WS-T411-2024抗丝状真菌药物敏感性试验标准 肉汤稀释法.docx

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1、ICS11.020CCSC50WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T4112024代替WS/T4112013抗丝状真菌药物敏感性试验标准肉汤稀释法StandardsforantifungalsusceptibilitytestingoffilamentousfungiBrothdilutionmethod2024-04-02发布2024-09-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发布目次前言H1范围12规范性引用文件13术语和定义14抗真菌药物的配制25培养基的配制66肉汤稀释法操作步骤67结果判读与解释88质量控制10附录A（资料性）RPMlT640干粉肉汤培养基配制方法12附录B（规范

2、性）肉汤稀释法质控菌株MlC范围14附录C（规范性）体外微量肉汤稀释法MIC折点14附录D（规范性）丝状真菌ECV值汇总表16附录E（规范性）EUCAST微量肉汤稀释法质控范围、折点和ECOFF值19参考文献22本标准为推荐性标准。本标准代替WS/T411-2013抗丝状真菌药物敏感性试验一肉汤稀释法，与WS/T411-2013相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术内容变化如下：范围明确了不适合本行标的真菌种类（见1）;增加了术语和定义中“最低有效浓度”、“流行病学界值”、“野生型”、“非野生型”和“拖尾生长”（见3.2、3.8、3.9、3.10、3.12）;抗真菌药物储存液使用的溶剂、稀释

3、液和检测范围表格分为非皮肤真菌和皮肤真菌，增加了艾莎康理、阿尼芬净、环毗酮、灰黄霉素、特比奈芬（见4.4.1）;结果解释内容，按C1.SI（Clinicaland1.aboratoryStandardInstitute）折点和流行病学界值（C1.Sl表述：epidemiologicalcutoffVaIUe,ECV）解释结果；增力口了EUCAST（TheEUroPeanCommitteeonAntimicrobialSusceptibilityTeSting）折点和流行病学界值（EUCAST表述：epidemiologicalcutoff,ECOFF）结果解释，并在附录E列出试验条件、质控范围

4、、折点、ECoFF值等表格（见7.2、附录E）;一增加了结果报告方式，C1.SI及EUCAST两种药敏方法相应的报告结果方式（见7.3）;质量控制部分删除了质控频率和检测频率内容，增加：D按培养基和材料质控、纯度质控、终点判读质控描述；2）日常使用质控菌株的复苏方法（见2013年版的7.5,见8.2、8.3、8.5.2）;一更改了附录A为相关培养基配制表格，附录B为质控菌株MlC范围，附录C为烟曲霉对伏立康嗖的MlC折点，附录D为丝状真菌ECV值汇总表等（见附录A、附录B、附录C、附录D,见2013年版的附录A、附录B、附录C、附录D）。本标准由国家卫生健康标准委员会临床检验标准专业委员会负责

5、技术审查和技术咨询，由国家卫生健康委医疗管理服务指导中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委员会医政司负责业务管理、法规司负责统筹管理。本标准起草单位：北京医院/国家卫生健康委临床检验中心、中国医学科学院北京协和医院、首都医科大学附属北京友谊医院、北京大学人民医院、北京大学第一医院、首都医科大学附属北京同仁医院、复旦大学附属华山医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院。本文件主要起草人：胡继红、徐英春、苏建荣、胡云建、王辉、李若瑜、鲁辛辛、章强强、孙自铺、艾效曼。本标准于2013年首次发布，本次为第一次修订。抗丝状真菌药物敏感性试验标准肉汤稀释法1范围本标准规定了微量和宏量肉汤稀释法检测抗丝

6、状真菌药物最低抑菌浓度(MinimaIInhibitoryConcentration,MIC)的参考方法。本标准适用于引起深部真菌感染的产抱丝状真菌的药物敏感性试验，包括曲霉属某些种(Aspergillusspp.)及种复合群、镰刀菌属某些种(FlISariUmspp.)及种复合群、根霉属某些种(Rhizopusspp.)和毛霉目MUCOraIeS(接合菌纲ZygomYCeles)、多育节荚抱霉(1.Omenu)SPOraprolificans,原多育赛多泡霉(ScedosponumPrOlifiCanS)和申克胞子丝菌复合群的菌丝相,以及引起皮肤真菌感染的毛癣菌属某些种(TriChoPhyt

