鼻咽癌PCDGF表达及siRNA对HNE-1细胞株增殖的影响梁佳林力寿铸李景丽陈鸿雁.docx

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1、鼻咽癌PCDGF表达及siRNA对HNE-1细胞株增殖的影响梁佳，林力，寿铸，李景丽，陈鸿雁(重庆医科大学附属第一医院耳鼻喉科，重庆400016)【摘要】：目的探讨畸胎瘤细胞源性生长因子(PCce1.1.-derivedgrowthfactor,PCDGF)在人鼻咽癌中的表达；研究小干扰RNA(SnIaIIinterferirngRNA,siRNA)对鼻咽癌HNET细胞增殖的影响。方法采用免疫细胞化学的方法检测34例鼻咽癌，20例鼻咽慢性炎症组织中PCDGF蛋白的表达情况。根据PCDGF基因设计合成两条SiRNA,利用IiPofeCtamine“2000转染鼻咽癌HNET细胞。通过PT-PCR

2、、Westernb1.ot.荧光免疫组织化学法检测转染后细胞PCDGFn1.RNA和蛋白表达，采用Mn检测转染后细胞的生长增殖情况，FCM法检测细胞周期分布。结果与鼻咽慢性炎症组织相比，PCDGF蛋白在鼻咽癌中表达明显升高(p0.01)O转染48h后，HNET细胞中PCDGFmRNA和蛋白表达水平分别下调64.7%和69.8乐而且细胞增殖明显受到抑制，细胞周期被阻滞于G1.期。结论特异性SiRNA能够有效沉默PCDGF基因表达，并显著抑制鼻咽癌HNET细胞增殖。【关键词】鼻咽肿瘤，PCDGF,RNA干扰【中图分类号】R739.63【文献标识码】AExpressionofPCDGFinnasop

3、haryngea1.carcinomaandtheeffectofsma1.1.interferingRNAagainstpro1.iferationofnasopharyngea1.carcinomaHNE-Ice1.1.1.ine1.iangJia,1.in1.i,ShouZhu,1.iJing1.i,ChenHongyan(DepartmentofOto1.aryngo1.ogy,FirstAffi1.iatedHospita1.,ChongqingMedica1.University,Chongqing400016,China)AbstractObjective:Toinvestiga

4、tetheexpressionsofPCce1.1.-derivedgrowthfactor(PCDGF)innasopharyngea1.carcinoma；Tostudytheeffectofsma1.1.interferingRNA(siRNA)againstPCDGFgeneonthepro1.iferationofnasopharyngea1.carcinomaHNE-Ice1.1.ds:Immunohistochemica1.stainingwasusedtoexaminetheexpressions1.eve1.sofPCDGFproteinin34casesofnasophar

5、yngea1.carcinomatissuesand20casesofchronicinf1.ammationnasopharyngea1.siRNAexpressionp1.asmidstargetingPCDGFmRNAwereconstructedbasedonthenuc1.eotidesequenceofPCDGFandwereindividua1.1.ytransferredintohumannasopharyngea1.carcinomaHNE-Ice1.1.1.ineviaIipofectaminera2000.Theexpression1.eve1.sofPCDGFmRNAa

6、ndproteinwereana1.yzedbyreversetranscriptionpo1.ymerasechainreaction(RT-PCR),Westernb1.ottingandimmunof1.uorescenceassay,respective1.y.Thece1.1.pro1.iferationwasdeterminedbyMTTassay.Thedistributionofce1.1.cyc1.ewasassessedbyf1.owcytometry.Resu1.ts/PCDGFproteinswereabnorma1.1.yincreasedinnasopharynge

7、a1.carcinomacomparedwithchronicinf1.ammationnasopharyngea1.(P0.01).Theexpression1.eve1.sofPCDGFmRNAandproteinwerereducedby64.7%and69.8%,respective1.y.ThegrowthrateofHNE_1ce1.1.stransfectedwithPCDGF-SiRNA-Iwassignificant1.ydecreased.Moreover,thece1.1.cyc1.earrestintheG1.phasewasobserved.Conc1.usion;S

