附件5实验项目技术操作步骤简介docx.docx

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1、L总RNA提取(约20-2.5h)I .引言从人组织/细胞中提取基因组RNAII .缩写III .试剂和材料EP管，DEPC水、刀片、液氮、TriZol溶液、氯仿、异丙醇、75%无水乙醇、异丙醇、组织样品/细胞IV .仪器细胞安全柜、离心机、研磨机、核酸蛋白检测仪V .试剂配方实验准备：清洗研磨柱：流水冲洗后用刷子刷两遍，漂白粉浸泡Iomin后流水冲；ddH2O冲洗两遍后，加75%乙醇超声清洗3min；再用ddH2O冲洗两遍后，加ddH2O超声清洗3min。最后再用DEPC水冲洗后烘干。VI .Protocol -(0.5h) (20mln) (20min) (20min) k(20min)

2、(15min)2.反转录(约1.Oh)I .引言反转录是以RNA为模板，通过反转录酶，合成DNA的过程。II .缩写III .试剂和材料RNA样品、反转录试剂盒IV .仪器细胞安全柜、PCR仪冰盒、中小枪头、八联管及盖子、1.5mlEP管V .试剂配方VI .Protocol去除基因组DNA反应k(20min)反转录反应一(0.5h)3 .荧光定量PCR(约3.0h)L引言Real-timePCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累对整个PCR进程进行实时监测，最后通过Cq值和标准曲线对起始模板进行定量分析的方法。试剂和材料引物：生工、华大等生物公司合成引物酶：ProTaqHSS

3、YBRGreen预混型qPCR试剂模板：cDNA、质粒等ddH20L仪器荧光定量PCR仪(0.5h)(0.5h)(2h)IV体系2XProTaqHSSYBRGreen5uL模板质粒约50ngcDNA约200ng上游引物IuL(0.4-IuM)下游引物IuL(0.4-IuM)ddH20补足至IOuL总体系IOuLV.程序955min955s35-40cycles58IOs7220s（时间依据酶的扩增效率及目的产物长度）72IOmin4 .SiRNA干扰(细胞培养+转染约2-3天)I .引言RNA干扰是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时

4、，该mRNA发生降解而导致基因沉默的现象。通过siRNA与同源的靶RNA互补结合，使特异性酶降解靶RNA,从而抑制或下调基因的表达。II .缩写III .试剂和材料IXriboFECTCPBuffer(V2)、20UMSiRNA储存液(V3)、riboFECTn,CPReagent(v4)IV.仪器细胞安全柜、V .试剂配方VI .ProtocollriboFECTMCPReagent转染SiRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器的试剂用量请参考表2,若使用其它转染试剂，请参考对应转染试剂说明书。SiRNA终浓度银孔体积培养基(5)Buffer(v2)NA(v3)ReaNtg9

5、6-wellIOOnM100l9290l6l0.5l06l50nM100l9315l6l0.25l0.6l30nM100l9325l6l0.15l0.6l20nM100l93.30l6l0.1l0.6lIOnM100l9335R6l0.05l0.6l24-wellIOOnM500l464.50l30l2.5R3l.50nM500l465.75l30l1.25l3l30nM500l46625l30l0.75l3l20nM500l46650l30l0.5l3lIOoM500l466.75l30l0.25l3W12-weUIOOnMIml929.00l60l5l6l50IMIml93150l60l2

6、.5l6l30nMIml932.50l60l.s6l20nMIml933.l60lll6lIOnMIml933.50l60l0.3l6l6-well100nM2mllS58.00l120l10l12l50nM2ml1863.00l120l5l12l30nM2ml1865.00l120l3l12l20IM2ml1866.00l120l2l12lIOnM2ml1867.00l120lll12l接种细胞，过夜培养稀释SiRNA献混合液制备转染细胞16h后细胞换液，过夜培养重复转染步骤1次(Ih)(20min)(20min)(10min)(10min)(培养4872h )5.ShRNA质粒包病毒与细胞

7、转染（细胞培养+转染23天）I .引言慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-I基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。II .缩写III .试剂和材料ShRNA质粒，3个，-80C。保存，用前室温复温control(shRNA阴性对照)，-80C。保存，用前室温复温包