7、onSPP.)、小狗子菌属某些种(Microsporumspp.)和表皮癣菌属某些种(EPidermOPhytOnspp.)。本标准不适用于检测双相真菌如皮炎芽生菌(BlaStomyCeSdermatitidis)英膜组织胞浆菌(HistoplasmaCapsulatum)粗球电子菌属(CoCeidioideSspp.)马尔尼菲篮状菌(Talaromycesmameffei)及酵母样真菌的药敏试验，也不适用于检测棘白菌素类对皮肤真菌以及环毗酮、灰黄霉素或特比蔡芬类对非皮肤真菌的药敏试验。2规范性引用文件本标准没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1最低抑菌浓度mini

8、malinhibitoryconcentration;MIC肉汤稀释法中，抗真菌药物能抑制微生物生长的最低浓度。3.2最低有效浓度minimaleffectiveconcentration;MEC在最低浓度抗菌药物作用下，与生长对照孔菌丝浑浊生长相比，引起菌丝呈小而圆菌落、非融合生长变化的最低药物浓度。本定义目前仅用于棘白菌素类抗真菌药。3.3折点breakpoint用于区分菌株为敏感、中介、耐药的最低抑菌浓度(MIC)3.4解释性分类interpretivecategory结果解释分类基于可获得的微生物特性、药代动力学-药效学(PK/PD)参数和临床疗效结果数据。根据建立的折点将药敏结果进行

9、敏感、中介、耐药解释分类。3.5敏感susceptible;S此浓度的抗真菌药物在体外试验中能抑制真菌生长，当使用推荐剂量时，可能获得良好的临床疗效。3.6中介intermediate菌株的MIC通常可达到常规用药时血液和组织中的药物浓度水平，但反应率可能低于敏感株，不能明确划分为“敏感”或“耐药”。在体外可抑制真菌的生长，但不能确定此浓度的临床疗效。药物在机体生理浓集部位或可用高于正常剂量的药物进行治疗以获得临床疗效。还可作为检测方法固有变异的缓冲区，以防止微小的、不可控的技术因素导致较严重的错误结果，特别是那些毒性范围窄的药物。3.7耐药resistant;R当使用推荐剂量时，临床治疗很可

10、能失败。3.8流行病学界值epidemiologicalcutoffvalue;ECV/epidemiologicalcutoff;ECOFF基于菌株MIC值，将微生物群归类为是否含有获得性耐药和/或突变耐药表型的两个群体（野生型和非野生型）。ECV定义了菌株野生型生物群药物敏感性的上限值（MIC最大值）。3.9野生型wiId-type;WT通过ECV值定义的解释分类，ECV将分离菌株归类为对某种检测的抗真菌药物无获得性耐药机制或无敏感性降低的生物型。3.10非野生型non-jwiId-type;NWT通过ECV值定义的解释分类，ECV将分离菌株归类为对某种检测的抗真菌药物具有推测的/已知获得

11、性耐药机制或敏感性降低的生物型。3.11效价potency抗菌药物中具有抗菌活性的组分，其有效含量通过同类标准物质测定得出，单位通常用mg/g、gmgIUg,或用百分比表示。3.12拖尾生长trailgrowth在结果读取时间内，随着培养时间的延长，在一定药物浓度范围内菌量减少但仍少量持续生长的现象。3.13质量控制QualityControliQC为保证检测的准确性和可重复性而采取的方法或技术。4抗真菌药物的配制4.1抗真菌药物标准品或参考品抗真菌药物使用标准品或参考品。使用有效期内的标准品或参考品，按说明书推荐的条件下储存。当把药物从低温环境中取出时，需恢复到室温后再开瓶。4.2称药物可使

12、用式（1）、式（2）计算药物重量及稀释液体积：WS/T4112024t（2）式中：m药物的重量，单位为亳克（mg）;P药物的浓度，单位为微克每亳升（gm1.）;T药物的效价，单位为微克每毫克（Ugmg）;V药物的浓度，单位为毫升（m1.）。4.3药物储存液（母液）4.3.1药物称量药物称量按照配制储存液的浓度计算，配制储存液浓度至少按检测范围最高浓度的100倍配制储存液。但有些溶解度低的药物应配制较低浓度的储存液。称量应在分析天平上进行，天平应定期校准。4.3.2溶剂溶解时，一些药物需使用非水溶剂溶解，溶剂的信息可参考厂家说明书。溶剂（分析纯）包括：二甲基亚飒（DMSO）、乙醇、聚乙二醇和按甲

