YY_T 0870.8-2024 医疗器械遗传毒性试验 第8部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验.docx

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1、ICS11.040.01CCSC30YY中华人民共和国医药行业标准YY/T0870.82024医疗器械遗传毒性试验第8部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验Testforgenotoxicityofmedica1.devices-Part8:UnSChedU1.edDNAsynthesistestwithmamma1.ian1.iverce1.1.sinvivo2025-07-202024-07-08发布国家药品监督管理局发布本文件按照GB，T1.12020标准化工作林则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件是YY/T08704医疗洪械遗传毒性试胎3的第8部分。YY/T0

2、870已经发布了以下部:分： 第1部分：细菌网复突变试验： 第2部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验： 第3部分：用小限淋巴痛细他进行的TK基因突变试验： -第4部分：哺%物IWE细胞微核试蕤； 第5部分：哺乳动物骨骼染色体喷变试验；第6部分：体外哺乳动物细胞微核试瞪： 第7部分：哺乳动物体内碱性芸星试验： 第8部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成读请注意本文件的某N内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的贡任。本文件由国家药M监督管理局提出本文件由全国医疗器械生物学W价标准化技术委员会（SAe,，TC2481归口。本文件起草单位：山东省医疗器械和药M包装检验研究院、上海交通大学

3、医学院附属第九人民医院、北京市医疗器械脍研究院（北京市医用生物防护装备检般研究中心）.本文件主要起草人：王鸾鸾,刘肝、宋伟、孙般、张奥褚祥宇、车国喜.GBT1688&3中给出的检测潜在遗传毒性物质的试验方法，未给出详细的成验步附因此不适宜直接用于医疗器械的检浏.YY/T0870根据医疗器械的特性给出r详细的试验步骤，可作为GB.T168863中遗传毒性试验的补充方法标准.本文件提供J种评价医疗器随产生的哺乳动物体内遗传库性效应的方法，以确定医疗器械可能产生的DNA损伤及修更情况，YYZ0870旨在建立医疗器械遗传毒性的具体试脸方法,拟由8个部分构成“一第1部分：细语回更突变试脸,目的在于给出医

4、疗器械/材料细茵回复突变试验的详细试脸方法。第2部分：体外哺乳动物细鼬染色体埼变试验.目的在于给出医疗器撷材料体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的详细试验方法.一第3部分：用小鼠淋巴痛细胞进行的TK基因突变试脸.目的在于给出医疗器械/材料用小网淋巴病细胞进行的TK基因突变试验的详细试验方法.第1部分：哺孔动物骨崩红细胞做核酸。1：1的在丁蛤出医疗器械/材料哺札动物H燧红细胞做核试验的详细试验方法.第5部分：哺乳动物骨谶染色体畸变试验。I1.的在于给出医疗洪械/材料槽孔动物骨施染色体畸变试蛉的详细试验方法。兼部分：体外哺乳动物细泡微核试验.目的在于给出医疗跳械/材料体外响乳动物细胞微核试验的详细试验

5、方法。一第7部分：哺乳动物体内域性彗星试脸。目的在于给出医疗落械,材料哺乳动物体内题性彗星试验的详细试验方法。一第8部分：体内哺乳动物肝细胞程序外D、A合成试验.目的在给出医疗器械体内哺孔动物肝细胞程序外DNA合成试骏的详细试验方法。医疗器械遗传毒性试验第8部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验1范围本文件描述r医疗器械体内响乳动物肝细胞程序外DNA合成试验方法.本文件适用于通过测定医疗器械引起的晒乳动物IH细胞程序外DNA损伤.评价医疗涔械是否具有潜在遗传毒性作用.注：纳米材料的体内喧乱动物UfM匏程序外DNA合成试验可能.需要对本文件中的方法进行特定的倏iT,但本文件松予描述.2规范

6、性引用文件下列文件中的内容通过文中的燃范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注H期的引用文f1.-.仅该日期对应的版本适用干本文件：不注日期的引用文件.其最新版本（包括所有的蟋改单）适用于本文件.GB14925实验动物环境及设施GB1T16886.2医疗器械生物学评价第2部分：动物福利要求GB16886.3医疗涔械生物学评价第3部分：遗传而性、致症性和生殖毒性试裟GB1T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制需与参照材料3#WWtXGBTI68863和GB,T16886.12界定的以及下列术语和定义适用于本文件.3.1程序外DNA合成unschedu1.edDNASynthe