8、病毒质粒：psPAX2,PMD2G,-80C。保存，用前室温复温PCDH(GDF)：荧光对照，评价P日转染效率,-80C。保存，用前室温复温293T细胞，10%FBSinDEME,37Co,5%CO2.8090%密度PEIlugul,-20C保存，用前室温复温OptiMEM,4C。保存，用前室温复温，若有沉淀，吹打混匀HaCat细胞：10%FBSinDMEM,37Co,5%CO2聚凝胺：solarbio,cat#H8761IV .仪器细胞安全柜V .试剂配方VI .Protocol1.病毒包装接菌，过夜培养质粒提取293T细胞铺板，培养过夜病毒包装I6h后细胞换液，过夜培养病毒液收集-(0.5

9、h)一 (2h) (Ih)(Ih)k (10min ) (0.5h )细胞铺板，过夜培养病毒液转染6诟细胞换液，培养过夜二次转染6h后细胞换液，过夜培养嗯吟毒素筛选I48h 后细胞消化，富集培养一(Ih)一(Ih) (IOmin )(Ih) (10min )(0.5h )Ik ( 0.5h )分子克隆6.普通分子克隆（总耗时4天）I .引言分子克隆技术是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的

10、许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。II .缩写PCR:PolymeraseChainReactionIII .试剂和材料列出推荐的供货商，试剂和材料严格按规定使用。（有比推荐的同等或更好的产品，可以在必要时使用）PCRmix（或其他DNApolymerase供货商：Thermo）Endodeoxyribonuclease（供货商：NEBZthermo）Vector（供货商：生物公司）Ligase（供货商：NEBZthermo）DNA基因组提取试剂盒（供货商：TiangenZAxygen）质粒提取试剂盒（供货商：TiangenZAxygen）DNA纯化试剂盒（供货商：TiangenZOmega）

11、一次性无菌离心管（供货商：JETBIoFlL和GEB）50ml离心管、15ml离心管、1.5ml离心管、PCR管（供货商：JETBIOFIL）IV .仪器低速离心机、高速离心机、4C展示柜、-20C冰柜、PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像系统恒温水浴箱V .试剂配方氨节青霉素、硫酸卡那霉素、LB培养基、限制性内切酶、连接酶、感受态细胞等。VL实验类型1.PCR扩增目的基因引物设计、合成3day普通PCR24h产物检测12h纯化|Th2）实验评估：本实验为普通PCR克隆基因片段实验，包括对目的基因设计特异性引物，PCR条件的摸索及优化，PCR产物的检测及纯化，总耗时不低于4天。3）本实验结果报告：包

12、括各试剂品牌、货号，实验操作具体步骤以及琼脂糖凝胶结果及纯化产物浓度、纯度等相关数据。7.酶切、连接、转化（耗时5天）纯化PCR产物酶切2h产物、载体连接24h感受态细胞转化23h46h23d2）实验评估：本实验为载体重组实验，包括对目的基因和载体的特异性切割及连接，转化，单克隆筛选及鉴定，总耗时不低于5天。3）本实验结果报告：包括各试剂品牌、货号，实验操作具体步骤以及琼脂糖凝胶结果及测序报告等相关数据。8.蛋白表达、纯化（耗时10天）I.引言目的蛋白表达与纯化是通过原核或真核表达系统对R的研究基因进行外源表达后经过纯化手段获得较纯的蛋白，旨在蛋白水平进行基因的相关研究。IL缩写NI-NAT:

13、银亲和层析柱IPTG:isopropy-D-thiogalactosideIII.试剂和材料列出推荐的供货商，试剂和材料严格按规定使用。（有比推荐的同等或更好的产品，可以在必要时使用）LB培养基（供货商：thermo）、NI-NAT（供货商：广州化学试剂厂）、GST树脂（供货商：广州化学试剂厂）、脱脂牛奶（供货商：BD）.无钙镁离子PBS（供货商：TBD）,吐温20（供货商：Sigma）Washingbuffer（供货商：广州化学试剂厂）、IPTG（sigma）SDS-Page配胶试剂（供货商：Iherm0）、考马斯亮蓝（供货商：Sigma）、溶菌酶（供货商：Sigma）、一次性无菌吸管（供货