13、基纤维素。4.3.3过滤储存液通常是无菌的，当有特殊要求时应进行无菌膜过滤（过滤细菌常用孔径为02um,但应避免使用纸张、石棉和玻璃滤器等具有吸附抗真菌药物的材质。4. 3.4存储储存液应在无菌塑料管中分装，密封保存于-70C（或-20C-70C）o从冰箱中取出的当天使用，现用现取，未用完的应丢弃。大多数药物储存液在-70C可保存6个月。4.4药物稀释液4.4.1 药物稀释液浓度范围药物稀释液及药物浓度检测范围见表1。表1抗真菌药物储存液使用的溶剂、稀释液种类及药物浓度检测范围抗真菌药物溶剂*稀释液浓度范围Ug/m1.抗非皮肤真菌药物两性霉素BDMSOo培养基0.0313-16艾沙康哇DMSO

14、培养基0.0313-16伊曲康哇DMSO培养基0.0313-16酮康建DMSO培养基0.0313-16泊沙康哇DMSO培养基O.031316伏立康嘎DMSO培养基0.0313-16氟康哇DMSO培养基0.125-64氟胞喀咤DMSO培养基0.12564卡泊芬净DMSO培养基0.008-4表1抗真菌药物储存液使用的溶剂、稀释液种类及药物浓度检测范围(续)抗真菌药物溶剂“稀释液浓度范围ug/m1.抗非皮肤真菌药物阿尼芬净DMSO培养基0.0084米卡芬净DMSO培养基0.008-4抗皮肤真菌药物环毗酮DMSO培养基0.06-32灰黄霉素DMSO培养基0.125-64筑康理DMSO培养基0.125-

15、64伊曲康建DMSO培养基0.0010.5伏立康啜DMSO培养基0.001-0.5特比蔡芬DMSO培养基0.0010.5泊沙康嗖DMSO培养基0.0048某些溶剂存在潜在毒性，使用前应咨询厂家。DMSo指二甲基亚碉。培养基指RPMIT640肉汤培养基，如使用商品化RPVl-1640肉汤干粉配制，步躲见表A.1.4.4.2 水溶性药物稀释液对于溶于水的抗真菌药物，直接用肉汤1:50稀释。当进行小样本量检测时推荐使用表2的稀释步骤。表2水溶性抗丝状真菌药物敏感试验稀释步骤(小样本量皮肤真菌)配制步骤浓度(gm1.)来源体积+(m1.)培养基=(m1.)中间浓度=(Ugm1.)1:5稀释后浓度(Ug

16、m1.)”5120储存液1.07.06401282640步骤11.01.0320643640步骤11.03.0160324160步躲31.01.080165160步骤30.51.54086160步骤30.53.5204720步骤61.01.0102820步骤60.51.551920步骤60.53.52.50.5102.5步臊91.01.01.250.25112.5步骤90.51.50.6250.1254配制步骤浓度(Pgm1.)来源体积+(m1.)培养基=(In1.)中间浓度=(ugm1.)1:5稀释后浓度”(Ugm1.)122.5步骤90.53.50.31250.0625表2水溶性抗丝状真菌

17、药物敏感试验稀释步骤(小样本量皮肤真菌)(续)配制步骤浓度(ugm1.)来源体积+(In1.)培养基=(m1.)中间浓度=(Ugm1.)1:5稀释后浓度”(ugm1.)表示2倍终浓度。配制步骤1举例，取5120Pg/m1.的储存液1.Om1.,加入7.0m1.培养基，得到中间浓度为640gm1.,作为步骤2的初始浓度，取1.0m1.,加入1.0m1.培养基，得到中间浓度320ugm1.,以此类推：宏量肉汤稀释法取0.1m1.中间浓度液与10倍浓度接种菌悬液充分混合得到最终药物浓度(终浓度)。4. 4.3非水溶性药物稀释液对于非水溶性药物需要先用合适的溶剂配制成终浓度100倍的储存液，然后再用肉

