T_CRHA 052-2024 基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术.docx

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1、ICS11.100CCSC(M团体T/CRHA0522024基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术Eva1.uationofdrug-inducedhepatotoxicitybasedonhuman1.iverorganoids2024-05-20实施2024-05-15发布目次前古II引吉IIII1范国12规范性引用文件13术语和定义I4端略语25一般规定26评价内容及流程57评价报告及结果解释10附录A（资料性）S药物的肝脏毒性评价实验方案12附录B（资料性）S药物的肝脏毒性评价报告16参考文献19本文件按照GB,T1.1-2020必标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则给

2、出的规则起草，请注意本文件的某些内容可能涉及专利“本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中国研究型医院学会肝胆腆外科专业委员会提出.本文件由中国研究型医院学会归口。本文件起草单位：清华大学附属北京清华长庚医院、中国食品药品检定研究院、中国计埴科学研究院、中国医学科学院药物研究所、中国科学院上海药物研究所、南方医科大学、上海美迪西生物医药股份有限公司。本文件主要起草人：王祖芳、柳娟、明雯球、李迪耿娱超、王晶、傅博强、磔桂芬、潘国宇、彭双清、李桦、毕出嫦。药物不良反应是个匝要的匾床问题，也是卫生系统的主要经济负担和制的行业面临的巨大挑战，弱源性肝扭伤（dmginduced1.iveri

3、njury,DIU）是临床上以常见的约物不良反应之一，也是当前急性肝损伤最为常见的病因之一，严重苕可导致急性肝衰避、甚至死亡.目前的临床前药物试验程序难以有效的值测患者是否发生DI1.I,评价模型和技术的缺乏是造成药物研发失败率高的主要原因.采用合理、有效的模型预测药物药物相互作用及漕在D1.1.1.是制药领域面临的严竣科学挑战。传统二维培养的肝细胞（系）模型过于简单、不具法牛理特性而无法再现药物体内发生的相对杂的代谢与掰性事件,而人源肝肚类器官作为药物代谢及药物毒性预测的模型，能够更真实地反映候选药物对人体的影响，同时可以减少动物研究所致的偏差.近期,美国优品药品监督管理局发布了减少药物临床

4、试舱前的动物试验,而鼓励微组织与器富芯）；列为替代模型的指导原则，实际上，人源肝脏类器官模型已有许多公司和机构用于药物筛选及评价，但其发屣仍存在一些技术观莅障碍。本文件的制定有助于推动法于人源肝脏类渊也的药物肝脏安全性评价的标准化建设.助力行业规范发展.I1.1.基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术使用本文件的人员应有正果实SE做实Ii1.S本文件林指出所有可幡安全使用看者责任果通的安全和urn.并保国&合有关法械定的条件.本文件给出了基于人源肝脏类器官开展药物体外肝脏毒性评价的股规定、评价内容及流程、评价报告及结果鼾择要求。本文件适用干医药企业、科研机构等试脸人员开展基于人源肝脏类器官肝

5、细胞脂肪变和胆汁淤积相关的药物肝脏揖性评价.本文件的试验方法适用于IJN1.板，其它孔数的多孔板可参考本文件。卷引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注口期的引用文件，仅该日期对应的版木适用于本文件；不注日期的引用文件，其展新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBT16&!6.52017医疗器械生物学泮价第5部分：体外细胞毒性试验（ISO1（1993-5:2009）TCSCB00082021.原代人肝细胞3*三*X下列术语和定义适用于本文件，3.1AJKSff1.t类*huno用来评怙某种物质或药物对肝脏功能的潜在危害程度的过程。这种评价可以通过多种

6、方法进行，包括体外实验、动物模型和临床观察。3.4剂量反应关系dos。responsere1.ationship药物解第剂业与生物效应之间的关系，通常使用剂量反应曲线来描述.3.5对fiK18contro1.group在进行肝脏毒理学评价时,为便于与实5金组进行比较而设立的一组参照物质或实5金样本.它是一种不含受试物的介质，在进行受试物处理时放置于与试脂样品相同的器InI中,并在与试粉样品相同的条件下进行处理，3.6实3样本experimenta1.samp1.e在肝脏毒理学评价中用于进行分析、观察和5金证的被沏试物质或物体的代表性样品。3.7MMS*31.ventb1.ank为检i实骁中可能

