WS-T421-2024抗酵母样真菌药物敏感性试验标准 肉汤稀释法.docx

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1、ICS11.020CCSC50WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T4212024代替WS/T4212013抗酵母样真菌药物敏感试验标准肉汤稀释法StandardsforantifungalsusceptibilitytestingofyeastsBrothdilutionmethod2024-04-02发布2024-09-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发布目次前言111范围I2规范性引用文件13术语和定义14抗真菌药物的配制25培养基的配制46肉汤稀释法操作步骤47结果判读与解释58质量控制8附录A（资料性）RPMl-1640肉汤培养基配制方法10附录B（规范性）肉汤稀释法质控菌株

2、MlC范围12附录C（规范性）酵母样真菌药敏试验可用的折点和/或ECV汇总表15附录D（规范性）体外微量肉汤稀释法MlC折点和ECV16附录E（规范性）EUCAST微量肉汤稀释法质控范围、折点和ECOFF值23参考文献28-XX-1-刖三本标准为推荐性标准。本标准代替WS/T421-2013抗酵母样真菌药物敏感性试验一肉汤稀释法，与WS/T421-2013相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：一增加了术语和定义中“流行病学界值”、“野生型”、“非野生型”和“拖尾生长”，删除了“非敏感”（见3.8、3.9、3.10、3.12,2013年版的2.8）;抗真菌药物储存液使用的溶剂、稀释液

3、和检测范围表格增加了瑞扎芬净、艾瑞芬净、Manogepix.艾沙康哇、酮康噗、雷夫康嗖（见4.3.2）;更改了结果解释内容：按C1.SI（Clinicaland1.aboratoryStandardInStitUte）有折点的念珠菌属、无折点的念珠菌属、暂定折点的耳念珠菌、无折点的隐球菌属及有折点和流行病学界值（C1.Sl表述：epidemiologicalcutoffvalue,ECV）的念珠菌属分别进行说明，并在附录D分别列表：增加了对抗真菌药物的具体说明；C1.SI和EUCAST的肉汤稀释法步骤基本一致，对有差异部分在文中相应部分给予了说明，包括增加了EUCAST（TheEUroPean

4、CommitteeonAntimicrobialSusceptibilityTesting）折点和流行病学界值（EUCAST表述：epidemiologicalCUtoff,ECOFF）结果解释并在附录E列出试验条件、质控范围、折点、ECOFF值等表格（见7.2,2013年版的5.5）;增加了结果报告方式，C1.Sl及EUCAST两种药敏方法相应的结果报告方式（见7.4）;一删除了质量控制中质控频率和检测频率内容，增加了：按培养基和材料质控、纯度质控、终点判读和质控；日常使用质控菌株的复苏方法（见2013年版的7.3,见8.2、8.3、8.4、8.5.3）;一更改了附录A为相关培养基配制表格，

5、附录B为质控MIC范围，附录C为酵母样真菌的折点和ECV值汇总等（见附录A、附录B、附录C,见2013年版的附录A、附录B、附录C）。本标准由国家卫生健康标准委员会临床检验标准专业委员会负责技术审查和技术咨询，由国家卫生健康委医疗管理服务指导中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委员会医政司负责业务管理、法规司负责统筹管理。本标准起草单位：北京医院/国家卫生健康委临床检验中心、北京大学人民医院、首都医科大学附属北京友谊医院、中国医学科学院北京协和医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院、上海市东方医院（同济大学附属东方医院）、北京大学第一医院、解放军总医院第一医学中心。本标准主要起草人：胡继

6、红、王辉、苏建荣、胡云建、徐英春、孙自铺、吴文娟、李若瑜、沈定霞、骈亚亚。本标准于2013年首次发布，本次为第一次修订。抗酵母样真菌药物敏感试验标准肉汤稀释法1范围本标准规定了用经典的宏量肉汤稀释方法(BrothMacrodilutionmethod)检测抗醉母样真菌的最低抑菌浓度(MinimalInhibitoryConcentrationlMIC)的参考方法，并推荐了与本参考方法结果具有良好一致性的微量肉汤稀释方法(BrothMicrodilutionmethod)o本标准适用于引起感染的酵母样真菌(包括念珠菌属某些种Candidaspp.和隐球菌属某些种Cryptococcusspp.)

