NY_T 4426-2023 饲料中二硝托胺的测定.docx

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1、ICS65.120CCSB46NY中华人民共和国农业行业标准NY4426-2023代替农业部783号公告一52006饲料中二硝托胺的测定DeterminationOfdinitolmideinfeeds2023-222发布参考件1海中华人民共和国农业农村本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草.本文件代替农业部783号公告一52006饲料中二硝托胺的测定高效液相色谱法,与农业部783号公告一52006相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下：a）更改了适用范围（见第1章,2006年版的第1章）；b）增加了高效液相色谱法检出限（见第1

2、章）；c）增加了液相色谱G串联质谱J.叽第4章）；d）更改了称样量和提取方法（W.451和55.1,2006年版的7.1）；e）更改了净化方法（见4.5.2和5.5.2,2006年版的7.2）；f）更改了色谱参考条件（见4.5.3.1s5.5.3.1和5.5.3.2,2006年版的7.3.1）.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口.本文件起草单位：宁波市农产品质量检测中心.本文件主要起草人:王全胜、张亮、吴银良、凌淑萍、付岩、朱勇、应永飞、徐峰.本文件及其所代替文

3、件的历次版本发布情况为：2006年首次发布为农业部783号公告一52006;一本次为第一次修订.饲料中二硝托胺的测定1龌本文件描述了饲料中二硝托胺的液相色谱中联质谱和高效液相色谱测定方法.本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补发科和添加剂预混合饲料中二硝托胺的赃.本文件中液相色谱G串联质谱法的检出限为0.01mg/kg、定量限为0.05mgkg,高效液相色谱法的检出限为0.3mg/kg、定量限为1.0mgkg.2 规范性引用文件下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)

4、适用于本文件.GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.4 液相色谱G串联质谱法4.1 原理试样经氨化甲醇提取，中性氧化铝固相萃取净化,液相色谱G串联质谱仪检测,外标法定量.4.2 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂.4.2.1 水:GB/T6682,一级.4.2.2 乙睛:色谱纯.4.2.3 甲醇:色谱纯.4.2.4 甲酸:色谱纯.4.2.5 0.5%氨水甲醇溶液:取氨水5m1.用甲醇定容至1000m1.,混匀.4.2.6 0.1%甲酸溶液:取甲酸(4.2.4)1m1.用水稀释至1OOOm1.,混匀.4

5、.2.7 甲酸G乙隋溶液:取0.1%甲酸溶液(4.2.6)800m1.,用乙睛(4.2.2)稀释至1OoOm1.混匀.42.8标门储备溶液1.lnnd.)称取二硝托股标品(CAS号448-olG6F度不低于98%：10mg精确个001Wg)置于InEI京Hlfc中用乙BS(42溶解并定容.混一于一18以下保存.有效B3个Fl4.2.9 标准中间溶液(25gm1.):准确移取标准储备溶液(4.2.8)0.25m1.置于10m1.容量瓶中，用乙睛(4.2.2)稀释、定容、混匀.于-18以下保存,有效期1个月.4.2.10 标准系列溶液：准确移取标准中间溶液(4.2.9),分别用0.1%甲酸溶液(4

6、.2.6)和乙睛(4.2.2)稀释、定容至1m1.混匀，配制成浓度分别为2ng/m1.5ng/m1.20ng/m1.50ng/m1.200ng/m1.和500ng/m1.的标准系列溶液.临用现配.4.2.11 1固相萃取柱：中性氧化铝柱,1g/6m1.或性能相当者.4.2.12 微孔滤膜:0.22m,有机系.4.3 仪器设备1.1.1 液相色谱G串联质谱仪:配电喷雾离子源.1.1.2 离心机:转速不低于10000rmin1.1.3 .3.3分析天平:感量0.01mg和0.01g.1.1.4 振荡器.1.1.5 涡旋混合器.1.1.6 固相萃取装置.1.1.7 可控温氮吹仪.4.4 样品按GB/

7、T20195的规定制备样品,至少200g,粉碎使其全部通过0.425mm孔径的分析筛，充分混匀，装入磨口瓶中，保存,备用.4.5 试验步骤4.5.1 提取平行做2份试验.称取试样5g(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为2g),精确至0.01g,置于50m1.塑料离心管中,准确加入20m1.(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为10m1.)氨水甲醇溶液(4.2.5),涡旋30s,振荡提取40mim于9500r/min离心3min,移取上清液.残渣重复提取1次,振荡20min漓心后合并上清液.待净化.4.5.2 净化用5m1.甲醇(4.2.3)活化固相萃取小柱(4.2.11).准确移取5m1.(浓缩饲料和添加剂