8、pecifcsiRNAcaneffective1.yinhibittheexpressionofPCDGFgeneandobservab1.ysuppressce1.1.pro1.iferationofnasopharyngea1.carcinomaHNE-Ice1.1.KeywordsNasopharyngea1.neop1.asms;PCDGF;RNAinterference.Correspondingauthor:ChenHongyan,Te1.:,E-mai1.:鼻咽癌(nasopharyngea1.carcinoma,NPC)是中国南方常见的一种头颈部恶性肿瘤，其恶性程度高，具有强大

9、的侵袭转移能力，且发病部位隐蔽，早期诊断难。畸胎瘤细胞源性生长因子(PCce1.1.-derivedgrowthfactor,PCDGF)是近年来发现一种分子量为88kD的以自分泌形式促进细胞生长的细胞因子3,其在多种肿瘤中高表达，如乳腺癌口，卵巢癌，食管鳞状细胞癌，肺癌,喉鳞状细胞癌等，与肿瘤增殖、浸润、转移相关，在肿瘤的发生、发展中起重要的作用。因此沉默肿瘤细胞中PCDGF表达有助于防治肿瘤的增殖转移。RNAi是一种抑制特定基因产物表达的有效方法，是由双链RNA(dsRNA)介导的特异性降解相应序列的mRNA,导致靶基因的沉默。本研究采用RNA干扰技术，沉默PCDGF表达，探讨其对鼻咽癌细

10、胞株HNET生物学行为的影响，以期为鼻咽癌的早期诊断与治疗奠定基础。1材料与方法1.1 材料1.1.1 研究对象收集2009年9月2010年5月重庆医科大学附属第一医院耳鼻喉外科病房收治的34例鼻咽癌及20例鼻咽慢性炎症组织，所有标本均经10%福尔马林固定，并在3天内进行石蜡包埋；人鼻咽癌细胞株由重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心惠赠。1.1.2 主要试剂山养抗人PCDGF多克隆抗体购自美国R&DSystems公司；通用型SP免疫组化染色试剂盒、兔抗山羊IgG-FITC二抗均购于北京博奥森生物技术有限公司；SP染色试剂盒、DAB显色剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司；RPMII640,胎牛血清

11、均购自美国G1.BCO公司；RJPCR试剂盒购于宝生物工程大连有限公司；IiPofeCtamine2000购于InVitrogen公司；蛋白裂解液、Mn试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.2 方法1.2.1 免疫组化染色将石蜡包埋的组织标本制成4um厚度切片，按SP染色试剂盒操作步骤：常规脱蜡水化，抗原修复，3%H202消除内源性过氧化物酶，血清封闭，一抗PCDGF(稀释浓度1.100)4过夜，二抗37孵育15min,DAB显色，苏木精复染，光学显微镜观察。用已知阳性片做阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。结果判定：PCDGF以细胞质中出现黄色或棕黄色

12、颗粒计为阳性细胞。具体参照GinetteSerreroand1.Offe的评判标准，综合染色强度和分布范围进行综合评定。400倍镜下计算每张切片阳性细胞百分率，小于5%为阴性片，大于5%为阳性片。阳性强度以局部分布的淡黄色为弱阳性(+),以局部或弥散分布的棕黄色为中度阳性(+),以弥散分布的棕褐色为强阳性(+)。1.2.2 SiRNA的设计与构建设计针对PCDGFmRNA(GeneBankNMj)O2087)的2个靶序列。siRNA-1：5-Gcttccaaagatcaggtaaca-B,；siRNA-2：5,-gcagaagggtacctgtgaaca-3,o进行同源性分析以保证序列作用的特

13、异性。1.2.3 细胞培养与转染HNET细胞株培养于含10%胎牛血清的RPM1.1640培养液中，置于37、5%CO2培养箱中培养，倒置光学显微镜下观察细胞生长情况，常规传代，收集对数生长期细胞，台盼蓝染色进行活细胞计数。转染前一天，HNET细胞以4X105个j接种于6孔板中，常规培养至60%-80%融合，将质粒脂质体复合物转染至细胞。实验分组：转染组（SiRNA-1、siRNA-2）,空白对照组（空脂质体转染组，B1.ankContro1.）0转染后48h,荧光显微镜下观察细胞转染情况，计算转染率。转染率（）二荧光细胞数/全部细胞数XIo0%。1.2.4RT-PCR反应转染48h后，用Tri