14、商：JETBlOFlL）、25ml吸管、IOml吸管、一次性无菌离心管（供货商：JETBloFIL和GEB）、50ml离心管、15ml离心管、L5ml离心管IV.仪器低速离心机、高速离心机、超声仪或匀浆机、4C展示柜、-20C冰柜、电磁炉加热器、垂直电泳槽、空气恒温摇床V.试剂配方原核表达纯化及真核表达纯化相关试剂原核表达：筛选抗生素、LB培养基、IPTG真核表达：1640、DMEM等细胞培养基VL实验类型1.原核蛋白表达、纯化重组载体转化表达菌1d小试诱导表达824h不表达68h七君口824h大量纯化23d快薪布楠、23d2）实验评估：本实验为原核蛋白表达及纯化实验，包括对目的蛋白的试表达，

15、可溶性分析及优化，大量纯化及分析检测，总耗时不低于10天。3）本实验结果报告：包括各试剂品牌、货号，实验操作具体步骤以及蛋白试表达结果及纯化产物浓度、纯度等相关数据。9.真核蛋白表达、纯化（耗时15天）重组载体转染细胞小量表达检测4896h不表达68h生48-96h大量纯化23d|纯度分析、浓缩、浓度检测及交付23d2）实验评估:本实验为真核蛋白表达、纯化实验，包括对目蛋白的小试表达、分泌性分析，大量表达、纯化，纯度分析及浓度检测，总耗时不低于15天。3）本实验结果报告：包括各试剂品牌、货号，实验操作具体步骤以及蛋白小试表达结果及大量纯化后蛋白浓度及纯度报告等相关数据。10.ELISA（耗时4

16、-5天）I .引言ELISA是酶联接免疫吸附剂测定（Enzyme-LinkedImmUnOSorbnentASSay）的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。本文主要介绍三种ELlSA方法，分别是间接ELISA、夹心ELISA以及细胞ELISA,详细描述操作规范。II .缩写FBS:FetalBovineSerumELISA:EnzymeLinkedImmunosorbentAssayHI.试剂和材料列出推荐的供货商，试剂和材料严格按规定使用。（有比推

17、荐的同等或更好的产品，可以在必要时使用）FBS（供货商：GIBCO）Na2CO3（供货商：广州化学试剂厂）、NaHCO3（供货商：广州化学试剂厂）、脱脂牛奶（供货商：BD）.无钙镁离子PBS（供货商：TBD）,吐温20（供货商：Sigma）TMB显色液（供货商：EMDMillipore）浓硫酸（属于危险品，在防爆柜中）、HRP标记羊抗鼠（Thermo）、HRP标记羊抗人（Thermo）DMSO（sigma）一次性无菌吸管（供货商：JETBIoFlL）、25ml吸管、IOml吸管、一次性无菌离心管（供货商：JETBloFIL和GEBG50ml离心管、15ml离心管、1.5ml离心管、ELlSA板

18、（供货商：JETBIOFIL）IV .仪器低速离心机、高速离心机、4C展示柜、-20冰柜、自动洗板机、恒温培养箱、酶标仪V .试剂配方碳酸盐包被液（CBS）：WNa2CO31.59g,NaHCO32.93g,加水定容到1L,pH=9.6,0.45m过滤。10PBS:称取NaCI85g,二水磷酸氢钠3.9g,十二水磷酸氢钠26.84g,加水定容到1L,0.45m过滤。2MH2SO4：891.5ml水+108.5ml浓硫酸VL实验类型1 .间接ELISA板设计：包括对抗原包被及抗体检测浓度的优化123456789101112ABCDEFGHPH9.6的Na2C03NaHC(包被抗原过夜JPBST次

19、5%脱B旨牛奶/PBSTI1.5hPBS设2次TC孵育|1hJPBSTi!t4次二殍育I075hJPBST4次TMBSfe0.25h|终止班Lt枪妇RSPBST洗涤耗时平均5min次/板2）实验评估：本实验为间接检测抗原的EIiSa实验，包括对抗原的包被，一抗、二抗的孵育及检测，每个样本三个复孔检测，总耗时不低于5h派。3）本实验结果报告：包括各试剂品牌、货号，实验操作具体步骤以及检测板原始数据及分析统计数据。2 .夹心ELISApH9.6的NazCCVNaHg包颜体JPBSM2次5%脱脂牛奶/PBST1.5hJPBSr洗2次未知抗原孵育JPBST4 次检测抗体孵育0.75hJPBST4次TM

