primer 60 引物设计教程.docx

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1、primer6.O引物设计程首先,须要知道基因序列，如，我们要设计rat的CK18mRNA检测的引物，我们先到这个网站查找CK18mRNA的基因序列，ZncbiNiimiC4M*rcgr*54StrctGmA6FmGewct&MdcmGn7XlJj*NCBI!“foBMMtf09yhto*Mt%*sy*.MdhM*ro*R*9ccm*Iobcm-：IMc1110yasIRmwt12K三OVUOMMPMCPopSetProoeProtenProtonCU5*sPuQecnPuOCnemCOnPoUrKJPbCnttnrf力/datMmgNCerIGftNC8dMerMtwwe153W011*WW

2、J10GAdcdPMHwEGMOw*nRattusnorvegkuskeratin18(Krt18)1mRNA然因序列号NCBReferenceSemeMM.0639761FASTAor三TWW5a11三三cwJ11affwortl11Wt5InUM1.SMIW3aMUluarX0MRWFiiwMMttinl(Xftl9)BKMaM1.M妙”U_2：661n.aS30?4.1C2：eitM7MeKwitwtucvcuf(IfomaE)1tNCEn*l9KcKma1i*KutAa皿ueh3To”CHruKodayxttSctun*hl.4MBn4wdnr*Ktttv.1C5,ItinBor4lM

3、F,E1.193rrK.9mmTardl*rcauI.Iemin1/18terUe-eh-*adtdaccyrkltcnva0FVS.E)tTW1201百UM现在，往下拉就会看到基因序列tr.fync*msItl-ir/ftMvlar(1.rMe=AAB91db.xref=OuSTS21111.S*ORICDIIccatcettctccctcfttdcctctcca(e&a*taceaccecccc61CXCtCcttCtcecc*etccctccctttctctttctceee，cw，t121ccecctcMCMeCHccacttctatgc(tgct(icctcMrtec“N181MCC贝

4、CtCCCCCUCCtCccctccctCCtCCCtccCCKccctCCCCCMCC241t(cctccaact(*Maa*cct*cUECCaC1.cct301M*caamcc(aaaccaaacsCM*c1*1a*Cc*lk*cccasta3ltetcM*MKttcceeMCCCttCMdacttcaceeatc421MNCtggcctctctttoc*ntctg“,Zm，oCegCSCgtcctgcacat181CBcaatccCetG“c”U3tg1ctt7utcctatgMaccaactcccat541(ccca(t1.ct*ct(MattE“c1cc(cmCtCtCC*tccu

5、cat601caea(tcac1*c*cHc,acgctea(vct(ct(ttca1*a661(aa*aefetCM4MC*Mtee*Mtcctwctcatt*CCNttctcCttc721”WlgatfCtCCCMRCtCMeEwClCNyCKICfttCCftK?81CClCtat3HCCtCMWXcfMgactfWMCtdetCetUC“ca841(1，CaMaCMcaccc,atcaccacCMtct(CC(Mca(c，cd“x901ce*ccttcEccacct(*st(acct(aeteaca961a*aeca4*eaCMCcaocwctctCC*MtCcMcatcacyc102

6、1，hcmctc*ktct(tccttctcatctca*tcftEyCcCtyIOSiM&KCCKcccccocMCaMUCaMCCctet”axH8g4tcacraIIQImat，cccctaccc“ct，BetCC*CCCCCxatttcCtctCa1201ccccc*ctcca*cttccaCK*e*c*ccc1261，M，,c“aCt(tttceacd,accMMttCtydwca1321RWaXcccttgc(ftytecRttyweezam2aIWlaawaaaa&via/将这个序列复制到primer6.0中就可以进行引物设计,我们先打开Peimer6.015, UPgPdeAv

7、ailableAnVfigradraVnihh)Ponthesp11t.DoyouWaIUtodownloaditnow?UPgIadeDeSerdon:UpgradeInChJdeSthefbDowinfeatures Supponforthelatestgcno11ucBabaSeSavailableattheNCBlB1.ASTWrVer SupportforWindows8Forplease5XhttowwwOrElKTbo某OftCorn/ProductgZdEyvVpgradgghtmlKtoctnfornabonISaadabCeat1即/TwwwFPocUjgtgn破解版打开会

8、出现这个对话框，关闭即可FileEditViewAnalyzeToolsOnline点击新建将序列更制至这个对话框NewSequenceSequenceDMnitionJNucleotidesequenceSequenceGCA9611021AAACCAGAJICGATGGAGcAATCCTTGGCtcaatgggcAGCACCTCGGGGMGTGGAGCCCAGATCAGG-jAAACTTCCTTCTGCATctggaatcaGAGCTGGCacGGC1081AGAAGGACAGCGeCAGACCCASAATACGAAgccctcttgAACATeAAGGTCAAOTGA1141GGcGGA

9、GATTGccacctaccGccgcttgctGGGGTGGGGACGATTTCAGTCTC.CGAIZOlCGCCCTGGACTccagcaactCcatgcaaacTgtccagaggACAACTACCCGTAAG-CGT1261GGATGGCAGtgotgtccgAGACCAATGATACCAGAGTTCTGAGGCACTAGGC,AGA1321AGj1.AGGGAJlCCCCTTGGGGACTGJ1.GGGACCMTaJ1.AAGTTTGTCCJUIMAJ1.AA1381kkkkkkAAAAAAAVJMAddICancelIHelp点击AddFoed田TooK0rtnHelpA0/x