14、ZOI分别提取SiRNA组、空白对照组的细胞总RNA。反转录合成CDNA,以CDNA为模版进行PCR。PCDGF的上游引物：5,-CTATACCTGCTGCCGTCTACAGT-3,下游引物：5-ATCACAGGGGACATCTCTCnC-3,扩增片段大小约为222bp；以B-actin为内参，上游引物：5-GTCCACCGCAAATGCnCTA-3,下游引物:5,-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3,扩增片段大小为190bp0扩增条件：94变性30s,58退火30s,72延伸30s,循环30次。反应产物上样于琼脂糖凝胶电泳，40min后凝胶呈像系统成像分析。1.2.5 Wester

15、nb1.ot检测PCDGF蛋白表达转染48h后分别收集SiRNA组、空白对照组细胞，加入含PMSF的裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA法检测蛋白质浓度。取等量蛋白上样，10%SDS-PAGE凝胶电泳、转膜。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2h后加山养抗人PCDGF多克隆抗体（1：1000）和GAPDH抗体（1：500）,4孵育过夜。次日TBST洗膜，加辣根过氧化物酶（horseradishPeroXidaSe,HRP）标记二抗（1:1000）,室温孵育1.h,TBST洗膜IOn1.inX3次，于暗室化学发光，显影、定影。对胶片进行扫描，然后用UVP凝胶图象处理系统1.abworks4.6软件分析目

16、的条带的灰度值。1.2.6 荧光免疫细胞化学检测PCDGF在HNET中的表达将HNET细胞于六孔板进行细胞爬片，培养至60%-80%融合，将质粒脂质体复合物转染至细胞，同时设立空白对照组，48h后每张玻片用4%多聚甲醛固定，3%H202去离子水消除内源性过氧化物酶活性，血清封闭，滴加稀释的一抗40U1.4过夜。次日IgG-FITC二抗室温孵育30min0荧光显微镜观察荧光强度及着色部位。荧光亮度的判定标准：（一）无或可见微弱自发荧光，（+）明确可见荧光，（+）明亮荧光，（+）耀眼荧光。1.2.7 MTT法检测细胞的增殖情况收集转染48h后的空白对照组和实验组细胞细胞，以5X103个/100U1

17、.接种于96孔板中，并设置3个复孔。继续培养细胞Oh、12h、24h、48h、72h和96h后，采用MTT法测定细胞生长活性（以570nm波长处的吸光度D值表示），并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（1一转染组D570nm空白对照组D570nm）100%O1.2.8 FCM法检测细胞周期的分布用不含EDTA的0.25%胰酶消化转染48h后的各组细胞，用PBS洗涤细胞3次，加入Im1.70%乙醇溶液，4固定过夜。次日重悬细胞于500U1.PBS,加入2mgm1.碘化丙咤（PD后，避光染色30min,然后使用流式细胞仪计数各细胞周期的细胞数。1.2.9 统计学方法采用SPSS1.9.0软件进行

18、统计学分析。所有结果计量数据均以因士s表示，每组实验重复3次，组间差异比较采用单因素方差分析，等级资料采用Wi1.COXonMannWhitneytest方法。以PVO.05为差异有统计学意义。2结果2.1鼻咽癌及鼻咽部慢性炎症组织中PCDGF蛋白的表达PCDGF在鼻咽癌组织中的表达主要定位于细胞质，少数有包核着色。34例鼻咽癌组织中，PCDGF蛋白的阳性率为85.3%而在20例对照组中PCDGF的阳性率为5%o与鼻咽部慢性炎症相比，PCDGF在鼻咽癌组织中呈现高表达，差异有统计学意义（P0.01）（见图1-4,表1）图1PCDGF在鼻咽癌组织中呈强阳性表达(200)/(400)图2PCDGF

19、在鼻咽慢性炎症组织中呈阴性表达(X200)/(X400)表1PCDGF蛋白在鼻咽癌及鼻咽部慢性炎症组织中的表达分组例数PCDGFP值-+鼻咽癌组织3459155鼻咽部慢性炎症组织20137000.012.2转染率的测定转染24-72h,于倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白的表达(见图5),48小时时荧光表达最强,按质粒(50ngu1.)与脂质体(1ipofectamine2000)之比为2：5时，转染效率最高，可达58%。A荧光B白光图5SiRNA质粒表达载体转染HNE-1细胞48h后（200X）2.3PT-PCR检测PCDGF的mRNA表达转染后48h,SiRNA组PCDGF1.nRNA表

20、达水平均较空白对照组明显下调（p0.05）,siRNA-1,SiRNA-2组PCDGFmRNA表达分别下降64.7%,39.8%o（见图6,表2）PCDGF-actin2181.O.6.42O 0.60.M：DNA Marke 500； 1：空白对照组；2： SiRNAT组;3：SiRNA-2组图6RT-PCR检测各组细胞中PCDGF的RNA水平表2转染后PCDGFmRNA表达的抑制率0s,n=3GroupODva1.ue of PCDGF mRNA/ -actininhibitionefficiencyB1.ankControl0.909 + 0. 0449.1%SiRNA-I0.3530.