7、的药物敏感性试验，并推荐了某些相关抗真菌药物的肉汤稀释试验的最低抑菌浓度(MlC)质控参考范围、折点、结果解释性分类和流行病学界值。本标准不适用于双相真菌如皮炎芽生菌Blaslomycesdermatitidis、荚膜组织胞浆菌HistoplasmaCapsulatum及丝状真菌的检测。2规范性引用文件本标准没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1最低抑菌浓度minimalinhibitoryConcentrationjMIC肉汤稀释法中，抗真菌药物能抑制微生物生长的最低浓度。本标准使用评分确定MlC值。3.2折点breakpoint;BP用于区分菌株为敏感、剂量依赖

8、性敏感、中介、耐药的最低抑菌浓度(MlC)或抑菌圈直径数值。折点系综合微生物学特征、药代动力学-药效学(Pharmacokinetics-pharmacodynamics,PKPD)参数、临床疗效数据而得出，还可随特定的感染部位、常规药物剂量、给药途径及频次等的变化而不同。3.3解释性分类interpretivecategory结果解释性分类源于可获得的微生物特性、药代动力学-药效学(PK/PD)参数和临床疗效结果数据。根据建立的折点将药敏结果所得的MIC值进行敏感、剂量依赖性敏感、中介、耐药解释分类。3.4敏感susceptible;S此浓度的抗真菌药物在体外试验中能抑制真菌生长，当使用推荐

9、剂量时，可能获得良好的临床疗效。3.5剂依赖性敏感susceptible-dosedependent;SDD指分离株的敏感性依赖于对患者的用药方案，即对于药敏结果在SDD范围内的分离株，为了使血药浓度达到临床疗效，采用较高剂量和/或增加用药频率的给药方案，使药物暴露高于常用敏感折点的剂量。中介intermediate;1中介菌株的药物浓度通常可达到常规用药时血液和组织中的药物浓度水平，但反应率可能低于敏感株，不能明确划分为“敏感”或“耐药”。在体外可抑制真菌的生长，但不能确定此浓度的临床疗效。如在机体生理浓集部位或高于正常剂量用药可获得临床疗效。此外，还可作为检测方法固有变异的缓冲区，以防止微

10、小的、不可控的技术因素导致较严重的错误结果，特别是毒性范围窄的药物。3.7耐药resistant;R当使用推荐剂量时在临床治疗中很有可能失败。3.8流行病学界值epidemiologicalcutoffvalue;ECV/epidemiologicalCUtoffjECOFF基于菌株MlC值，将微生物群归类为是否含有获得性耐药和/或突变耐药表型的两个群体（野生型和非野生型）。ECV定义了菌株野生型菌群药物敏感性的上限值（最大MIC值）。3.9野生型wild-type;WTECV将分离菌株归类为对某种检测的抗菌药物无获得性耐药机制或无敏感性降低的生物型。3.10非野生型non-wiId-type

11、;KTECV将分离菌株归类为对某种检测的抗菌药物具有推测的/已知获得性耐药机制或敏感性降低的生物型。3.11效价potency抗菌药物中具有抗菌活性的部分，通过同类标准物质测定得出。单位表示为mg/g、gmg,IUg,或用百分比表示。3.12拖尾生长trailinggrowth在结果读取时间内，随着培养时间的延长，在一定浓度范围内菌量减少但仍有少量菌持续生长的现象。3.13质量控制QualityControljQC为保证检测的准确性和可重复性而采取的方法或技术。4抗真菌药物的配制4.1抗真菌药物标准品或参考品抗真菌药物使用标准品或参考品。使用有效期内的标准品，按说明书推荐的条件下储存。当把药物

12、从低温环境中取出时，需恢复到室温后再开瓶。4.2称量药物可使用式（1）、式（2）计算药物重量及稀释液体枳：除（1?式中：m药物的重量，单位为亳克（mg）;P药物的浓度，单位为微克每亳升（ugm1.）;T药物的效价，单位为微克每亳克（ugmg）;V药物的浓度，单位为亳升（m1.）。4. 3药物储存液（母液）5. 3.1药物称量药物称量按照配制储存液的浓度计算，配制储存液浓度至少按检测范围最高浓度的100倍配制储存液。但有些溶解度低的药物应配制较低浓度的储存液。称量应在分析天平上进行，天平应定期校准。6. 3.2溶剂溶解时，一些药物需使用非水溶剂溶解（见表1）,溶剂的信息可参考厂家说明书。溶剂（分