7、Sis;1.：DS发生在细胞周期的S期半保留DNA程序合成之外的DNA合成。体内嗜乳动物肝细胞UDS试验是利用唬乳动物进行的体内体细胞遗传毒理学试验,其测定取决于DNA损伤部位切除和取代的驮基的数Ik相较于“短程修红”（1对一3对诚基）.UDS试验对“长程修更“（20时30对喊翦）具有较高的破呼性。UDS试脸可检测整个基因组UJ!性较裔，因此对于DNA损伤未修更、错配脩更或错发制存效的突变而无法充分如实反映其DNA悻女过程的情况，可能有所补偿。UDS试验的遗传学终点为引细胞发生的DNA损伤及其后的修更.将新分面的哺乳动物肝细施较于含有5乙快基2脱钝尿音（EdU）的培养基中培养一段时间,如果受试

8、物造成细胞DNA损伤.可引起细恂的自主性DNA修发,在修更过程中EdU整合到DNA链中，在Cu+的作用卜与含有荧光探针标记的叠氨化合物发生点击反应（叩一价铜催化的叠翅基与海基焕发生的共价反应），新合成的I）XA被荧光探针所标记.通过荧光强度观察EdU的掺入录.评价医疗器械潜在的致突变性.5主要设备CO2培养箱、荧光显微镜等。6试剂I型胶旗蛋白前（0.0鬼、Hanks平衡盐溶液、磷酸盐谖冲液（不含Ca?+、Mg?+）、细胞培养液、台盼蓝、固定液（如4%的多聚甲醛）、洗涤液（如含3%牛血清白蛋白的硝酸缓冲盐溶液）、通透液如含0.於聚乙二酹辛基米基良（TntOnX-100）的磷酸缓冲盐溶液、市售的E

9、dU细胞增殖检测试剂盒.注：推荐使Iq市售的固定液、洗洗液、通透液试剂自。7 mM7.1 总体要求所有的动物试验均应在经国家认可机构认可的实验室内进行，并应遵守与实5金动物福利有关的全部适用法规，以符合GB，T16886.2的要求.这些研究应在良好实抬室质M管理规范或其他经批准的质盘保证体系的控制下进行.7.2 MX选用SPF级电康初成年岫齿类动物,推荐使用大鼠（6周的一12周龄）.每组至少3只可供分析的动物.如已有充分的对照数据库,则同时进行的阴性对照组和阳性对照组可用】只或2只动物.试验开始时，动初体质差异应不超过同种性别平均体重的土2奥。选用常规饲料.禁水不限制。如果受试物掺入饲料进行染

10、毒，应选择适当的饲料以保证受试物充分混合，动物可单独饲养或同性别分小组茏券,实验动物饲界条件应符合GB14925的有关规定”注：如在进行本试验时.已有资料我明同一品系、相同的踹途径,在d洞性炭之间遗传毒性无至别，I!川单TJ（优先用城性动物即可，8 WAM宜根抵GB,T16886.12的原则制备试验液.宜使用适宜的极性和/或其极性溶剂作为浸提介质，若使用未经充分确认的浸提介质，应提供相应的数据支持资料来表明它们与试检样品和试粉系统之间的相容性并排除浸提介质自身的遗传毒性.当最高浓度的试紧液（即试照样品斑液或103的浸提晚液试验结果为阴性时，可考虑单剂业组试验.采用其他多剂肽试验或剂属反应试验时

11、，宜对试验所果用的剂量范用提供相应的支持性数据.9对K样品*a阴性对照选用不加试验样品的何批号浸提介质，在相同条件下制备。9 .2RttMM座选择适宜的阳性对照剂Jft以得到阳性结果，阳性对照物举例见式1.阳性对照与实验动物的接触途径可不同于试粉样品与实脸动物的接触途径。如有充分理由时也可采用其他适宜的阳性对照物，1阳性对I1.咐*例SKfiFHfB1.化学物化学物质登记号早期采样2h-1h出二甲延蚯硝胺62-755晚期采样12h-16h2-乙帙氨板坊539-3注I2二甲拢亚硝胺拴林慈馈木桶糅，接触浓度为280IIg小g;2-乙酸额蛆荷椎杼落肝介或为我乙二/WO,接M濯度为50吹吐10 3未处

12、理对M1.如不能证实所用没提介质不具布致突变性，还需谀未处理时照.10KttMRttQt如怀疑试验样品可能对实验动物产生毒性时，应进行预试验.宜设置3个剂/水平（较低剂员一股应为高剂IS的5侬25%）,横盍从最大到小或无毒性的剂属范围.高剂Jit组应是产生明显毒性的剂W.高于该剂业即有可能引起动物死亡，m2tMHbi根据试验样品预期的人体接触途径设计台道的接触途径以确保与利器官充分接触，如峥脓注射、0腔注射、皮下注射等.通常采用单次接触.立根据实物动物的体重来确定样品接触最大单剂量体枳.样品接触最大单剂量体积的选择见GBrr16886.112021中表B.1.3mum*通常接触动物后2h-4h