20、Bgfe0.25h终止反应上机检测RSPBST洗涤耗时平均5min次/板2）实验评估：本实验为夹心法检测抗原的EliSa实验，包括对抗体的包被，抗原、检测抗体的孵育及检测，每个样本三个复孔检测，总耗时不低于5h派。3）本实验结果报告：包括各试剂品牌、货号，实验操作具体步骤以及检测板原始数据及分析统计数据。3 .细胞ELISA细胞计数后铺板（V型）0.5hPBS洗2次抗体上清孵育I1hJPsi4次二抗孵育|075hJPsi4次TMBSfe0,25h终止反应上机检测RSPBS洗涤耗时平均5min次/板实验评估：2）本实验为全细胞检测抗体的EliSa实验，包括对细胞的铺板，未知抗体、检测抗体的孵育及

21、检测，每个样本三个复孔检测，总耗时不低于4h板。3）本实验结果报告：包括各试剂品牌、货号，实验操作具体步骤以及检测板原始数据及分析统计数据。11.梅毒螺旋体培养及兔感染（耗时30天+30天）I .引言引起梅毒，雅司和非性病梅毒的螺旋体不能在体外培养。本研究涉及分离梅毒螺旋体亚种和来自临床标本的其他致病性密螺旋体，在兔子体内繁殖梅毒螺旋体相关感染性实验。II .缩写III .试剂和材料PBS（Gibcol）,丙泊酚、氯化钾、含15%甘油TPCM-2（冻存液）、一次性无菌离心管（供货商：NEST）、50ml离心管、15ml离心管、L5ml离心管IV .仪器高速离心机、4展示柜、-20C冰柜、-80

22、C冰柜、水平摇床、生物安全柜V .试剂配方VI .实验类型维持和繁殖无法培养的培养密螺旋体需要几个不常见的项目和方法，包括兔子，兔子束缚板和专用显微镜来计数密螺旋体。在某些情况下，需要镇静剂或麻醉剂在接种前麻醉兔子（减少HIV+液体对技术专家针造成刺伤害的可能性），这些材料如下所述。此外，TP非常脆弱，不能长时间存活。因此，应在进行临床样品或菌株1小时内接种，需要仔细规划所有程序并推进。1.兔子健康成年新西兰兔，3个月大，2.5到3.0kg,睾丸明显且未接受抗生素治疗（喂食不含抗生素饲料），VDRL或RPR试验接种前鉴定。兔子应该安置在控制18C到20的温度室内以方便监测密螺旋体生长和病变发展

23、。新西兰兔购买及隔离7d菌种注射睾丸15-50d菌株收取46h菌株纯化、冻存23d2）实验评估：本实验为梅毒螺旋体体内培养实验，包括对梅毒螺旋体接种、血清监测及菌株收取纯化等，总耗时不低于30天。3）本实验结果报告：包括各试剂品牌、货号，实验操作具体步骤以及菌株收取量及纯度等相关数据。动物感染实验新西兰兔购买及隔离7d皮内注射或静脉注冢I1550d相沦旨标侬!I-46h2）实验评估：本实验为梅毒螺旋体兔感染实验及相关指标检测，总耗时不低于30天。3）本实验结果报告：包括各试剂品牌、货号，实验操作具体步骤以及表型监测和相关指标检测等数据。13.细胞融合技术筛选单克隆抗体准备和方案（耗时13周）I

24、.引言本文主要介绍通过细胞融合技术筛选单克隆抗体的实验方案，该方案主要是将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和免疫小鼠脾细胞在PEG的作用下融合，形成B细胞杂交瘤，这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即单克隆抗体。单抗的制备过程中需要经历两次筛选，第一次是在HAT特定的选择性培养基中筛选出融合成功的杂交瘤细胞；第二次是通过ELISA和克隆化的方法筛选出可以稳定分泌我们所需要抗体的特定杂交瘤细胞。

25、II .缩写RPMl-1640:RoswellParkMemorialInstituteCO2：CarbonDioxideFBS:FetalBovineSerumPEG:PolyethyleneglycolDMSO:DimethylSulphoxideIII .试剂和材料列出推荐的供货商，试剂和材料严格按规定使用。（有比推荐的同等或更好的产品，可以在必要时使用）Balb/c小鼠SP2/0细胞75%酒精消毒液RPMl-1640培养基（供货商：GlBCO）HAT粉末（供货商：Sigma）FBS（供货商：GIBCO）Penicillin-StreptomycinSolution双抗（供货商：Hycl