13、析纯）包括：二甲基亚飒（DMS0）、乙醇、聚乙二醇、陵甲基纤维素。表1抗真菌药物的储存液使用的溶剂、稀释液种类及药物浓度检测范围抗真菌药物溶剂a稀释液药物浓度检测范围ug/m1.两性霉素BDMS0,培养基0.0313-16卡泊芬净DMSO培养基0.015-8阿尼芬净DMSO培养基0.0158米卡芬净DMSO培养基0.015-8瑞扎芬净DMSO培养基0.OO8-4艾瑞芬净DMSO培养基0.015-8ManogepixDMSO培养基0.004-2氟康理DMSO培养基0.12564氟胞喀咤DMSO培养基0.125-64艾沙康喋DMSO培养基0.0313-16伊曲康嗖DMSO培养基0.031316酮康

14、哇DMSO培养基0.0313-16泊沙康嗖DMSO培养基0.031316雷夫康喋DMSO培养基0.0313-16伏立康嗖DMS培养基0.0313-16某些溶剂存在潜在毒性，使用前应咨询厂家。DMSo指二甲基亚砌。培养基指RPMl-1640肉汤培养基，如使用商品化RPMIT640肉汤干粉配制，步骤见表A.1。储存液通常是无菌的，如需进行除菌操作，应使用无菌滤膜过滤（过滤细菌常用孔径为0.2m）o应避免使用纸张、石棉和玻璃滤器等具有吸附抗真菌药物的材质。4.3.4存储储存液应在无菌塑料管中分装，密封保存于-70C或更低环境，保存温度不高于-20C。从冰箱中取出的当天使用，现用现取，未用完的应丢弃。

15、大多数药物储存液在-70C可保存6个月。4.4非水溶性抗真菌药物稀释液对于不溶于水的抗真菌药物，需先用合适的溶剂配制UoO倍终浓度的储存液，然后用RPMl-1640肉汤稀释为10倍终浓度的中间浓度（最终要与菌液1：9混合），配制步骤见表2。5培养基的配制5.1RPMI-1640肉汤培养基推荐使用RPMI-1640肉汤培养基（配制方法见表A.1）,若无商品化RPMl-1640干粉培养基，配方见表A.2。5.2含2%葡萄糖的RPMI-1640肉汤培养基微量肉汤稀释法推荐使用葡萄糖含量为2%的RPMI-1640肉汤培养基，配方见表A.3。表2非水溶性抗真菌药物稀释步哪配制步骤浓度(Ugm1.)来源体

16、积(m1.)溶剂=IDMSO0(m1.)中间浓度=（gm1.）终浓度1:10(Ugm1.)1.og:15120储存液1.07.06406462640步骤11.01.03203253640步骤11.03.01601644160步骤31.01.080835160步骤30.51.540426160步骤30.53.52021720步骤61.01.01010820步骤60.51.550.5-1920步骤60.53.52.50.25-2102.5步骤91.01.01.250.125-3112.5步骤90.51.50.6250.0625-4122.5步骤90.53.50.3130.0313-5DMSo指二甲

17、基亚碉。配制步骤1举例，取5120Ug/m1.的储存液1.Om1.,加入7.0m1.溶剂，得到中间浓度为640Ugm1.,作为步骤2的初始浓度，取1.Om1.,加入1.0m1.溶剂，得到中间浓度320口gm1.,以此类推；宏量肉汤稀释法取0.1m1.中间浓度液与10倍浓度接种菌悬液充分混合得到最终药物浓度（终浓度）。6肉汤稀释法操作步骤6.1 宏量肉汤稀释法操作步骤6.1.1 菌悬液的制备所有酵母样真菌应在沙保罗培养基（SDA）或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上至少传代培养两次，以确保菌株的纯度和活性。念珠菌于35培养24h,新型隐球菌培养48ho挑选直径约Imm的5个相似菌落，加入5m1.0.