7、产生的笄景噪苦或误差而设货的，不含待测物或对照品的介质，用以确保实蕤结果的准确性和可施性.来源：GBT16886.52017,3.3,有修改4语下列缩路谱适用于本文件.A1.B白蛋白(A1.bumin)A1.T谷内转我的(A1.aninetransaminase)AOP彳f害结局路径(AdVCrSCoutcomepathway)AST谷草转凝fi(ASPartatetransaminase)QFDA5-氯甲基荧光素皤酸图(S-ChIOtun?Ihy1.1.Iuorcsccindiacetate)CYP$细胞色素iP450(CytochromcP450enzymesyscm)DMOS二甲基亚SM

8、(Dimethy1.Su1.foxide)FBS胎牛血清(RHbovinesern)GSH谷胱甘肽(GIuta1.hione)HCS的内涵筛选(Highcontentscreening)MMI1线粒体膜电位(MiIoChOndria1.mCmbranCpotentia1.)P/S-竹毒素-钺有素(Penici1.Iin-StreiMomycin)ROS活性氧(Reactiveoxygenspecies)5-51三U试剂选择如下:a)细胞活力检测试剂应使用细胞活力检测试剂盒：b)生化指标检测试剂应使用谷内转氨制A1.IYGPT)试剂食和谷孽转找除AST/GOT)试剂盒：O生化指标检测试剂宜根据肝

9、脏损伤的毒性结局类型，优先推存抽测细旭活率、细照揩亡、脂肪性病变和胆汁淤枳，1个肝毒性评价指标，主要检捌指标及对应检测试剂见下表】。衰1HCS试中此取册聊ttwm*Detect100indicator烫光探针F1.grcentprobe叱班长/发射波长Excitationwav1.mth/三issiQWve1.ength细息活率Ca1.CeinANHthD-I495/515n11reen)495/635rm(red)加飒阳亡Ca5pase-37502/5M1111rocn)版海面貌与微蛆期面职的比值:指滴急荧光强设IjMj1.1.织向枳的比坐Ni1.eRed54358rm(red)形成的变川管

10、面枳Vift组织Ifii税的比值：微粗管,均发光强度CMH)A492/517n11Cgrc1.探针（4M）的无血清培养郴7C（避光）再向30min;2）用无荧光探针的空白培养基进行多次Hi”半数换液操作以去除未结合游离探针的干扰：3）每孔加入1001.H含2X的HoeChSt（Iogm1.）的无血清培养基37C（避光）孵育10min,b）Caspase-37和NiIeRed染色D在药物加样板（见图5,肝脏毒性检测板）的第五列至第七列加入100U1.含2X的Caspaw-3/7探针（200nM）和Ni1.eRed探针（5UM）的无由酒培养基37C（避光）再育30min:2）用无荧光探针的空白培养

11、基进行多次理发半数换液操作以去除未结合游离探针的干扰：3）每孔加入100W含2X的HOeChWIom1.）的无血清培养唯37C（避光）解FnQmin,C）CN1.FDA染色D在药物加样板（见图5,肝脏毒性检测板）的第八列至第十例加入100I含2X的CMFDA探针（30PM）的无曲洁培养基37C（避光）督育30niin;2）用无荧光探针的空白培养基进行多次求半数换液操作以去除未结合游离探针的干扰：3）在无血消培养基中孵育45min:4）每孔加入100P1.含2X的HOeChSt（IOHRZn1.D的无血清培养基37C（避光）再仔10min.e.7.2%三m用无荧光探针的空白培养基进行多次理复半数

12、焕液操作以去除未结合游离探针的干扰.6.7.3 %nm使用高内涵细胞定M成像分析系统或荧光显微镜的对应通道对人源肝脏类器官进行成像，其中Ca1.ceinAM的激发波长/发射波长为495/515nm、EthD-I的激发波长/发射波长为495/635皿Caspase-3/7的激发波长/发射波长为50250nn、NikRCd的激发波长/发射波长为543/598n11CMFDA的激发波长/发射波长为492/517皿Ibechst的激发波长/发射波长为）16/4601111）.&8则!分析&11脑活力分析a）计算CTG法细胞相对活力，见公式（1）:RCVWR期曲组引空白）AFI总照组节空6）X/侬（1）