18、汤1:50稀释，针对非皮肤来源真菌标本的药物稀释步骤见表3,针对皮肤来源真菌标本的药物稀释步骤见表4。表3非水溶性抗丝状真菌药物敏感试验稀释步骤(非皮肤真菌)配制步骤浓度(Pgm1.)来源体积+(ml)溶剂=如DMS0(m1.)中间浓度=(Pgm1.)1:50稀释后浓度(Ugm1.)11600储存液16003221600储存液0.50.58001631600储存液0.51.540084”1600储存液0.53.520045200步骤40.50.510026200步骤40.51.55017200步骤40.53.5250.5825步骤70.50.512.50.25925步骤70.51.56.250

19、.1251025步骤70.53.53.130.0625113.13步骤100.50.51.560.0313123.13步骤100.51.50.780.0156DMSo指二甲基亚碉1.配制步骤4举例，取1600gm1.的储存液0.5m1.,加入3.5In1.溶剂，得到中间浓度为200gm1.,作为步骤5的初始浓度，取0.5m1.,加入0.5ml,溶剂，得到中间浓度100口g/ml”以此类推；宏量肉汤稀释法取0.1m1.中间浓度液与10倍浓度接种菌悬液充分混合得到最终药物浓度(终浓度)。表4非水溶性抗丝状真菌药物敏感试验稀释步骤(皮肤真菌)配制步骤浓度(Ugm1.)来源体积+(m1.)溶剂=如DM

20、S0(ml.)中间浓度=(Pgm1.)1:50稀释后浓度(Ugm1.)16400储存液一一640012826400储存液0.50.5320064配制步骤浓度(Ugm1.)来源体积+(m1.)溶剂=如DMS(T(m1.)中间浓度=(Ugm1.)1:50稀释后浓度(Mgm1.)36400储存液0.51.516003246400储存液0.53.580016表4非水溶性抗丝状真菌药物敏感试验稀释步骤(皮肤真菌)(续)配制步骤浓度(gm1.)来源体积+(m1.)溶剂=如DMSo4(m1.)中间浓度=(Pgm1.)1:50稀释后浓度(Pgm1.)5800步骤40.50.540086800步骤40.51.5

21、20047800步骤40.53.510028100步骤70.50.55019100步骤70.51.5250.510100步骤70.53.512.50.251112.5步骤100.50.56.250.1251212.5步骤100.51.53.130.06251312.5步骤100.53.51.560.0313141.56步骤130.50.50.780.0156151.56步骤130.51.50.390.0078161.56步骤130.53.50.1950.0039170.195步骤160.50.50.09750.0019DvSo指二甲基亚碉。配制步骤2举例，取6400ug/m1.的储存液0.5m

22、1.,加入0.5m1.溶剂，得到中间浓度为3200Ugm1.,步骤3取6400gm1.的储存液0.5m1.,加入1.5m1.溶剂，得到中间浓度1600gm1.,以此类推；宏量肉汤稀释法取0.1m1.中间浓度液与10倍浓度接种菌悬液充分混合得到最终药物浓度(终浓度)。5培养基的配制4.1 RPMI-1640干粉肉汤培养基的配制推荐使用RPMl-1640肉汤培养基(配制方法见表A.1),若无商品化RPMI-1640干粉培养基，配方见表A.2。5. 2含2%葡萄糖的RPMI-1640肉汤培养基微量肉汤稀释法推荐使用葡萄糖含量为2%的RPMl-1640肉汤培养基，配方见表A.3。6肉汤稀释法操作步骤5

23、.1 微量肉汤稀释法操作步骤5.1.1 菌悬液的制备5.1.1.1 非皮肤真菌应在II型生物安全柜中完成接种和菌悬液的配制等操作。在丝状真菌的药敏操作过程中，应防止对标本、实验室环境和工作人员造成污染2|。大多数真菌可在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上经35C培养7d后接种或直至获得生长良好的抱子；毛霉目、曲霉属及种复合群经48h培养后可获得抱子；镶刀菌属及种复合群在35C培养48h72h后，再转入25C28C培养至7d,一些在PDA上不能产泡或产抱不良的丝状真菌，可以更换更好的适宜产范的培养基培养。在1m1.0.85%无菌盐水含终浓度为0.1%（vv）的吐温20中加入丝状真菌菌落混匀，若有沉淀