18、85%无菌盐水混匀，用浊度仪或0.5麦氏单位硫酸领浊度标准管（配制见表A.4）配制浓度lX106cFU/m1.5xlO。CFU/m1.菌悬液（0.5麦氏单位），振荡器上持续混匀15s,再用0.85%无菌盐水进行1:100倍稀释；然后用RPMl-1640肉汤进行1:20倍稀释（两次共稀释菌液浓度2000倍），得到终浓度为0.5IO3CFUm1.-2.5103CFUm1.的菌悬液。6.1.2 接种在无菌试管中分别加入表2所示系列中间浓度液0.1m1.,I5min内（4C下可延长至2h）将0.9m1.配制好的菌悬液加入试管中，涡旋混匀各试管，得到1:10稀释的药物（终浓度）及10%稀释的接种用菌悬液

19、。阳性生长对照管（无抗真菌药物）中加入09m1.菌悬液和0.1m1.RPMI/640肉汤培养基。无菌对照管，只加1m1.RPMI-1640肉汤培养基，不加菌悬液和药物。6.1.3 培养将接种管置于35C温箱中培养，念珠菌应培养24h48h,对于24h后生长不良的分离株，最高可达48h,新型隐球菌应培养70h74ho培养过程中避免震摇试管。6.2 微量肉汤稀释法操作步骤6.2.1菌悬液的制备按本标准第6.1.1条方法培养和制备0.5麦氏单位浓度为110oCFUm1.5xl（CFUm1.的菌悬液，震荡混匀15s,用含2%葡萄糖的RPMIJ640肉汤培养基将菌液1:50稀释后，再做1:20稀释（两次

20、共稀释菌液浓度100O倍），得到浓度lXl（PCFUm1.5xl（）3CFUm1.（2倍接种菌液浓度）的菌悬液。6.2.2药物稀释液的制备按本标准第4.3条配制200倍终浓度的药物储存液。使用时按本标准第4.4条将储存液1:100倍稀释。示例：在9.9m1.2倍终浓度的含2%葡萄糖的RPMI-1640肉汤中加入100U1.药物储存液，经100倍稀释得到2倍终浓度的工作液。6.2.3接种在96孔微孔板上，第11列作为菌株的阳性生长对照孔，只加菌悬液和不含药物的肉汤。于生长对照孔中先加100U1.不含药物的2%葡萄糖RPMI-1640肉汤，再加1001.2倍接种量的菌悬液。第12列为无菌对照孔，只

21、加2%葡萄糖RPMI-1640肉汤，不加菌悬液和抗真菌药物。根据药物浓度检测范围（可参考表2）由低浓度到高浓度依次用（多道）加样器，从96孔板的第1列至第10列，每孔分别加入100U1.2倍终浓度工作液（本标准第6.2.2条制备）.然后每孔加入1001.2倍终浓度的菌悬液，最终接种量为0.5X103cFU/m1.2.5xlO。CFUm1.1,6.2.4培养对于微量肉汤稀释法，念珠菌及新型隐球菌培养温度均为35,所有抗真菌药物的质控范围基于培养24ho对于念珠菌，棘白菌素类、两性霉素B、氟康嗖、叙胞嗦咤、伊曲康喋、艾沙康理、泊沙康嘎、雷夫康嘎和伏立康嘎的MIC值应在24h读取结果。如果24h生长

22、对照显示生长不足，表D.1中折点也可用于培养48h结果判读。上述所有抗真菌药物对于隐球菌属的MIC值应在培养72h读取结果。7结果判读与解释1. 1.1评分标准宏量肉汤稀释法质控菌株的参考范围见表B.1,微量肉汤稀释法质控菌株的参考范围见表B.2。质控结果合格再进行检测菌株的结果判读。判读结果时，将各浓度管内的真菌生长情况与生长对照管（无抗真菌药物）比较，通过评分得出MlC值，评分标准：一一。完全清亮；轻微模糊：2浊度显著降低（Q50%）;3浊度轻微降低；浊度没有变化。2. 1.2两性霉素B生长终点判断标准为100%抑制（评分为0,完全清亮）。MIC值为抑制生长最低抗菌浓度，终点拖尾生长不常见