8、预混合饲料为2.5m1.)待净化溶液(4.5.1)过柱,用4m1.(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为2m1.)甲醇(4.2.3)洗脱，收集洗脱液,用甲醇(4.2.3)定容至10m1.(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为5m1.),混匀.准确移取1m1.于45下用氮气吹干，准确加入1m1.甲酸G乙胞溶液(4.2.7)溶解残渣，涡旋混匀，微孔滤膜(4.2.12)过滤,备用.4.5.3 测定4.53.1 液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱:C】8柱,柱长100mm,内径2.1mm,粒度1.7m,或性能相当者；b)柱温：35；c)进样量：10瓜；d)流动相：A相为0.1%甲酸溶液(4.2.6)出相

9、为乙睛(4.2.2),梯度洗脱程序见表1；e)流速：0.2m1.min.表1梯度洗脱程序时间，minA相，B相，%080200.580203.020803.520803.680205.080204.53.2 质谱参考条件质谱参考条件如下：a)电离方式：电喷雾电离，负离子模式(ESI);b)检测方式：多反应监测(MRM);c)毛细管电压：2.5kV;d)离子源温度：150；e)脱溶剂温度：500；f)脱溶剂气氮气1OOO1./h;g)多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2.表2待测物多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值待测物名称监测离子对，mz推孔电压，V碰撞能量

10、,eV二硝托胺224.176.92222224.1181.1a2210,为定量离子对.4.5.3.3标准系列溶液和试样溶液测定在仪器的最佳条件下,分别取二硝托胺标准系列溶液(4.2.10)和试样溶液(4.5.2)上机测定.标准溶液液相色谱G串联质谱定量离子对色谱图见附录A中图A.1.4.53.4 定性在相同试验条件下，试样溶液与标准系列溶液(浓度相当)中二硝托胺的保留时间相对偏差在2.5%之内.根据表2选择的定性离子对，比较试样谱图中二硝托胺定性离子对的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的定性离子对的相对离子丰度，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在二硝托胺.表3定性测定时

11、相对离子丰度的最大允许偏差单位为百分号相对离子丰度5020-5010-2010最大允许偏差202530504.53.5 定量以二硝托胺标准溶液的浓度为横坐标、定量离子对的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线,标准曲线的相关系数应不低于0.99.试样溶液与标准溶液中二硝托胺的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出线性范围，应将试样溶液作相应稀释后重新测定.单点校准定量时,试样溶液中二硝托胺的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%.4.6试验数据处理试样中二硝托胺的含量以质量分数计.多点校准按公式(1)计算，单点校准按公式(2)计算.勺VV.Vb.lW=-Q(1)式中：w一试样中二硝托胺含量的数值，单位

12、为亳克每千克(mgkg);p1-由标准曲线得到的试样溶液中二硝托胺质量浓度的数值，单位为纳克每毫升(ngm1.);V 试样提取溶液体积的数值，单位为毫升(m1.);V 1-净化后溶液定容体积的数值，单位为亳升(m1.);V 2-氮吹后最终定容体积的数值，单位为亳升(m1.);1 OOO一换算系数；V3-用于净化的提取溶液体积的数值，单位为亳升(m1.);VA-用于氮吹的净化溶液体积的数值，单位为亳升(m1.);m一试样质量的数值，单位为克(g).g式中：A试样溶液中二硝托肢的色谱峰面积；p2一标准溶液中二硝托胺的浓度，单位为纳克每毫升(ngm1.).AS标准溶液中二硝托胺的峰面积.测定结果以平

13、行测定的算术平均值表示,保留3位有效数字.4.7精密度在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的20%.5高效液相色谱法5.1 原理试样经氨化甲醇提取，中性氧化铝固相萃取净化，用液相色谱仪检测,外标法定量.5.2 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂.5.2.1 水:GB/T6682,一级.5.2.2 乙睛:色谱纯.5.2.3 甲醇:色谱纯.5.2.4 甲酸:色谱纯.5.2.50.5%氨水甲醇溶液:取氨水5m1.,用甲醇定容至1000m1.,混匀.5.2.6 0.1%甲酸溶液:取甲酸(5.2.4)1m1.用水稀释至1OOOm1.,混匀.5.2.7 甲酸G乙

14、睛溶液:取0.1%甲酸溶液(5.2.6)800m1.,用乙腾(5.2.2)稀释至1OOOm1.,混匀.5.2.8 .2.8标n储备溶液1mm1.)称取二硝托股标:品(CAS号l48-iG6：1.度不低于98%IlQmg精确至001，Q)置于In”JWk中用乙晴(52溶解并定容.混R于一18cC以下保存.有效千3个月J5.2.9 标准中间溶液(25gm1.):准确移取标准储备溶液(5.2.8)0.25m1.置于10m1.容量瓶中，用乙睛(5.2.2)稀释并定容,混匀.于-18以下保存,有效期1个月.5.2.10 标准系列溶液：准确移取标准中间溶液(5.2适量,用0.1%甲酸溶液(5.2.6)和乙