24、物应静置3min-5min。将上清转移至无菌试管中，密封后混匀15S0采用比浊法测定菌悬液浓度，在530nm波长时的吸光度分别为：曲客属及种复合群、皮炎外瓶霉、淡紫紫抱霉、宛氏拟青霉、申克抱子丝菌复合群OD值0.090.13;镰刀菌属及种复合群、斑替枝抱瓶霉、奔马赭毒、多育节荚抱霉、根霉属及其他毛霉目OD值0.150.17;离蠕他属和链格抱属OD值0.250.3。然后用肉汤培养基进行1:50稀释，如果检测菌株为申克胞子丝菌，则1:2倍稀释。将接种物稀释至0.8104CFUZm1.（菌落形成单位m1.）IoXlO，cFU/m1.（终浓度的2倍）。最后将0.1m1.菌悬液加入微孔中。5.1.1.2

25、 皮肤真菌大多数皮肤真菌在马铃薯葡萄糖培养基上生长良好。但红色毛癣菌需使用燕麦琼脂（见表A.4）经35C培养4d5d或直至获得生长良好的抱子。用1m1.0.85%无菌盐水制备菌悬液，使用血细胞计数器计数，得到菌悬液浓度为2倍接种终浓度（l103CFUZm1.-3IO3CFUm1.）。5.1.2 接种物稀释液的定量5.1.2.1 非皮肤真菌将0.01m1.l:10稀释的菌悬液接种在沙保罗培养基（SabouraudDextroseAganSDA）,计数菌落形成单位（CFU/m1.）。28C30C培养并每Fl观察计数。培养时间从少于24h（根霉属）到5d（多育节荚抱霉）不等。6. 1.2.2皮肤真菌

26、将0.0Im1.菌悬液接种在沙保罗培养基（SDA）上，计数菌落形成单位（CFUm1.）。28C30C培养并每日观察计数。培养时间为1d7d.6.1.3 接种检测当日，将0.1m1.2倍终浓度的菌悬液加入微孔中，并加入0.1m1.2倍终浓度的药物稀释溶剂。对照管中加入0.1m1.2倍终浓度的菌悬液和0.1-m1.肉汤培养基。6.1.4 培养推荐在35C条件下培养，培养过程中避免震摇试管，并观察是否存在可见生长。6.1.4.1非皮肤真菌培养某些非皮肤真菌在30C而非35培养才能生长。不同的抗真菌药物培养时间不同：非棘白菌素类，根霉属和毛霉目培养时间为21h26h,曲霉属及种复合群、镰刀菌属及种复合

27、群、中克胞子丝菌复合群、斑替枝胞瓶霉、皮炎外瓶霉、淡紫紫单胞菌、宛氏拟青霉培养时间为46h50h,多育节荚施霉培养时间为70h74h;棘白菌素类，曲霉属及种复合群、宛氏拟青霉培养时间为21h26h,多育节荚刑霉培养时间为46h72ho6.1.4. 2皮肤真菌培养皮肤真菌的MlCS值应在培养4d后判读。6.2宏量肉汤稀释法操作步骤6. 2.1药物稀释液按照本标准第4.2条和第4.3条配制药物储存液。然后用RPMl-1640肉汤将储存液1:10稀释，得到10倍终浓度的稀释液。7. 2.2菌悬液制备按照本标准第5.1.l条方法制备菌悬液。涡旋震荡混匀15s后，用肉汤培养基按1:100稀释得到终浓度0

28、.4X10*CFUm1.-5104CFU/m1.的菌悬液。6.2.3接种和培养将0.1m1.10倍终浓度的药物稀释液分装在无菌试管中，然后加入0.9m1.菌悬液，35C培养。7结果判读与解释7.1 MIC和MEC值的结果判读宏量和微量肉汤稀释法质控菌株的结果范围参考见表B.1。7.1.1 一般情况判读结果时通过与生长对照孔比较，观察生长抑制情况确定MlC值，烟曲霉体外微量肉汤稀释法MlC折点见表C.1。对于棘白菌素类抗真菌药物使用MEC结果，报告时应注明。7.1.2 两性霉素B生长终点判断标准为100%抑制。MIC值为抑制生长最低抑菌浓度，终点拖尾生长不常见。若出现拖尾现象，常表示有临床相关的