23、。3. 1.3氟胞唯咤和唯咯类氟胞唯噬和哦咯类抗真菌药物有拖尾生长现象，生长终点判断标准为50与抑制（评分为2,浊度显著降低）。白念珠菌和热带念珠菌对此咯类特别是氟康理和伏立康噗存在显著的拖尾生长现象，这些分离株对通常用于治疗敏感分离株的低剂量氟康嚏有反应。4. 1.4棘白菌素类棘白菌素类抗真菌药物有拖尾生长，生长终点判读标准为50%抑制（评分为2,浊度显著降低）。7. 2结果解释8. 2.1折点/ECV解释结果折点/ECV解释结果汇总见表C.1。与折点不同，ECV不能预测治疗的临床反应。当评估的真菌种类和抗真菌药物存在折点时，不应在临床实践中使用ECV。9. 2.2有折点的念珠菌属仅有一些真

24、菌-药物组合建立了折点，念珠菌属折点见表D.1。10. 2.3有折点和ECV的念珠菌属与折点不同，ECV值不能预测临床治疗效果。对于既有折点又有ECV的念珠菌属（见表D.2）,ECV不能预测治疗的临床反应。当评估的真菌种类和抗真菌药物存在折点时，不应在临床实践中使用ECV。11. 2.4暂定折点的耳念珠菌耳念珠菌通常具有耐多药性，但各分离株的耐药性差异很大。目前尚无确定耳念珠菌的特异性药敏折点，只有根据专家意见的暂定折点，折点和临床结果之间的相关性目前尚不清楚，暂定折点和说明（见表D.3）作为参考而非明确的耐药折点。患者使用其他抗真菌药物无效的情况下，即使某抗真菌药物的Mle值升高，临床也可能

25、会使用。7.2.5无折点的念珠菌属其他真菌-药物组合的检测临床相关性仍不确定，对于无折点的念珠菌属，ECV定义了常见念珠菌野生型的分布界值，两性霉素B可能对区分野生型和非野生型的分离株有用。无折点的念珠菌属ECV值见表D.4三7.2.6无折点的隐球菌属无折点的降球菌属ECV值是针对不同分子类型确定的，隐球菌分类目前处于过渡阶段。VGl和VGIl分别是格特隐球菌和Deuterogattii隐球菌（以前称格特隐球菌）的分子基因型，只有通过聚合的链式反应或基于DNA测序等分子分型方法进行识别。VNl是全球范围新型隐球菌最常见的分子基因型。隐球菌属分子分型ECV值见表D.5o7.3抗真菌药物结果解释7

26、.3.1两性霉素B肉汤稀释参考方法检测念珠菌属分离株对两性霉素B的MIC值在0.25Ugm1.lgm1.处显示有紧凑的聚集，使用商品化方法可能会提供更准确的体外MlC结果解读。无折点念珠菌属的两性霉素B的EeV值见表D.2。7.3.2氟胞嗑咤之前的C1.Sl折点不再使用。无折点念珠菌属的氟胞嗑噬ECV值见表D.2。7.3.3氟康嗖已建立氟康哇对白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌的种特异性折点见表D.1,但这些新折点不适用于克柔念珠菌。菌株应鉴定到种水平，才能准确解释和报告MlC结果。当分离株鉴定为光滑念珠菌且MICW32gm1.,患者应接受最大剂量的氟康嗖治疗，具体用药咨询临床用药

27、专家。新型隐球菌分离株的检测应用尚不清楚，研究表明升高的MlC与临床治疗失败呈相关性。7.3.4伊曲康理C1.SI过去发布的伊曲康陛折点是基于较少的临床数据，这些折点不再使用。无折点念珠菌属的伊曲康哇ECV值，见表D.2。7.3.5伏立康理已建立伏立康嚏对白念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌的折点见表D.1。这些数据主要来自念珠菌血症（非中性粒细胞减少症）患者的临床试验，其他情况下的临床相关折点尚不确定。7.3.6泊沙康理、雷夫康理、艾沙康理泊沙康喋和雷夫康噪肉汤稀释参考方法检测念珠菌属和隐球菌属的Mle从0.03gm1.-16gm1.,大部分菌株可被MIClgm1.的抗真菌药物抑制