21、 02664.7%SiRNA-2O.602 O. 06639.8*P0.05vstheb1.ankcontro1.group2.4WesternbIot检测PCDGF蛋白水平的表达转染后48h,SiRNA组PCDGFmRNA表达水平均较空白对照组明显下调（p0.05）,siRN-1.,SiRNA-2组PCDGFmRNA表达分别下降69.8%,60%o（见图7,表3）因此，后续实验选择SiRNAT进行转染。Contro1.Blank siRNA-1 SlRNA-2图7Westernb1.ot检测各组细胞中PCDGF蛋白水平表3转染后PCDGF蛋白表达的抑制率0s,n=3GroupThere1.a

22、tivegraysca1.eofPCDGFProtein/GAPDHinhibitionefficiencyB1.ankContro1.0.9150.0178.5%SiRNA-I0.3020.02769.8%SiRNA-20.4000.01760%*P0.05vstheb1.ankcontro1.group2.5 荧光免疫细胞化学检测PCDGF蛋白的表达变化空白对照组细胞浆、细胞膜明显荧光表达，提示细胞内PCDGF大量表达，siRNA组细胞内荧光表达明显减弱，提示PCDGF蛋白表达受到抑制。空白对照组BSiRNA组图8荧光免疫细胞化学检测各组细胞中PCDGF蛋白表达(200X)2.6 SiRN

23、A对鼻咽癌细胞HNET增殖的影响选择沉默效率最高的PCDGF-SiRNAT进行转染后，通过Mn法检测PCDGF基因对HNET细胞增殖的影响，绘制生长曲线(见图9)。Mn法检测结果显示：种板48h后，PCDGF-siRNA-1.组HNET细胞增殖开始受到明显抑制，在48h、72h和96h这3个时间点的细胞增殖抑制率分别为(37.0712.4)%、(33.036.2)%和(36.834.3)%,与空白对照组比较差异有统计学意义(P0.05)图9MTT检测PCDGF-s i RNA转染对HNET细胞生长的影响CJ俎 EUoZsV2.7 SiRNA对鼻咽癌细胞HNET周期分布的影响细胞48h后，FCM

24、法检测细胞周期结果显示，与空白对照组相比，转染组SiRNA-1G1.期细胞比例明显增多，而S期细胞减少，表明细胞增殖减慢。即沉默PCDGF基因表达后，鼻咽癌HNET细胞的增殖收到明显抑制。SiRNAT转染组与空白对照组周期分布差异有统计学意义(P0.05),提示SiRNAT转染能将鼻咽癌HNET细胞阻滞于G1.期(表4,图9)。表4SiRNA转染对鼻咽癌HNET细胞周期分布的影响GroupGOG1SG2MB1.ankContro1.54.731.19642.061.1674.38O.879PCDGFsiRNA-I71.490.85418.721.25112.451.192*P0.05vsthe

25、b1.ankcontro1.group图10流式细胞仪检测PCDGF-Si RNA转染对HNET细胞周期的影响(C1.o)烟果nq3.讨论PCDGF又称上皮素-颗粒素前体(GranU1.in-EPithe1.inPreCUrSor,GEP),是从鼠畸胎瘤PC细胞系条件培养基中纯化获得并鉴定的一种88kD的糖蛋白，它以自分泌形式促进此细胞生长t1.PCDGF可促进缺乏胰岛素样生长因子受体I(IGF-IR)的鼠胚成纤维细胞生长。研究表明，PCDGF参与多种肿瘤，例如卵巢癌、乳腺癌、喉鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌等的发生、发展，Zhang等研究发现，采用RNA干扰技术特异性沉默PCDGF基因在喉癌细胞