29、耐药存在。7.1.3 氟胞嗒口定、氟康嘤、酮康嗖氟胞嘴咤、氟康理、酮康理生长终点定义不如两性霉素B严格，与生长对照孔相比，非皮肤真菌生长抑制50%以上、皮肤真菌生长抑制80席以上判断为终点。7.1.4 伊曲康理、泊沙康理、艾莎康嗖、伏立康理对于非皮肤真菌，伊曲康喋、泊沙康理、艾莎康噗和伏立康哇终点定义为100%抑制生长。曲霉属和其它多数非皮肤条件致病霉菌终点拖尾生长不常见，这种情况可能反映临床相关的抗真菌药物耐药性。当检测皮肤真菌对伏立康嘎、泊沙康理、伊曲康喋的MlC时，终点定义为抑制80%以上的生长。7.1.5 棘白菌素类虽然对棘白菌素类药物如阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净生长终点定义不如两性

30、霉素B确定，但是应用MEC生长终点的概念，提高了试验的可重复性。通过与生长对照孔的浑浊生长比较，微孔液面的菌落呈非融合生长状态的最低有效浓度为MEC如果MEC生长终点不易判读，可通过显微镜下观察菌丝发生小而圆并紧缩生长的最低浓度判读为MEC。7.1.6 环唯酮、灰黄霉素、特比蔡芬对于皮肤癣菌，环毗酮、灰黄霉素、特比蔡芬终点定义不如两性霉素B严格，为抑制80与以上生长。7.2 结果解释7.2.1折点/ECVs的结果解释丝状真菌的临床折点尚未建立，但已定义一些曲霉属及种复合群对两性霉素B、卡泊芬净、伊曲康哇、艾沙康哇、泊沙康啤、伏立康晚的EeV值，这些ECV可能有助于识别非野生型（NWT）曲霉属及

31、种复合群的潜在耐药性，但这些终点仅限于体外数据，其临床相关性尚不确定。无折点的丝状真菌ECVS见表D.1,有折点的丝状真菌ECVS见表D.2。7. 2.2两性霉素B肉汤稀释参考方法检测大多数非皮肤真菌和条件致病霉菌的MICS值在05gm1.-2gm1.之间，而曲霉属的中位数在0.5Ug/m1.1gm1.之间，土曲霉及种复合群除外（中位数为2gm1.）o大多数非皮肤真菌和条件致病霉菌的MICS值在0.5Ug/m1.2gm1.之间，土曲霉及种复合群除外（2gm1.）,而其他丝状真菌如黄曲霉、构巢曲霉、杂色曲霉及种复合群，及一些曲霉属其他种，如烟曲霉、枝顶抱霉、淡紫紫施霉、尖端赛多加霉、多育节荚狗霉

32、的MlCS可高于2gm1.（分布范围为2Ug/ml?16gm1.）,但MIC高于2Hg/m1.治疗失败可能性较大，而MIC低于2Ugm1.可能治疗成功。1.1.1 2.3氟胞啮咤大多数丝状真菌对氟胞啼咤都不敏感，MlC值都64g/m1.o但曲霉属和暗色真菌例外。7.2.4 氟康嗖大多数丝状真菌对氟康映都不敏感，MlC值都64g/m1.o但双相真菌和皮肤真菌例外。7.2.5 酮康嗖大多数非皮肤真菌的MlC在0.0313Ug/m1.16gm1.之间。但研究数据未显示MIC值和疗效的相关性。关于酮康哇的ECVS尚未建立。7. 2.6伊曲康哩、泊沙康嗖、艾莎康嗖、伏立康理应使用本标准推荐的溶剂进行抗真

33、菌药物溶解，否则可导致结果不准确。7. 2.6.1非皮肤真菌非皮肤真菌对伊曲康理、泊沙康噗、艾莎康哇、伏立康嗖的MlC在0.0313gm1.-16gm1.之间（大多数曲霉属的中位数在0.06gm1.-0.5gm1.之间）。研究表明某些黑曲霉、烟曲霉和镰刀菌属及种复合群对伊曲康哇、泊沙康咏、艾莎康嗖、伏立康哇的敏感性降低并产生交叉耐药。尖端赛多也霉和淡紫紫抱霉及一些暗色霉菌（如离蠕袍属和链格抱属）对泊沙康哇和伏立康啤的的MlCS通常低于4gm1.7. 2.6.2皮肤真菌氟康理、伊曲康哩、泊沙康哇和伏立康哇通常对皮肤癣菌的MlC值较低，但氟康噗也存在MlC较高的情况（216gm1.）,但体外结果与