13、式中：RCV:细胞相对活力：FI加药组：具有细胞、Crc试剂和药物溶液的孔的发光值：F1.空：具有培养基和CTG试剂而没有细胞的孔的发光值；FI对照组：具有细胞、CrG试剂而没有药物溶液的孔的发光值：b）使H1.EXCd或G111phPadPriMn绘制制种筠物的样品剂盘反应关系曲线.&2生化指揖分析6.&21计IWUI上演A1.TD根据6.6.1中所测标准曲线,按照试剂盒说明件提供的计算方法进行计算:2）使用EXCeI或GraPhPadPrism绘制每种药物的样品剂史反应关系曲线.6.82.2计算蒯I1.h清ASTD根据6.6.1所测标准曲线,按照试剂盒说明书提供的计算方法进行计算：2）使用

14、EXCd或GraPhPadpriSm绘制每种药物的样品剂值反应关系曲线.6.8.3多套敷分析6.831使用育内BB像分析软件或者ImageJ软件定量每个视IrF各遢道（CaICeinAM、EthD小Ni1.eRed.CISPaSe-3。、CMFDA和HOeChS1.）阳性（染色）细脆的数量和荧光强度，至少计数25个税野。应计以以卜内容：i）计算活细施数i与死细胞数量的百分比，见公式（2）:X=NCakCinAMR1.NHhD1.PCIOCT（2）式中：X：活细胞数我与死细胞数量的百分比：NCJeinAM_PC:活细胞数量：ND1.D-IF:死细胞数陆2）计舞Caspase3/7阳性（染色）细胞

15、的平均荧光强度.见公式（3）:RCMHWr7-IiC俨wm3,1.,:HCiSM*3+:CaSaSe-3/7阳性（染色）细胞的平均荧光强度：RCiw*r37总：Cg-3/7阳性细扭的总荧光强1%S:微祖织的面积3）计算NiIeRCd阳性（染色）细胞的平均荧光强度，见公式（4）:F1.M1.eRCdsRMkRciX）MK.*“-”！/O式中：HNi1.cRcd+:Ni1.eRCd阳性（染色）细胞的平均荧光强度：F1.NI1.eRCd总：NikRa1.阳性细胞的总荧光强度：S:微组织的面积.4计算CMFDA阳性（染色）细胞的平均荧光强度，见公式（5）:FXWDA.2FmRMQ，6M（45式中：FI

16、CMFDA+:CMFDA阳性（染色）细胞的平均荧光强度：HCMFDA：CMH）A阳性细胞的总荧光强度：S:做组织的面积.6.83.2计算阳性细胞的百分比和阳性的胸的平均灵光强度（以为Xs表示），并用Exce1.*GraphPadPrism绘制待测药物的样品剂显反应关系曲线.7讦价报告及结果解骅7.1 讦价报告应记录药物评价试脸相关信息，撰写评价报告，评价报告内容和格式参见附录B,评价报告内容包括但不限于：a）试验概述，包括对肝脏毒性评价的般本目的和原则的用述，以及细胞实验的相关信息，b）药物信息,包括药物的名林、理化性状、配制方法和所用浓度等，C）试脸设计，详细描述人源肝脏类器官的制备过程,药

17、物的种类、浓度以及试脸的持续时间等信息，以确保试验的科学性和可鸵性，d）试验方法，简述肝脏毒性评价的操作步蛛和所用统计学方法，以及结果判定标准，O测定指标及设备，详细列出本试脸中测定的各指标，包括细胞活力读数,生化指标,以及细制活率、细胞凋亡、脂肪变性和胆汁淤积这四种染色评价指标的测定方法及主要检测仪器的名称和型号.D检测结果，相适当的统计表格列出各项指标的测定结果，包括细胞活力读数，牛.化指标，以及细胞活率、细胞渊亡、脂肪变性和胆汁淤积四种染色评价指标的结果.）评价结果解读，对所使用的药物对人源肝脏类器官的毒性进行合理新样，包括对毒性机制进行分析和讨论,并提出所得结论.h）其它，包括贡献者、

