之间，提取的总丈RNA28S18SrR慵NA亮而浓条带清楚，RNBA样品电泳条带清楚，28怔S比18S条带的亮度接近付2：1,质量符合分类表达早谱芯片试验要求，总RNA爽质量完整无降解。湿热困脾证糖尿病患者的基因表是达探讨湿热困脾证糖尿病患薛者与健康比照组相比，共筛脓选出表达量变更比值大于2蔓倍的基因38条，其中表达诵

11、上调的基因有24条，包括租受体、载体通道基因5条；分泌基因5条；信号转导基因2条；转录因子基因7条硝；代谢酶基因5条。表达下瑛调的基因有14条，包括代怪谢酶基因2条；信号转导基拜因6条；受体、载体通道基跃因3条；转录因子基因1条沪；未知基因1条，见图1、盾表4、表5o湿热困脾组曦健康比照组图1化学发鹤光法SuperArrar疆y芯片图表4糖尿病湿敷热困脾证与健康比照组相比桐表达上调基因表5糖尿病湿热困脾证与健康比照组厂相比表达下调基因部分6.差异基因的验证荧光定量PCR检测结果结果显银示，两条基因表达均与芯片惘结果相符合，其中FOXC芳2在湿热困脾证中表达为上屹调；IRS2在湿热困脾盛证中表达

12、为下调，见图2、掾图3、表6oWest皈ernblotting兼检测结果结果显示IRS跳2蛋白表达与基因芯片结碰果相一样，在湿热困脾证中表达削减，见图3oMa舆rkem1.健康比照组端；2.湿热困脾组图2贮糖尿病湿热困脾证与健康人爻IRS2、F0XC2和柳内参照基因actin浸mRNA表达1.湿热困峻脾组2.健康比照组图坪3糖尿病湿热困脾证和健康比照组IRS2蛋白表达表62型糖尿病湿热C困脾证与健康人IRS2疥、F0XC2mRNA及I览RS2蛋白的表达与糖琬尿病组比较，*P4探讨2型糖尿病属于中医消渴乌的范畴。病因为长期食用冽肥甘厚腻之品，而致湿热中狗阻，久而发为消渴。肥胖是幕湿热困脾型2型糖

13、尿病的重聒要因素，故湿热困脾证糖尿鹿病患者体重指数较高，肥胖往往伴随胰岛素反抗，本项吁探讨显示：湿热困脾证的I屋SI指数显著低于健康人，邰提示存在胰岛素反抗。湿热困脾证糖尿病患者的血糖、血脂及电解质水平均高于健醛康比照组；糖尿病患者基因仃表达与健康人比较，差异表玄达基因有38条，差异基因谟总体呈上调趋势。这些基因皴与肥胖、胰岛素反抗、早期糖尿病及糖尿病的各种并发禾症有关。IFN属于蜩分泌因子相关基因，是一种由活化T细胞产生，具有抗病毒、抑细胞生长及刺激中勺性粒细胞及血管内皮细胞生挽长的生理功能。过去已有多B项探讨表明：自身免疫性疾鸠病患者的血清干扰素(INF)反应异样。淋巴细胞产生的IFN介导

14、单核细掬胞与T淋巴细胞之间的对话枢。目前认为不仅1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，而匍且2型糖尿病的发病也与机最体的免疫功能亲密相关。2纾型糖尿病是在遗传基础上由醋多因素促成的，患者有免疫嶂异样，其胰岛细胞抗体(I懒CA)阳性者比ICA阴性违者有更严峻的细胞损害读1。IFN能显著抑T制胰岛素的分泌，促进胰岛咎细胞凋亡2。本探讨岁中，基因芯片结果中糖尿病初湿热困脾证患者的IFN表达上调，显著高于健康别比照组，表达差异在2倍以铺上。1.选择素属于受体、载哦体及其通道基因，是黏附分机子选择素家族的成员之一。近年的探讨显示1.选择素职与糖尿病血管病变的发生发展亲密相关3,1.选水择素介导的活化血小板与内

15、1.皮细胞、白细胞的黏附，相陆互作用，释放活性物质，如轧血小板源性生长因子、血管钩内皮细胞生长因子、成纤维组细胞生长因子等，促进血管匚平滑肌增生、结缔组织生成洋，最终导致动脉粥样硬化的宅形成4。本探讨中，糖分尿病湿热困脾证患者的1.选=择素的表达显著高于健康对怅照组，可能与2型糖尿病患龌者伴有不同程度血管病变的措并发症有关。IRS2蛋白（MrI80000）最1i初是从骨髓组织中提纯分别氨,称为4PS,因与IRS犒1有高度保守结构和一些共同功能，后定名为IRS滴25o已证明IRS汇2的表达下降有助于2型笔糖尿病的形成。造成IRSH72表达下降的缘由包括基悟因启动子或增加子的突变，褚这使转录速度减

16、小；还包括口造成mRNA稳定性或转录蟾效率下降的突变等。本项探讨中发觉有5条特异性下湃调表达基因，仅存在于湿热困脾证中，而在其他证型中乐未见有异样表达。它们分别是：CCR2、INPP1.涣1、AKT2、CEACA匏MKNFKBl,这些基因均与2型糖尿病的发生和朱发展有亲密的联系，本项目秀探讨结果进一步证明它们与海湿热困脾证有内在的联系。互通过对糖尿病湿热困脾证襦的基因组学探讨，深化了对眩湿热困脾证本质的理性漪相识，将宏观现象的探讨与窖微观机理的探讨很好的结合埠，中医辨证施治侧重于宏观塘调控，对微观的揭示还不那桀么精确，诊断疾病的依据往巧往显得较为笼统，因而影响钱了治未病的普及运用。悯基因表达谱

17、是从mRNA水准反映了细胞或组织特异性锦表型和表达模式，与临床上让出现的症状和体征有着必定i的内在联系，依据基因芯片疫结果供应的依据，不难预见左糖尿病的发生发展规律，从躁而给出准确的基因治疗方案，这些都将在肯定程度上提蛆高糖尿病的治疗效果。蚪参考文献】1GOn蕤zalezAlvaro瓦1.Dominguez疡JimenezC,Ort较izAM,etkin分15andIFNpa阔rticipateint惬hecrosstalkbetweennatur螃tumournecrosalkillerandm4Onocyticcell敞Srequiredforisfactorprod漏uction1.J.

18、Ar绅thritisResTh莫er,XX,8(4):R88.2Aiell频Ofactorinducedretinalper劭meabilityism端ediatedbyano琼rallyeffecti尬veisoformSdectioninhiMEbitorJ.Dia捌betes,1997,4偏0:1473.3H剑afeziMoghada埴A,ThomasK1.,P蹉rorockA,etsMelectinshedd折ingregulates毡IeukocyterecruitmentJ.JexpMed,2001髓,193(7):863交872.4Ofcirculatio托1.IU1.械H,1.IJ,ZHANGb蕤etweenlevels溶nICAM1,VCAM趋1,1.select!暴nandcardiova釜膛.ZhongguoXi煤5Kirstenf再，ets围ignalingafteSculardiseas辣eswithOSASandaiYixue,2002,12(7):4.疳HOW1.ETT,KEi)Sakamoto，rexerciseini腻Hsulinrecept嗥Orsubstratedeficientm澹icej.Diabeiftes,2002,51(嘿2):479483.