34、临床疗效有待确定。7. 2.7棘白菌素类棘白菌素类主要用于曲霉属检测，而非曲霉属MEC值通常较高（4gm1.）.卡泊芬净对曲霉属的MEC值在0.016Pg/m1.16gm1.之间（中位数多位于0.06gml0.25gm1.之间），而阿尼芬净和米卡芬净MEC值通常较低。卡泊芬净对曲霉属的MEC值高于ECV的频率因种而异。7 .2.8环唯酮环叱酮的MICSN1gm1.,但MlC值和疗效的相关性尚未确定。8 .2.9灰黄霉素灰黄霉素的MlCSWlgm1.,但MIC值和疗效的相关性尚未确定。7. 2.10特比蔡芬特比蔡芬对大多数皮肤真菌的MlCS0.25gm1.,但已有报道红色毛癣菌的MIC0.5gm

35、1.,但MlC值和疗效的相关性尚未确定。7 .2.11EUCAST折点/ECOFF结果解释EUCAST微量肉汤稀释法(附录E)与本标准(参考C1.Sl)肉汤稀释法步骤基本一致，接种量等条件略有差异。目前C1.Sl及EUCAST真菌药敏标准检测药物种类和菌种范围不同，实验室可根据临床需要选择方法和判断标准。EUCAST折点/ECOFF普遍稍低于C1.Sl的折点/ECV。EUCAST微量肉汤稀释法24h质控菌株MlC范围见表E.1;丝状真菌体外微量肉汤稀释法24hMIC折点见表E.2;新增毛癣菌的ECOFF值见表E.3。8 .3结果报告8. 3.1按本标准肉汤稀释法操作步骤报告结果按本文药敏方法检

36、测丝状真菌包括3种类型：(1)有MlC判断折点，如：伏立康哇对烟曲零结果报告MIC值及敏感度，见表C.1;(2)无MIC判断折点但有ECV值，见表D.1,报告MlC值；如果MlC值低于ECV值报告为野生型，并说明该菌株无获得性耐药机制或无敏感性降低；如果MIC值高于ECV值报告为非野生型，并说明该菌株具有推测的/已知获得性耐药机制或敏感性降低；并明确ECV不是折点，不能预测临床治疗效果；(3)无折点和ECV值：只报告MIC值并说明目前该丝状真菌的临床折点尚未建立。7. 3.2按本标准附录E药数方法报告结果按附录E的条件进行微量肉汤稀释试验并同时做质控，见表E.1,结果报告包括2种类型：7.1

37、)有MlC判断折点，见表E.2,两性霉素B、艾沙康哇、伊曲康嚏、泊沙康哩及伏立康嚏针对烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、构巢曲霉及土曲霉报告MIC值及敏感度；7.2 )无MIC判断折点但有ECe)FF值，见表E.3如毛癣菌，报告MIC值；如果MlC值低于ECoFF值报告为野生型，并说明该菌株无获得性耐药机制或无敏感性降低；如果MlC值高于EeoFF值报告为非野生型，并说明该菌株具有推测的/已知获得性耐药机制或敏感性降低；并明确ECoFF值不是折点，不能预测临床治疗效果。8质控制7.3 目的为了保证实验人员操作和读取结果的正确性，应对试剂、试验条件等同时进行质量控制。质量控制的目的是监控，包括：药敏试验的

38、精度(可重复性)及准确性，试验中使用试剂的性能、条件及说明，测试和读取结果人员的表现。7.4 培养基和材料的质控当使用新批次的培养基、培养皿或RPMI-1640肉汤培养基以及微量稀释96孔板、宏量稀释管时应使用表B中列出标准菌株进行药敏试验，检测MIC是否在控。应至少培养1支未接种菌悬液稀释管，检测是否无菌。并记录试验使用材料的批号。8. 3纯度质控药敏试验后将待测菌的接种液转种于相应平板并分区划线，确认接种菌液的纯度。8.1 终点判读质控应定期进行终点判读质控，以尽量减少试验人员之间的MlC或MEC判读差异。伊曲康理和其他三哇类药物适合用于比对试验，并用已确定MIC或MEC值的标准菌株进行终

