免疫分型 基础介绍.docx

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1、近年来白血癌的免监分5S已成为诊断血液恶性g:白血病母跑回收姣好并可能杼到富集,同时去除死缩抱.但费时，白血病殖抱的相对叛率蛟谁分析,某些IS登细威解体可疑选择性丢先依据密度梯度原理,若白血病细意没有与淋巴细施用像的浮力密度即可旗去失.所以用此方法时应检位各层细胞特性以防止骏胞的丢失.。脏细胞悬液样本外观：有严峻溶血和1凝块的标本可畿会有白i三的损坏以与班跑亚群的丢失或变更,应弃用.如胎丢失IQ分布：曲认细胞形态和原始标本相像.密度梯度离心之后史应松西细胞分布.可做血涂片推i.诵胞计数和浓度调整:厂家举荐的抗体浓度通常是假定陋胞数量在正常范国内(500,000-1,000.000ZtestAb

2、).白细胞数量上的显著支更会带来染色模式的变更.而白血病标本径常有异样的白细胞数量，管BS标本也可能被外触幅程,这些标本的如制性可施有极大的变异.因此有些标本没有足够的细施像流式分析，有些则由于细照员大，正常浓度下的抗体相对不足，不能饱和全部的结合位点,导致胃阳慢给果.所以染色前腌胞计数持别必要.举行方法：WBC2u1.t用稀释至(2)(3)危围内.骨髓标本经常要在PBS1:10稀得后计数.应当指出，由于不同的标本中不同系列的纽朋比例不同，调整细胞总数不确定合适桁一个系列特异的抗体.试桧室若选择不同于厂家举荐的方法(知自己稀释抗体)，抗体确定须要进行能试以得到抗体和细胞的霰住映.0野甜：死细胞

3、对很多抗体用而异性染色,有些抗原同时存在于拘朕和膨浆,这就使样本例S胞活性桧3S变得重要，演舲楸?顺我奔流脑骨浜痛4病原硬模用请用潞便沆?薄龈用悔椒US辛街郑阂皇梢笠领牧庾朗股跟豪?糜MS玖蛾1.7AAD或EMA(ethidiummonoacide1；构胞将拒染这些染料.此方法的优势是班8S表面标记和活性分析可同时迸行.通过设门即可得到活踊的染色特性.尤其适用于高度坏死的样本.样本染色后需固定.应在加固定剂之前洗去多余的7AD,以保证区分的是固定前纽抱的死活状态.但BS前时间延长.7AAD会在固定的细胞群体重新安排，死;舌细胞的区分变睚.对于染色后常规固定并在固定后12，J时以上分析的标本,最

4、好用EMA.EMA与死维抱DNA整定的共价结合保证了长时何固定后仍倭很好地区分回定前的死活状态.二是手工检测：运用TryPanbIUe或其他雌活性蝴.（4）ff1.胞染色重细胞表面染色：大多数可帮助白血病免疫分型的抗原都在弱胞膜上.但由于很多抗原也同时存在细胞内，所以在细他表面抗原检测时应特殊留意保持细胞S!的完整以保证检测的特异性.例如免疫球宏白重链在钻BS内和表面的存在有誓不同的意义，检测表面标记2碇未1.三定的活IS胞.细胞内染色:有延胞内特异性抗原的检测对白血洗的殛分平尤为甲妾,SDTdT1MPO,cCD3,cCD22,以与抱装内的表区胞内染色的关Se是使纽抱股通透，把抗体导入胞浆而不

5、影响细胞结构的完整性.要保证固定和透蝴步塞不膨响有关标记的抗原性以与和抗体的结合.胞！薪口胞内的向时染色：通常,先抱腴染色，固定，08通道和.Ifi内染色,最终是DNA染色.固定剂和通透剂部可旎对妞袍和参数有不同的多箪影叫,应依空状况选择.每T染色对荧光素的选择和抗体的选择而很不要.如，用于装面标百英光素应不被随后的固定和通透步要所影响，而对于胞内染色,所用的荧光素应足够小能穿透到胞妆内.3.抗体蛆合的珑定：选择抗体田合的技术性考电：基于血液肝痛的困难性,供应一个通用的抗体选择策略是不现实的.国际上迄今也没有一样性的抗体组合.应当意识到，没有一个物的既小又功能齐全的抗体蛆合可以解决全部的I版床