26、one）PEG（供货商：Roche）Na2CO3（供货商：广州化学试剂厂）NaHCO3（供货商：广州化学试剂厂）脱脂牛奶（供货商：BD）无钙镁离子PBS（供货商：TBD）吐温20（供货商:Sigma）TMB显色液（供货商：EMDMillipore）浓硫酸（属于危险品，在防爆柜中）DMSO一次性无菌吸管（供货商：JETBK）FlL和FALCoN）25ml吸管IOml吸管3ml巴氏吸管细胞培养容器（供货商：CoStar和JETBIOFIL）IOCm培养皿6孔培养板24孔培养板48孔培养板96孔培养板96孔V型细胞板T-25培养瓶T-75培养瓶一次性无菌离心管（供货商：JETBlOFIL和GEB）5

27、0ml离心管15ml离心管1.5ml离心管5ml注射器（供货商：DoUbIe-DoVe）1ml冻存管（供货商：ThermoFisherScientific）ELISA板（供货商：JETBlOFlL）IV.仪器低速离心机高速离心机CO2培养箱4C展示柜20C冰柜80C冰箱自动洗板机恒温培养箱薛标仪显微镜C6流式细胞仪V.试剂配方RPIVn-1640完全培养基：500ml1640培养基+20%FBS+1%双抗碳酸盐包被液（CBS）*称取Na2CCh159g,NaHCO32.93g,加水定容到1L,pH=9.6,0.45m过滤。10PBS:称取NaQ85g,二水磷酸氢钠3.9g,十二水磷酸氢钠26.

28、84g,加水定容到IL,0.45m过滤。2MH2SO4:891.5ml水+108.5ml浓硫酸冻存液：90%FBS+10%DMSOVL实验操作1）流程图23h23w68w23w23w2）实验评估：本实验为杂交瘤制备单克隆抗体实验，包括对细胞的融合，单克隆细胞的筛选、检测及冻存，总耗时不低于13周。3）本实验结果报告：包括各试剂品牌、货号，实验操作具体步骤以及检测板原始数据及单克隆抗体交付。真菌相关实验真菌基因编辑(农杆菌转化法)I .引言ATMT(grobactiriumtumfaciencemediated-transformant)是农杆菌介导转化的简称。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别

29、含有Ti(Tumourinducing)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(TransferringDNA),农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导植物转基因的理论基础，并且能够应用于真菌转化。II .缩写ATMT：grobactiriumtumfaciencemediated-transfoantTi:TumourinducingT-DNA：TransferringDNAIII .试剂和材料列出推荐的供货商，试剂和材料严格按规定使用。(有比推荐的同等或更好的产品，可以在必要时使用)4)80x0.45U

30、m微孔滤膜(供货商:鼎国)、14ml无菌吸管(供货商:JETBlOFIL)、1.5ml离心管、一次性无菌离心管(供货商：JETBlOFlL和GEB)、50ml离心管、15ml离心管、1.5ml离心管IV.仪器高速离心机、恒温培养箱、称量天平、摇床、PH计V.试剂配方AIM固体培养基各母液配方如下：1. 1.2MK-phosphate-buffer(pH4.8)首先分别配制L25MK2HPO4和1.25MKH2PO4,然后用K2HPO4调节KH2PO4的PH值至4.8。28.5gK2HPO4,100ml；17gKH2PO4,100ml2. M-Nbuffer(IOOml)MgSO47H2O3gN

31、acl1.3g定容至100ml3. 0.0l%FeS04(IOOniI)FeSO47H20001g,加水定容至IOOml4. l%CaCL2(50ml)CaCL22H2O:0.5g加水定容至50ml5. SporeEIements(IOOml)ZnSO47H2O0.01gCuSO45H2O0.01gH3BO30.01gMnSO4H2O0.01gNa2MoO42H2O0.01g以上药品逐个加入溶解后，加水定容至IOOml6. 20%NH4NO3(IOOml)20g硝酸铁加水定容至IOOmI7. .20%葡萄糖20g葡萄糖溶解于水中，加水定容至IOOml8. IMMES(pH5.5)MES(2-(