18、参考文献等内容。7.2 瑚IUM应从试验结果给出药物时人源肝脏类器官毒性影响结论，解杼肝脏损伤与剂M响应关系，给出毒性具体表现及肝脏减毒反应，解降药物对肝脏表现出的剂量依赖关系的毒性作用.附录AS药物的肝胎毒性评价实!昉案A.1本实验以HcPaRG细胞三维培葬形成的人源肝脏类器官为例，针对药物S进行肝脏性评价的实验需求，拟定如下具体操作方案.通过此评价,旨在充分了解S药物对人体肝脏的潜在毒性，并为相关领域的研究提供实证支持。A.2材料和方法A.2.I侬用此标准评估S药物对人源肝脏类器官的肝脏揖性作用。A.2.2试剂A.2.21礴活力检窝试剂Ce1.1.Tiier-GIoQ1.uminescen

19、tCe1.1.Viabi1.ityASsay（Ce1.ITiterGtoQ发光法细胞活力检测试剂盒,简称CTG）A.2.2.2谷丙转轨葩（A1.T/GPD试剂盒和谷草转氨除（STG0T）试剂盒A.2.2.3用于细胞影像检测肝毒性筛选的检测试剂检涌指标Detectionindicator荧光探针F1.uorescentprobe激发波长/发射波长Excitationwave1.ength/esissiwave1.ength细胞活率Ca1.ceinAMEthD-I495/51511m(green)495/635nn(red)细胞超亡Caspase-3/7502/530nra(green)脂洸面积与

20、微组织面积的比做：膈酒总荧光强度与微如织面积的比伯Ni1.eRed543/598n三(red)形成的微胆管面枳与微组织面枳的比值：微胆管平均荧光强度CMEI492/517tun(green)A23材料a）构建人源肝脏类器官的细胞：HepaRG,无支原体污染b）特测药物：S药物c）Wi1.1.iams,EMCdiUm培养基（不含谷城施胺）d）FBS（胎牛血清）吉蠹素O锥霉素g）0.05%胰蛋白险-EDTAh）璘酸缓冲液（PBS）i）蒸储水或任何适合细胞培养的纯化水j）谷氨配胺k）胰岛素D氧化可的松儿24仪。见第7章。A.3准备工作3.1.（K述所有涉及的溶剂（培养基以外）、玻瑞跳皿及其他实验材料

21、部应进行灭菌处理，以防止细菌和其他微生物的污染。此外，所有操作都必须在无菌条件下，使用符合生物安全标准的无菌操作台进行，以确保实脸结果不受到外界干扰因素的影响。A.3.2培养*用于培养HePaRG细胞系和人源肝脏类器官的培养基：10%胎牛血清（IHS）:90%DMEM;1001U/ni.青霉素：1MgJm1.链森索；-2mM谷氨醍胺；5Nnm1.朋岛索：0.5制级化可的松。A.3.3WMtnA33.1Gtt黛苏和墙界a）从冷冻细胞库中取出需要恢亚的细触样本,并放置于低温水浴中快速解：b）将败解后的细胞转移到含有适当培养基的高心管中，并进行融哲离心使细胞沉淀在您心管底端,去除上清液：C）用5m1

22、.培养将（I仍FBS）重悬细胞，并转移到10Cm的培养皿中，放置在标准培养条件下的培养箱中培养：由每两天用PBS洗:三次细胞,并换液。注：发苏后的第一代培养过程中，细胞可能生长缓慢0所以一旦更苏,在实般之前细窗要传代至少两次。A.3.3.2MtRa）用PBS洗涤3次细胞以去除细胞外活性物质和培养基残留.b）加入适量的假懒，进行细鼬消化.在消化过程中控制消化时间,待细胞在显微镜下呈现圈缩时停止消化，并加入含RS的培养基以终止消化。C）用吸管粒转吹打细胞，将细胞从培养皿中吹打下来，并将细胞和培养培等混合物转移至离心管中。注意避免吸入过多液体，以免影响后续岗心效果，由迸行轻柔的离心，般建议采用400

23、E岗心2min的程序。过程中应尽同避免离心速度太高，以减少对细胞的机桢损伤。e）弃去上清液，用新鲜的培养基Ift新悬浮细胞，使细胞能够恢宏生长并维续进行传代培罪。D选择1:4或1:5的比例来进行传代，以确保细胞住新的培养条件下能够获得更好的生长状态.注：细胞传代培养通常应该控制传代次数不应超过3个月,以避免细胞发生异常。A.3.13*H胞生长状态期a）取生长状态良好的细胞.果用一股传代方法进行消化,制成细胞悬液：b）计数,精确地将细胞分别接种于2130个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜）.每瓶或孔细胞总数要求一致,加入培养液的量也要一致：C）每天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均