28、。艾沙康嚏对酵母样真菌的MlC范围在0.008gm1.-8gm1.,90%菌株MIC0.5gm1.ECV值参考见表D.2。数据不能提示MlC和这些药物治疗的相关性。7.3.7棘白菌素（阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净）棘白菌素肉汤稀释法参考方法检测2500例念珠菌属MlC范围0.008ugm1.8gm1.,99%菌株的MlCW2g/m1.o念珠菌属对棘白菌素的耐药机制为fks突变，在MI（X2Ug/m1.敏感范围内存在分离株隐含fks突变。已建立不同种的念珠菌的折点，见表D.1,可区分潜在的耐药突变菌株和敏感性菌株。已建立无折点的念珠菌属对阿尼芬净和米卡芬净的EeV值（表D.2）,可用于区分WT和

29、NWT分离株。卡泊芬净药敏试验结果在实验室间存在显著差异，可导致报告假耐药，造成这种差异的原因不明，尚无ECV发布。7.3.8EUCAST折点/ECOFF结果解释EUCAST微量肉汤稀释法24h质控菌株MlC范围见表E.1;念珠菌体外微量肉汤稀释法24hMIC折点见表E2有折点的念珠菌属的ECOFF值见表E.3;有折点的隐球菌属的ECoFF值见表E.4。EUCAST折点/ECOFF普遍稍低于C1.Sl的折点/ECV,仅供参考。7.4结果报告7.4.1按C1.SI药敏方法检测的结果报告C1.Sl药敏方法检测酵母样真菌包括3种类型：a）有MIC判断折点（念珠菌MIC折点见表D.1）,报告MlC值及

30、敏感度；b）无MIC判断折点但有ECV值，见表D.2和表D.4,报告MIC值；如果MIC值低于或等于ECV值报告为野生型，并说明该菌株无获得性耐药机制或无敏感性降低：如果MlC值高于ECV值报告为非野生型，并说明该菌株具有推测的/已知获得性耐药机制或敏感性降低；并明确ECV不是折点，不能预测临床治疗效果；c）无MlC判断折点且无ECV值：只报告MIC值并说明目前该酵母样真菌的临床折点尚未建立。7.4.2按EUCAST药敏方法检测的结果报告按附录E的试验条件进行微量肉汤稀释试验并同时做质控，结果报告包括2种类型：a） 有MlC判断折点（含念珠菌对两性霉素B、伊曲康陛和泊沙康理折点）见表E.2,报

31、告MIC值及敏感度；b） 无MIC判断折点但有ECOFF值，见表E.3和表E.4,报告MlC值；如果MlC值低于或等于ECOFF值报告为野生型，并说明该菌株无获得性耐药机制或无敏感性降低；如果MIC值高于EeOFF值报告为非野生型，并说明该菌株具有推测的/已知获得性耐药机制或敏感性降低：并明确EeoFF值不是折点，不能预测临床治疗效果。8质量控制8.1 目的为了保证实验人员操作和读取结果的正确性，应对试剂、试验条件等同时进行质量控制。质量控制的可监控：药敏试验的精度（可重复性）及准确性，试验中使用试剂的性能、条件及说明，测试和读取结果人员的表现。8.2 培养基和材料的质控当使用新批次的培养基、

32、培养皿或RPMl-1640肉汤培养基以及微量稀释96孔板、宏量稀释管时应使用表B中列出质控菌株进行药敏试验，检测MIC是否在控。应至少培养一支未接种菌悬液稀释管，检测是否无菌。并记录试验使用材料的批号。8.3 纯度质控药敏试验后将待测菌的接种液转种于相应平板并分区划线，确认接种菌液的纯度。8.4 终点判读质控应定期进行终点判读质控，以尽量减少实验人员之间的MIC判读差异。伊曲康理和其他三喋类药物适合用于比对试验，并用已确定MIC的质控菌株和参考菌株进行终点判读质控。实验人员应在相同条件下独立判读结果，并与操作熟练人员的结果比对。8.5 参考菌株的保存8.5.1 菌种的保存方法在菌种的保存过程中