10、”|0,51|也匍鼻=Wl-SeuehceInformaflonSearchStatus点击这个图标出现卜面对话框，这里可以选择引物在序列哪些地方设计引物，我一般不更改，也就是引物可以设计在整个序列，你也可查一下序列才几个区，一般引物应当跨两个区。之后点击primerParameters这里可以设置退火温度、引物K度、产物K度等，我一般只是更改产物K度，我一般设为100到300bp,因为假如产物太大，在染料法中会影响扩增效率,之后点击Search之后出现下面对话框SearchCompletedSequencesProcessed:1EIapsedTime00:00:00点击OK出现下面引物序列

11、这个时候引物设计完成，我们须要对引物进行验证，我一般到NCBI()上验证，进去后点击最下面菜单中的B1.AST之三三AA一一三三ht1-E三三三三.三点击这个图标BasicB1.ASTChooseaB1.ASTprogramtorunnuclsoUdsbldstProtioblastblast-SearchanucleotidedatabaseusinganucleotidequeryAlgonthmsblastn,megablast,discontiguousmegaWastSearchproteindatabaseusingaproteinqueryAlgonthms.blastp,ps-

12、blast,ph-Wast.delta-blastSearchproteindatabaseusingatranslatednucleotidequeryIblastnSearchtranslatednucleotidedatabaseusingaproteinquerytbldstxSearchtranslatednucleotidedatabaseusingatranslatednucleotidequeChooseatypeofspecializedsearch(ordatabasenameinparentheses)oMakespecificpnmerswthPnmer-B1.AST-

13、点击这个图标0SearchtracearchivesFindConserVeddomainsinyoursequence(CdS)FindsequencesWrthsimilarConserVeddo11idindrchitects(cdart)oSearchsequencesthathaveqeneexpressionprofiles(GEO)SearchimmunoglobulinsandTCeilreceptorSeqUenCee(IgB1.AST)Screensequenceforvck)ContaminatiOn(VeCSereen)SequencePosition1.engthbp

14、Tm竺OTAGTCACCACCAAGTTf?9FQIOTrCTCCAAGnGAICopySensePnmerCM*Sift*ECopyAntisensePnmefCtn*Shn*AAllPnmers.PfimerAjiStructures图中位置将前引物复制到R.xaSmsearchparartf3RttnErocerrosJtsPCRTewpIatGEwierc,gi,xFASTA(AMwqe3,onplusstrand)Ihemyownreverseprimer(5,3,onminusstrand)PCRproductsize在这输入后引物Primermeltingtemperatures

15、(Tm)MaxTmErence3eofPCimrSoreturn之后将图中位置的homosapiens删除后输入ratm11eranopeccykecng1.dIdn比IWSSpecifkltycheckEnadesearchforDCmerpairsspeiicIomeInienOdPCRtemplate”OatabeseRefsqmRNAmyOrgantMnratExclusion(OpionaOEnuezqued10114)BUfdk)rat(tax诂10116)fkway(tad10116)RjntusPC12cloneIS(laxd10116)Rattusnonv9cus(taxd1

16、0116)Sprague-Daeyrat(UXKj10116)WisUfrats(tax1d10116)aOAaAA,4nh$tasyoutp*Ifa)E.JdUdeUnaA三dtarges.includingend“C.出现上图对话框时选择RattUS(taxid：10114)之后点击GetPrimersPrimerspecificityMngencyMnpriinedproductsitedeviationSplicevarianthandllgPnmefEahaeMlees!2fIOuri11Msma(ce5tounrtendedngatleast2Jl11wnalcheswhnthel

17、ast5bpsattheJend99n0rctargetsthat6ormoreEmJeCh03tothePnmtf_4000“GetPrimersiAlowpn11H10a11yun09asPCRShowre*ftsinaewwindowJ(Menewgraphicvieww点这里这时会出现下图状况，因为服务器在国外，清耐性等待wk.tMnwiki1;MttmnqHMMSec;tuYuUlrveme.1“5StatusSubmittedChtckCue3,)1.ntnmcc“Ifccmpimnu11tyForwardPCfn”Gtagtcaccaccmgtctg19M86526358RvrP

18、nfn”GTTCICCAOTTGTGTCTO21M80428658Rrodwctt8ur9tmputRanusrve9cu5teratnIB(Krt18)11RHAprotlenth-126FrrrdpriBe1CnCTClCaCCuCM19Twlte配08?8ReverprleICTTCTOCAACTTCATCTTCTC21Template%5965AO1284Rjfiusrxve9c1.B3时a2HSgycoprotem(ATsg)mRKAPrgKRlerXM0062368181PREOlCTEDRattusnomRfAPrCaKtlerth三WOFoxrirdprler1CuCTCAOC

19、IIXduCTCTC19TopUte309.CT.A.TT327,orrrdprlte1CTgTCACCAlXUCTCTC19他能扩增许多大鼠基因，如CK18产物为126bp,Ahsg产物795bp,但是除了CK18其他基因扩增是产物较大，而且有点突变，所以在PCR反应时这些东西是扩增不出来的，也就是说这个引物的特异性不错，在扩增时只会扩增出我们须要的CKl8这个基因，所以这个引物我们就可以订出去，找公司合成。有的时候这样的引物也不肯定就可以用，所以当我们收到合成好的引物后，可以做一卜.预试验，看这个引物是否真的可以用，在须要引物时我们也可以到文献中杳找，一般发表在全球闻名杂志中的外文文献里的引物都是可以用的，查找是要留意文献中用的是染料法还是探针法，探针法的引物在染料法种效果不佳，应当舍弃，选择染料法的引物。