24、值。培养7天。出以培养时间为横轴,细胞数为纵轴（对数）,描绘在半时数座标纸I.连接成曲线后即为该细胞的生长曲线，并通过统计学方法对数据进行分析，得出细胞生长规律，生长曲线斜率即为细胞生长速率。按照92币的步骤用不同浓度的待测S药物处理人源肝脏类器力21h用显微镜或高内涵在明场卜检变人源肝脏类器官，记录下细恂的状态和形态，A-6评价S药物对人寡肝!类育的肝脏毒性作用a）按照9.4章使用细胞活力试剂CTG处理人源肝脏类器宜,检测人源肝脏类涔官的活性.b）按照9.5章使用A1.T和AST试剂盒检测人源叶脏类器官的培养上清检测人源肝脏类潜盲的受损程度.c）按照9.6章使用Ca1.CCinAM探针和Ed

25、DI探针、CaSPaSC-3/7探针和Ni1.CRcdW.以及CMFDA探针处理人源肝脏类器官,利用高内涵成像系统或荧光显微镀的对应通道对人稼肝脏类器甘进行成像，多参数评价药物S的肝脏毒性.A.7敷蠹及评价续累解谀见附录B,附录B（资料性）S药物的肝脏毒性评价报告BJ试验期述本研究的主要目的是评估S药物对人海肝脏类器官的川脏毒性作用.以HePaRG培养出的人源肝脏类器官为实验对象，使用不同浓度的S药物进行处理，通过细胞活性检测，以及细胞死亡、细胞凋亡、脂肪变性以及胆汁淤枳等多参故评价方法，进行全面的肝脏揖性普伯.8.2 药物信息根据药物说明书用培养基充分溶解S药物到储存浓度IOmM。本试检中的

26、使用浓度分别为：1.92M.9.6M.HXM.44UM.1500M.8.3 试验设计见A.4章.以卜是用IkPaRG培养的人就肝肺类器盲的质控结果：a.A1.B阳性率:98%.HNF4A阳性率:95:b.白蛋白分泌：100Ong（106细胞24h）;c.药物代谢梅功能.内在消除率：280U1.（106细胞h）8.4 试脸方法见ASA.6章。8.5 测定指标及设备测定指标见第IO章.本试验中检刈用到的主要仪涔是：Si内涵图像采集分析工作站，T7820,使用OPerattaHigh-COntCntImagingSyStem获取细胞球图像,harmonySOftWarC分析数据.B.6榜测结果1.1

27、.1 S药物对人源肝脏类翳言活性的影响通过用Ce1.ITiterYIO发光法细胞活力检测试剂盒检测不同浓度的S药物和ASP（阴性对照）对人源肝脏类器官的影响，结果如图B.I所示，附着S约物浓度逐渐升高，细胞活力逐渐下降，S药物的ICSO值为2.6151.*M.一心除1棚心IHit*Gb发柳拉活力分析方法分析不同浓蜘瞰对人硼朋类器醐的细超初.1.1.2 S药物对人源肝脏类器官生化指标的影响通过用A1.r和AST检测试剂盒检测不同浓度的S药物对人就肝脏类器官生化指标的影响,结果如图B.2所示，陨着S药物浓度逐渐升高,A1.T和AST择放盘U若增加。西MMtNS物WfIm匐SA1.mN的1.1.3

28、%我评价药的肝毒性为了探索S药物相关的肝用性的潜在册伤途径,Hf人源肝脏类器口法型于6种不同浓成的S药物21h后，用选定的荧光探针染色用广高内涵分析，培于获得的共聚焦图像，对3D层扫图像多层挣加后计算每个参数的指标.b.63.1SKtt对人珈ffHMHg活率的影响用CH1.CeinAM探叶和E1.hDT探针则育不同浓度的S药物处理的人源川脏炎器官，使用高内涵成像并使用高内涵分析软件分析数据，结果如图所示，1.*S药材浓僮逐渐升高，人海肝脏突器盲中的活细胞与死细胞的比例显著降好.闲BUtS辍H1.Uro后制U3死百分比与代裁HB像a6.3.2用CasPae3探针和NiIeRCd探针的育不同浓度的S药物处理的人源肝脏类滞官，使用高内涵成像并使用高内涵分析软件分析数据，结果如图所