33、，应尽可能保持其稳定性，减少突变。应将酵母样真菌在马铃瞽葡萄糖培养基生长后，于-70C冻存。用15%甘油制成菌悬液或保存在真菌冻存管中-70C冻存。若长期保存，应检查菌株是否为纯培养，然后制备菌悬液。将菌悬液分装在冻存管内，-70C或使用液氮冻存。复苏长期保存的酵母样真菌质控菌株，在沙保罗培养基或马铃薯葡萄糖培养基上35C生长ld3d,挑选菌落进行药敏试验。若MlC值在质控范围之内（见表B）,继续传代培养直至生长良好。若短期使用，可在沙保罗培养基或马铃薯葡萄糖培养基培养后2C8C保存，每两周进行一次传代，保证菌的活性和纯度。8.5.3 日常使用质控菌株的复苏从-70C或液氮中取出冻存管，待室温

34、融化后，转种于马铃薯葡萄糖培养基，于35C培养（念珠菌属24h,新型隐球菌48h）。挑选菌落于马铃薯葡萄糖培养基传代培养两次，培养物于斜面298保存，用于日常质控。附录A（资料性）RPMI-1640肉汤培养基配制方法用商品化RPMI1640肉汤干粉配制I1.RPMI/640肉汤培养基步骤见表A.1,若无肉汤干粉，配制RPMI-164。肉汤培养基配方见表A.2,含2%葡萄糖改良RPMI-1640肉汤培养基配方见表A3,0.5麦氏单位硫酸钏浊度标准管制备见表A.4。表A.lRPMI1640肉汤培养基配制过程（11.）步骤过程110.4gRPMlT640肉汤干粉，34.53gMOPS,溶解于900m

35、1.蒸储水2加入MOPS（终浓度为0.165mo1.）,搅拌至溶解3使用1mol/1.氢氧化钠调节PH至7.0（25C）4补水至I1.5过滤消毒储存在4备用MoPS表示3-(N-吗啡咻)丙磺酸(3-N-niorpholinopropanesulfonicacid)o表A.2RPMI-1640肉汤培养基配方表（含谷氨酰胺和酚红，不含碳酸氢盐）组分g/1.水组分g/1.水组分g/1.水1.-精氨酸（游离碱）0.2001.-苯丙氨酸0.015核黄素0.0002无水1.-天冬酰胺0.0501.-脯氨酸0.020盐酸硫胺素0.0011.-天冬氨酸0.0201.-丝氨酸0.030维生素B120.00000

36、51.-胱氨酸二盐酸0.06521.-苏氨酸0.020硝酸钙.HO0.1001.-谷氨酸0.0201.-色氨酸0.005氯化钾0.4001.-谷氨酰胺0.3001.-酪氨酸一钠盐0.02883无水硫酸镁0.04884甘氨酸0.0101.-缀氨酸0.020氯化钠6.0001.-组氨酸（游离碱）0.015生物素0.0002无水磷酸氢二钠0.8001.-羟肺氨酸0.020D-泛酸钙0.00025D-葡萄糖2.0001.-异亮氨酸0.050氯化胆碱0.003谷胱甘肽0.0011.-亮氨酸0.050叶酸0.001酚红钠盐0.00531.-赖氨酸盐酸盐0.040肌醉0.035对氨基苯甲酸0.0011.-蛋

37、氨酸0.015烟酰胺0.001盐酸毗哆醇0.001表A.3含2%葡萄糖改良RPMl-1640肉汤培养基配制表组分1倍浓度2倍浓度蒸馀水900m1.900m1.RPMIT640干粉10.4g20.8gMOPS34.53g69.06g葡萄糖18g36g表A.40.5麦氏单位硫酸钢浊度标准管制备步骤步腺过程199.5m1.0.18mol/1.HSO;(l%vv)中加入0.5m1.0.048InoI/1.氯化领2使用分光光度计调节浊度，在625nm波长吸光度应在0.080.13之间3将4m1.6m1.液体分装在螺旋管中4室温密封避光储存5使用前将螺旋管内液体混匀6每3个月校准一次浊度附录B(规范性)肉

38、汤稀释法质控菌株MlC范围宏量肉汤稀释法质控菌株MlC范围见表B.1,微量肉汤稀释法质控菌株MlC范围见表B.2。表B.1宏量肉汤稀释法质控菌株MIC范围(gm1.,48h)标准菌株”名称目的药物名称MlCS范围MICS在范围内比例%克柔念珠菌ATCC6258质控菌株”两性霉素B0.252.099.5氟康晚16-6499.1械胞喀咤4.01696.8伊曲康嗖0.12-0.594.0酮康噗0.120.5100近平滑念珠菌ATCC22019质控菌株两性霉素B0.25199.1氟康啜2.08.099.1氟胞喀噬0.12-0.598.6伊曲康理0.06-0.2599.0酮康喋0.06-0.2599.0