39、点判读质控。试验人员应在相同条件下独立判读结果，并与操作熟练人员的结果比对。8.2 标准菌株的保存8.5.1菌种的保存方法在菌种的保存过程中，应尽可能保持其稳定性，减少突变。应将丝状真菌在马铃薯葡萄糖培养基生长后，于-70C冻存。用10%甘油制成菌悬液或保存在真菌冻存管中，-70C或使用液氮冻存。若短期使用也可在沙保罗培养基培养后2C8保存，但不应保存超过3代。若长期保存，丝状真菌质控菌株在马铃薯葡萄糖培养基、皮肤真菌在沙保罗培养基、红色毛癣菌在燕麦培养基上28C生长7d。挑选菌落进行药敏试验。若MIC值在质控范围之内（见表B）,继续传代培养直至生长良好（通常ld7d）检查菌株是否为纯培养，然

40、后制备菌悬液。将菌悬液分装在冻存管内，-70或使用液氮冻存。8.5.2日常质控用标准菌株的复苏将长期保存的标准菌株复苏。丝状真菌在用马铃薯葡萄糖培养基上，红色毛癣菌在用燕麦培养基35培养4d5d或至分生抱子生长良好；非皮肤真菌35C培养7do挑选4个5个菌落进行药敏检测，并在胰酶大豆消化琼脂斜面上传代，培养后放置在2C8C储存。琼脂斜面保存的日常质控用标准菌株应每隔两周从长期保存的菌株复苏、更换一次。附录A（资料性）RPM1-1640干粉肉汤培养基配制方法RPM1.l640干粉肉汤培养基（I1.）配制过程见表A.1,RPMI-1640肉汤培养基配方见表A.2,含2%葡萄糖改良RPMI-1640

41、肉汤培养基配方见表A.3,燕麦培养基制备配方见表A.4。表AJRPNn-1640干粉肉汤培养基（11.）配制过程步骤过程110.4gRPMIT640肉汤干粉，34.53gMoPS,溶解于900m1.蒸储水2加入MoPS（终浓度为0.165mol1.）,搅拌至溶解3使用ImOI/1.氢氧化钠调节PH至7.0（25*C）4补水至11.5过滤消毒储存在4备用MOPS表示3-(N-吗啡咻)丙和酸(3-N-morpholinopropanesulfonicacid)0表A.2RPM1.1640肉汤培养基配方表（含谷氨酰胺和酚红，不含碳酸氢盐）组分g/1.水组分g/1.水组分g/1.水1.-精氨酸（游离碱

42、）0.2001.-脯氨酸0.020核黄素0.0002无水1.-天冬酰胺0.0501.-丝氨酸0.030盐酸硫胺素0.0011.-天冬氨酸0.0201.-苏氨酸0.020维生素B120.0000051.胱氨酸二盐酸0.06521.-色氨酸0.005硝酸钙HO0.1001.-谷氨酸0.0201.-酪氨酸二钠盐0.02883氯化钾0.4001.-谷氨酰胺0.3001.-缴氨酸0.020无水硫酸镁0.04884甘氨酸0.010生物素0.0002氯化钠6.0001.-组织酸（游离碱）0.015D-泛酸钙0.00025无水磷酸氢二钠0.8001.-羟脯氨酸0.020氯化胆碱0.003D-葡萄糖2.0001

43、.-异亮氨酸0.050叶酸0.001谷胱甘肽0.0011.-亮氨酸0.050肌醇0.035酚红钠盐0.00531.-赖氨酸盐酸盐0.040烟酰胺0.0011.蛋氨酸0.015对氨基苯甲酸0.0011.-苯丙氨酸0.015盐酸毗哆醇0.001表A.3含2%葡萄糖改良RPMI-1640肉汤培养基配方表组分1倍浓度2倍浓度蒸储水900ml.900ml.RPMIT640干粉10.4g20.8gMOPS34.53g69.06g葡萄糖18g36g表A.4燕麦培养基配方表步骤过程1 在I1.水中加入100g燕麦粉15g琼脂，0.03g庆大霉素2 混匀二WC高压灭菌20min分装，储存在4C-6C备用4质控：阳性：红色毛癣菌形成分生抱子：阴性：不要求，培养基严格用于真菌培养；无菌试验：无生长.JessupCJ,WarnerJ,IshamN,etal.Antifungalsusceptibilitytestingofdermatophytes:establishingamediumforinducingconidialgrowthandevaluationo