32、N-吗咻)乙磺酸一水合物MW:213.25)：21.32g溶于水中，定容至IOOmL用NaOH调节PH值至5.5AS(乙酰丁香酮)终浓度200UmoIzLVI.Protocol摇菌：2天后对电击转化后的农杆菌进行摇菌(过夜，培养基为含相应抗性的LB)诱导：取1亳升菌液，加入1亳升AIM液体培养基(加入1微升相应抗生素和2微升AS-己酰丁香酮)，避光混匀，于28C(20OrPm),摇菌6h共培养：用dd水洗真菌菌株(以获取真菌分生泡子)，过滤，离心(4C,400OrPm,1Omin),弃上清，用少量dd水将加子混匀，用血球计数板观察，调为16大格里含胞子15-20左右；取100微升抱子悬浮液与1

33、00微升诱导后的菌液混匀,取130微升于放有纤维素膜的AIM培养基中，于28暗培养转膜：2d后，用干净刀片将共培养菌株取下，放于1毫升PBS（含千分之一的链霉素，头抱，氨节）中，用接菌环将菌体轻轻刮到PBS中，涡旋混匀，取200微升（差不多共可以涂4皿）混匀液涂于相应抗性培养基中，于28暗培养转化子：将长出的转化子再次挑到相应的抗性（真菌抗性）培养基中验证：再次长出的转化子，进行验证即可。实验流程：微量稀释法检测菌株体外的药物敏感性一、实验具体步骤1稀释药液参照CLSIM38-A方法配制药物原液，用含0.2%葡萄糖的RPMI-1640培养基稀释药物原液，以2倍比方式稀释至目标浓度。取姜黄素药液

34、浓度0.25-256gml按第1排第1至第11孔浓度由低至高的顺序加样,第2-8排第2至第11孔浓度由低至高顺序加样,；而特比蔡芬药液浓度0.2516gml则从第1列第2至第8孔列由低至高的顺序加样，第2列第2至第8孔列由低至高的顺序加样，第12列第1孔加200I培养基作为阴性对照，剩余孔加不含药物的培养基100I做生长阳性对照。将96孔板密封置于-20C。冰箱保存备用。(需0.5天)2菌悬液制备将菌株(菌丝相)转种至沙保弱(SDA)斜面培养基，于培养箱中25C。培养7d活化，然后转种至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基上，培养1周后有产分生孑包子。用枪头将2ml无菌1PBS注入长满菌落的斜

35、面，轻轻吹打，然后吸出至EP管。室温下静置15mi左右，待菌丝沉淀后，轻轻将上清吸出至另一EP管。12。OOr离心5min,将上清去除，然后加入2ml无菌lPBSo用血球计数板调整菌悬液浓度至LoXlO6CFUml将已配置菌悬液稀释后接种于SDA平板，验证菌悬液活力及浓度。3加样取100l上述菌悬液加入96孔板中，轻轻吹打混匀，并于培养箱中25C。培养96h,后观察结果。平行3份试验。4倒置显微镜观察并记录结果MIC定义为与阳性对照孔比较100%抑制生长所对应最低药物浓度值。当质控株试验结果在其参考范围内，可认为试验操作可靠。因CLSIM38-A方案没有特比蔡芬对质控菌株的参考值，本实验主要参

36、考其它文献报道的CUR、TRB的MIC范围进行判断操作的可靠性。5药物联合作用结果判定根据NCCLS的部分抑菌浓度指数(Thefractionalinhibitoryconcentrationindex,FlCI)的说明，每个药物的FICI定义为该药物联合应用时的MIC除以该药单用时的MICo当FICI0.5可以认为是协同效应，0.5-1为叠加效应，14是不相关，4是拮抗效应。参照CLSIM38-A方法配制药物原液，用含0.2%葡萄糖的RPMI-1640培养基稀释药物原液，以2倍比方式稀释至目标浓度。取姜黄素药液浓度0.25256gml按第1排第1至第11孔浓度由低至高的顺序加样，第2-8排第

37、2至第11孔浓度由低至高顺序加样，；而特比蔡芬药液浓度0.2516gml则从第1列第2至第8孔列由低至高的顺序加样，第2列第2至第8孔列由低至高的顺序加样,第12列第1孔加200I培养基作为阴性对照，剩余孔加不含药物的培养基100I做生长阳性对照。将96孔板密封置于-20C。冰箱保存备用。二、实验流程培养了14天后制备菌悬液调整菌悬液浓度至1X106CFU/mlIh配置药敏板配置培养基和药物,如果多个药物预计需要8h,一个药物4h时间取IOOUl菌悬液到IomI培养基中，lk每种菌15mm加入IOOUI至药敏板中放入35.5。培养箱中培养一周读取MIC值真菌菌种鉴定一、实验具体步骤1.总基因组