39、白念珠菌ATCC90028参考菌株两性寄素B0.52.091.9氟康喋0.257.097.3械胞喀咤0.52.095.0白念珠菌ATCC24433参考菌株两性霉素B0.251.099.5氟康嗖0.251.095.9氟胞喳噬1.04.091.9近平滑念珠菌TCC90018参考菌株两性霉素B0.52.096.4氨康建0.251.098.2氟胞喘咤0.12-0.2599.5热带念珠菌ATCC750参考菌株两性霉素B0.52.093.7氟康嗖1.0-4.095.5叙胞唯咤0.12-0.2599.5注1:ATCe,美国菌利保藏中心。“标准菌株：由菌种保藏机构保藏的、有且仅有永久保藏号、遗传学特性得到确认

40、和保证并可追溯的菌株。质控菌株：用于质控目的的标准菌株或参考菌株。参考菌株：经参考实验室或权威机构鉴定的菌株，或由能力验证/室间质评发放的菌株，可用于仪器、试剂和方法学性能验证或部分质控对照的菌株。表B.2微黄肉汤稀释法质控菌株MIC范围（ugm1.加h和48h）菌株名称抗真菌药物MIC范围24h中位数在范围内比例%MIC范围48h中位数在范围内比例%两性霉素B0.521100142100阿尼芬净0.03-0.120.0697.90.03-0.120.0697.5卡泊芬净*0.1270.598.80.2510.597.5氟康理864161001612832100叙胞嗜咤416897.58321

41、699.6方冬令玻黄艾瑞芬净0.2510.5100Bc11co艾沙康理0.06-0.50.2595.20.12-0.50.1294.2伊曲康一0.12-10.595.80.25-10.5100酮康理0.12-10.595.40.25-10.599.6米卡芬净0.060.250.120.2599.60.120.50.2599.0泊沙康理0.060.50.251000.1210.599.6瑞扎芬净0.016-0.120.031000.016-0.120.03100伏立康哇0.060.50.1298.30.1210.5100近平滑念珠菌两性霉素B0.2520.597.10.54291.7阿尼芬净0.

42、2521950.52195卡泊芬净0.25-10.596.70.54192.9籁康理0.54298.214298.1籁胞喀咤0.06-0.250.1299.20.12-0.50.2597.9艾瑞芬净0.06-0.250.1299.0艾沙康理0.016-0.060.0690.50.03-0.120.0398.3ATCC22019伊曲康理0.060.50.2595.80.120.50.2597.5酮康理0.03-0.250.06/0.1297.50.06-0.50.1298.3Manogepix0.008-0.030.0151000.008-0.030.01694.3米卡芬净0.520.5l100

43、0.541100泊沙康嗖0.03-0.250.1296.70.060.250.1298.8瑞扎芬净0.25-20.599.20.2521100伏立康喋0.016-0.120.016-0.031000.03-0.250.06100表B.2微量肉汤稀释法质控菌株MlC范围（ugm1.,24h和48h）（续）菌株名称抗真菌药物MIC范围24h中位数在范围内比例%MIC范围48h中位数在范围内比例%注1：阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净的MlC值在孵育24h以后观察评分为2的最低抑菌浓度（与生长对照相比浊度显著降低，或生长的抑制率大于50%）。注2:当商用检验系统用于敏感性试验时，用户应参考生产厂家的使用说明的质控范围。注3:ATCC美国菌种保藏中心。1质控范围是根据2010年15个参考实验室的数据建立的。从那时起，卡泊芬净的药敏试验与显著的变异相关。因此,尽管根据表中所列的范围质控菌株的性能可以接受，但敏感菌株仍可能发生错误分类。附录C（规范性）酵母样真菌药敏试验可用的折点和/或ECV汇总表酵母样真菌可用的折点和/或ECV值汇总见表Cl。表Cj酵母样真菌药