13、（即早期采样）和12h1.6h（即晚期采样）制在肝细府,如在接触后的任一时期得到的试粉结果为阳性，则不必进行另一时期的后续步探，根据已有的有代动力学资料也可来用其他采样时间，采用胶原蛋门曲漉注法分熟肝细胞后，推荐果用台附蓝染色计数测定阴性对照组肝细胞存活率，结果应大于50%。KUWWHMA合成的M定宜根据下列操作步骡进行桧测：a）新鲜分离的肝细旭（推荐细胞浓度为IX1.C1.，个m1.）放入含有彘玻片的培养皿或黑色细胞培养板中,在含有EdU的培养液中进行短期孵育（通常不超过细胞周期的10%左右的时间,推荐2hb）弃去培养皿中的培笄液，并加入固定液在室温下进行固定：C）弃去囚定液.用洗涤液洗涤细

14、施：d）弃去洗涤液，加入通透液在室温解刊细脆：c）弃去通透液加入洗涤液洗溜细胞.弃去洗澄液,加入反应液（含荧光探针等标记的亮氮化物的溶液）避光期仔细胞：f）弃去反应液，用洗涤液洗涤细胞，弃去洗滋液，加入与细胞核结合的桀色剂对细胞进行核染色：弃去染色液,用洗涤液洗涤细胞：h）通过荧光显微悔对细胞进行观察拍照.注：具体的操作步骤见所购试剂盒的晚作说明书.10.5最终每只动物至少从2个标本中选择100个形态正常（细胞形状完整等）的细胞.通过荧光显微镜观察各细胞的荧光强度以进行UDS评价，如单只动物细胞计数少于100个，应说明理由。11敷与飨果评价I1.1.9MX采用适宜的图像软件测定用反应液标记的细

15、胞核的平均荧光凝度，扣除细胞背景假（即细胤顷荧光速度）,得到此细胞的净平均荧光强度.净平均荧光强度用于评价细胞程序外DNA的损伤.采用适当的统计学方法进行分析，以评价试脂样品对DNA的损伤作用，it2雄果评价与Im评价阳性和阴性反应的标准如下：a）阳性反应：与阴性对照如相比，净平均荧光强吱有统计学意义的显著增加或超过历史阴性对照数据就困且有明显的剂盘反应关系（若有剂J组）；b）阴性反应：与阴性时照组相比，净平均荧光强度无统计学意义的显著增加或结果在历史阴性对照数据范围内且无明显的剂M:一一反应关系（若有剂M级），阳性反应表明在本试粉体系中试粉样品送粉液能诱导哺兄动物肝细胞DNA的损伤：阴性反应

16、表明在本试舞体系中试验样品试骁液不能i秀导喃乳动物肝细胞DNA的扭伤，在少数情况下，所得到的资料不能判断试验样品是否诱壮哺乳动物肝细胞程序外DW损伤时，可使用优化试验条件（例如，剂届间隔、其他给药途径、其他采样时间等）进行乘狂试验或皆对额外的肝细胞进行评价以建立生物学相关性12试报告试粉报告中宜包含卜列信息。a）试验样品；来源、批号、有效口期循用时八b）介质。c）实验动物：实物动物的种属、品系、级别、数量、体重、性别、梆实脸动触梆环境：实险动物设施使用许可证号.d）试聆条件：- 剂破和组别：TJ途径.幽周期、观察指标：- -肝细胞制备和培养方法：- -培界温度和时间：阳性和阴性时照物的最终浓度

17、：分析细胞的数目.O结果：阴性（溶剂/介质和阳性对照资料（浓度/剂量和溶剂）;统计学分析：结果的讨论。0站出，叁考文献IGB.T16886.11-2021医疗涔械生物学评价第11部分：全身毒性试验2JOECD486(1997)体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试的3AgnicszkaPicr7ynska-Mach,M.(2OI2),Subnuc1.earIOCa1.imionJagandeffectivenessofUVC-induccdunschedu1.edDNAsynthesisvisua1.izedbyf1.uorescenceWidCf1.C1.d.confoca1.andsuper-reso1.utionmicroscopy.Vo1.15.NO.8.1156-1167.