38、DNA的提取（需4h）（1）丝状真菌DNA提取1 .将Emonophora接种于PDA斜面培养基上，于28培养7天；2 .取菌体，转移至1.5mL离心管，加入5mm铁珠子或者磁珠子，加入200l缓冲液GA,放入匀浆机，65V,90s,匀浆三次；3 .剩下的操作参考试剂盒（酵母基因组DNA提取试剂盒，货号：DP30）,4 .加入20lProteinaseK溶液，混匀。5 .加入220l缓冲液GB,充分颠倒混匀，70C放置IOmin,溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能

39、导致提取DNA量少和提取的DNA不纯。6 .加220IJl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。7 .将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000印111（13,400乂8）离心305。，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8 .向吸附柱CB3中加入500l缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（-13,400g）离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中（2）酵母菌DNA提取完全参照试剂盒操作（酵母基因组DNA提取试剂盒，货号：DP30）o2 .PCR扩展ITS片段及跑琼

40、脂糠胶（需3.5h）引物：ITSI和ITS4程序：一般：在93预变性3-5min,进入循环扩增阶段：93C40s-*55C30s-*720C60s,循环30-35次，最后在72C保温7min。不同真菌的ITS片段大小是不一样的，大小在500-75ObP之间，个别在IooO左右PCR结束后，120V,30min跑胶，跑胶结束后照胶，确定条带后送公司测序。3 .分析测序结果在NCBI上进行序列比对，结合菌落形态确定正确的菌种。二、实验流程DNA提取（4h）PCR（2.5h）跑胶（5Omin）曝光（IOmin）送测序1 .皮肤单细胞悬液制备（小鼠或人样本）（共计时长34h）皮肤组织去脂肪或脱毛处理（

41、10-2Omin）3dispase酶液真表皮分离（50-6Omin）真皮、表皮剪碎（Iomin）胶原酶消化表皮（Ih）.真皮（2h）处理消化后的组织液，清洗细胞（20-30min）Note:若目标是免疫细胞，处理真皮需要进行PerColI富集，另需时长约1h。2 .流式细胞术表面分子染色（共计时长1h+3minX样本数）已完成制备的单细胞悬液-Fc受体阻断剂封闭（10-2Omin）今加入表面分子荧光抗体孵育（30min）今清洗、过滤细胞（2Omin）I流式上机分析（每个样本2-3min）3 .流式细胞术胞内染色（共计时长6.5h+3minX样本数）已完成制备的单细胞悬液铺板加入PMAZinom

42、ycin刺激剂、brefeldin阻断剂孵育（4h）收集、清洗细胞（2Omin）加入表面分子荧光抗体孵育（3Omin）清洗细胞（10min）加入固定破膜剂ICbUffer孵育（30min）清洗细胞（IOmin）加入胞内分子荧光抗体孵育（30min）分清洗、过滤细胞（2Omin）流式上机分析（每个样本2-3min）4 .流式细胞术核内染色（共计时长2.5h+3minX样本数）已完成制备的单细胞悬液fFc受体阻断剂封闭（10-2Omin）今加入表面分子荧光抗体孵育（3Omin）清洗细胞（IOmin）加入核内固定破膜剂孵育（30min）清洗细胞（IOmin）3加入核内分子荧光抗体孵育（30min）分

43、清洗、过滤细胞（20min）流式上机分析（每个样本2-3min）5 .流式细胞术调亡检测（共计时长L5h+3minX样本数）已完成制备的单细胞悬液今FC受体阻断剂封闭（10-2Omin）I加入表面分子荧光抗体孵育（3Omin）清洗细胞（2Omin）加入annexinV抗体孵育（15min）清洗、过滤细胞（2Omin）流式上机分析（每个样本2-3min）6 .流式细胞术分选（共计时长lh+30minX样本数）已完成制备的单细胞悬液TFc受体阻断剂封闭（10-2Omin）f加入表面分子荧光抗体孵育（3Omin）今清洗、过滤细胞（2Omin）3流式上机分选（每个样本30min）7 .巨噬细胞吞噬实验（共计时长1.5h+3minX样本数）已完成制备的单细胞悬液（2X10八6mL）分组加入FrrC-DeXtran孵育（60min）清洗、过滤细胞（20min）流式上机分析（每个样本2-3min）