26、株hpe-2中的表达，可导致细胞周期停滞，从而抑制癌细胞的异常增殖。目前尚缺乏PCDGF与鼻咽癌关系的研究。本研究应用免疫组化技术检测了PCDGF蛋白在鼻咽癌及鼻咽部慢性炎症组织中的表达，发现PCDGF蛋白水平显著高于鼻咽部慢性炎症组织，在鼻咽部慢性炎症组织PCDGF的表达是阴性或呈弱表达。表明了PCDGF参与了鼻咽癌的发生。RNAi具有高效率长时间沉默靶基因的特点，在最优化的长度和剂量下，SiRNA能避免发生非特异性和毒性。SiRNA不需要进一步的化学修饰，它在血清中非常稳定，在培养哺乳细胞中也能保持高度活性，因此RNAi是研究基因功能和发展治疗的有力的工具的o本实验设计针对PCDGF基因中

27、2个干扰靶点的SiRNA,转染鼻咽癌HNET细胞株后，探讨运用RNA干扰技术沉默PCDGF基因的可行性及其对鼻咽癌细胞增殖的影响。本研究结果表明，转染组与未转染组相比，转染各组均有荧光的表达，表明成功将质粒转染入细胞中。HNET细胞在转染48h后，2条PCDGFSiRNA均能有效的沉默PCDGF基因，其中PCDGFSiRNAT对PCDGF基因的沉默效率最显著，相对于空白对照组，PCDGF基因的1RNA和蛋白表达水平分别下降了64.7%和69. 8%（P0.05）,表明在mRNA和蛋白水平上SiRNA-1对目标基因有最明显的抑制效果，荧光免疫细胞化学的结果也在蛋白水平上证实了SiRNAT对PCD

28、GF表达有最明显的抑制作用。进一步研究发现，沉默PCDGF基因表达后，HNET细胞的生长活性受到明显抑制，且细胞周期被阻滞于G1.期。本研究使SiRNA诱导的PCDGF沉默可能成为鼻咽癌的一种全新的潜在的辅助治疗手段。有研究表明PCDGF通过激活MAPK途径（有丝分裂原激活的蛋白激酶）、PI3K途径（磷脂酰肌醇-3-激酶）和FAK途径（局部粘附激酶）来调控细胞的增殖和凋亡2团。因此，沉默PCDGF基因可能通过抑制上述途径调控细胞增殖及细胞周期相关基因的表达等多种因素，影响鼻咽癌HNET细胞的体外增殖。当然，PCDGF抑制鼻咽癌HNET细胞增殖的确切机制还有待进一步的研究，我们将进一步运用该干扰

29、质粒为后续机制研究作为基础。综上所述，本研究成功设计了针对PCDGF基因的SiRNA,并证实了PCDGFSiRNA能够特异性沉默PCDGF基因在鼻咽癌HNET细胞中的表达，并有效抑制HNET细胞增殖。因此，提示PCDGF可作为预测鼻咽癌细胞增殖的一个新指标，有望成为运用于鼻咽癌基因治疗的一个新靶点。参考文献1 ZhouJ,Gao.G,Crabb.J.W,eta1.Purificationofanautocrinegrowthfactorhomo1.ogouswithmouseepithe1.inprecursorfromahigh1.ytumorigenicce1.1.1.ineJ.JBio1

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31、1.1.sandthere1.atedmechanismJ.ZhonghuaZhong1.iuZaZhi,2009,31:90-94.4 Chen.X.Y,1.i.J.S,1.iang.Q.P,eta1.ExpressionofPCce1.1.-derivedgrowthfactorandvascu1.arendothe1.ia1.growthfactorinesophagea1.squamousce1.1.carcinomaandtheirC1.inicopatho1.ogicsignificanceJ.ChinMedJ(Eng1.),2008,121:881-886.5 Stewart.D

32、.J.Tumorandhostfactorsthatmay1.imitefficacyofchemotherapyinnon-sma1.1.ce1.1.andsma1.1.ce1.1.1.ungcancerJ.CritRevOnco1.Hemato1.,2010,6 Kong.W.J,Zhang.S.1.,Chen.X,eta1.Pcce1.1.-derivedgrowthfactoroverexpressionpromotespro1.iferationandsurviva1.of1.aryngea1.Carci1.1.o1.naJ.Anti-CancerDrugs,2007,18(1):2

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