15、月青(5.2.2)稀释配制成浓度分别为0.015gm1.0.050gm1.0.10gm1.0.50gm1.2.0gm1.和5.0gm1.标准系列溶液.临用现配.5.2.11 1固相萃取柱：中性氧化铝柱,1g/6m1.,或性能相当者.5.2.12 微孔滤膜:0.22m，有机系.5.3 仪器设备1.1.1 .3.1液相色谱仪：配有紫外检测器/二极管阵列检测器.1.1.2 离，:转速不低于10000rmin1.1.3 分析天平:感量0.01mg和0.01g1.1.4 振荡器.1.1.5 涡旋混合器.1.1.6 3.6固相萃取装置.1.1.7 可控温氮吹仪.5.4 样品按GB/T20195的规定制备样

16、品,至少200g,粉碎使其全部通过0425mm孔径的分析筛，充分混匀，装入磨口瓶中，保存,备用.5.5 试验步骤5.5.1 提取平行做2份试验.称取试样5g(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为2g),精确至0.01g,置于50m1.塑料离心管中,准确加入20m1.(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为10m1.)氨水甲醇溶液(5.2.5),涡旋30s,振荡提取40min,于9500r/min离心3min,移取上清液.残渣重复提取1次,振荡20min,离心后合并上清液.待净化.5.5.2 净化用5m1.甲醇(5.2.3)活化固相萃取柱(5.2.11).准确移取5m1.(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为2.5m1.

17、)待净化溶液(5.5.1)过柱,用4m1.(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为2m1.)甲醇(5.2.3)洗脱，收集洗脱液，用甲醇(5.2.3)定容至10m1.(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为5m1.),混匀.高效液相色谱仪分析时，取1m1.溶液，微孔滤膜(5.2.12)过滤，备用.超高效液相色谱仪分析时，准确移取1m1.溶液于45Oe下由氮气吹干,再准确加入1m1.甲酸G乙精溶液(5.2.7)溶解残渣，涡旋混匀,微孔滤膜(5.2.12)过滤,备用5.5.3 液相色谱参考条件5.6 3.1高效液相色谱参考条件高效液相色谱参考条件如下：a)色谱柱:Cs柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒度5Mm，或性

18、能相当者；b)柱温：35；c)检测波长：245nm；d)进样量：201.e)流动相：0.1%甲酸溶液(5.2.6)+乙睛(5.2.2)=80+20+丫)；f)流速10m1./min5.7 .53.2超高效液相色谱参考条件超高效液相色谱参考条件如下：a)色谱柱:Cs柱,柱长100mm,内径2.1mm,粒度1.7111,或性能相当者；b)柱温：35；c)检测波长：245nm；d)进样量：101.e)流动相A相为0.1%甲酸溶液(5.2.6)出相为乙睛(5.2.2),梯度洗脱程序见表4；f)流速：0.2m1.min.表4超高效液相色谱法梯度洗脱程序时间fminA相，B相，%080200.580204

19、.065355.530706,030706.180208.080205.5.4测定5.5.4.1标准系列溶液和试样溶液测定在仪器的最佳条件下，分别取标准系列溶液(5.2.10)和试样溶液(5.5.2)上机测定.标准溶液高效液相色谱分析色谱图见图A.2,超高效液相色谱分析色谱图见图A3.5.5.4.2定性以保留时间定性，试样溶液中二硝托胺保留时间应与标准系列溶液(浓度相当)中二硝托胺的保留时间一致,其相对偏差在2.5%之内.5.5.43定量以二硝托股的浓度为横坐标、色谱峰面积(响应值)为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99.试样溶液中二硝托胺的浓度应在标准曲线的线性范围内.如超出线性

20、范围，应将试样溶液用甲酸G乙睛溶液(5.2.7)稀释后，重新测定.单点校准定量时,试样溶液中二硝托胺的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%.5.6试验数据处理试样中二硝托胺的含量以质量分数计.多点校准按公式(3)计算，单点校准按公式(4)计算.AVVVTa=(X)VV4M式中：P3由标准曲线得到的试样溶液中二硝托胺质量浓度的数值，单位为微克每毫升Rgm1.).a1VViViWV,v7fn式中：p4一标准溶液中二硝托胺质量浓度的数值，单位为微克每亳升(gm1.).测定结果以平行测定的算术平均值表示,保留3位有效数字.5.7精密度在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平

21、均值的10%.附录A(斐料性)二硝托胺标准溶液液相色谱G串联质谱定量离子对色谱图和液相色谱图二硝托胺标准溶液液相色谱G串联质谱定量离子对色谱图见图A.1.相对丰度，%二硝托胺Iflf1.502.002.503.003.504.004.50图A.1二硝托胺标准溶液(2ngm1.)液相色谱G串联质谱定量离子对色谱图二硝托胺标准溶液高效液相色谱分析色谱图见图A.2.图A.2二硝托胺标准溶液(2.0gm1.)高效液相色谱分析色谱图二硝托胶标准溶液超高效液相色谱分析色谱图见图A.3.AUIIflMI二硝托胺0.0500.0400.0300.020AAiAAflM0.003.00图A,3二硝托胺标准溶液(2.0jgm1.)超高效液相色谱分析色谱图