6、相关答案,一个局限性的小组合也可能影响对样本的正确评估和分关.逸认纽胞异样的实力与所用抗体的数量干脆成正比.。婚择抗体组合的基本陵贝下：1）所选的抗体组合应足够宽，可以湖IJ样本中的全s三e亚群包店正常和异样群体.抗体的数越买，桧测的灵坡度越高,应当指出，由于8摊细抱经甯缺少细胞的正常标记或表达异样，所以特异性抗体烧定程度上的近复选择有时是必要的.2 ）抗体的选建皮可以区分正常1异样细眼，正常细胸可作为试脸的内卷照，异样细胞的表达比例也更胸肌如现在用CD45抗体来区分正常和而S翅胞.此方法尤其在无趣细胞含少时更显优势，3 ）荧光强度和表位密度应同时考电对表达少隹抗原关位应尽可能因耀度褒的荧光嬴

7、4 ）必要时用;甜检8瞰除死细抱较强的非特异性染色，国外统计,约70%组织样本和48%面或仲M标本有活性检测结果.5 ）礴人员应了解所用抗体的反应纽抱谱,以与与特定英光素结合后的染色哽式，相同的CD编号的不同抗体可能有不同的结合模式.（2滞用的方案考虑：大而全的抗体组合：全面了期抗原表达,无高级外染色.省时但费用高.先用箍查试剂了解释本的一般状况,再依据所得信息采纳其次线相异性更高的抗体姐.足济，但酬，也须要正确的抗体选择的策略性确定.但考虑到所用时间和设母费用，只有约30%汐卜通S室采纳此法.基于S床或形态学的贡料，选用有目标性的抗体组合以磅认可疑的诊断或分类.4 .样本获得通常，每个标本应

8、获得1-2x104个有核细胞的荧光和幽力光号,微，J选余病变分析则需5x104个姐胤恶性细胞觉有较宽的大小和粒度范闽,获得时最好收集无门的纹据以保留全部未知异样细期展的全部特性.免安荧光信号要求对数放大和至少256道的跻E蟀.无论迭释减或线性放大都要以保证异样细胞都旎被检测到.5 .数驾分析只有通过多参数分析,才能最大程度地区分异质的样本中的正丽异标细胞.各参数分析敕球若综合细胞的光散射和多色荧光特征.最少的要求应是4个参政（2个光散射和2个荧光鲂数1采纳的参数越多，分析步腕困逃,流式免疫分里的灵散度越高.分析技术：数据的分析方式的样本的珞性.抗体组合与曲床状况的不同而变更.但总的原则是要用多

9、费数的数娓创建可以区分正常和异样细胞的图形，如FSCvs.SSC,F1.vs.F1.Sattervs.F1.等，散射光与英光鲂数的综合分析经常能供应骏的值总.（2）分析步骤：首先分析全部辘的抗原表达状况，接别出正雉期胞和异样细胞群体,正常组胞的表现可以作为整个试珍染色过程的内部卷点,供应试肮一样性与否的客观证据,异样细眼则通过进一步设门分析确定表率特点.设门:即选择特殊的细胞群体分析其各个轮数的表现,是一个基本的分析技巧.把分析舄限在门内的短抱群体的前提是门内的细胞代表全83倍爱好的细胞,而且没有其蝌胞的污染.TS来说,不同疾病的设门第BS亦不同，常用的FSCvs.SSC的设门方式可能不总是适

10、用于1.&1.分析，如在急性白血氏中,CD45和SSC的双参数显示是鉴别无圾细照的一个简洁而有效的方法在B细廊W巴痫中用一个全B纸胞的抗体设门来看抗曲IftSAX链的表现；T细胞潜巴施时用一个全T细g抗体设门使脖癌细胞的分生更加弟确.另外,通过如胞特异的抗原表达确定其光敢射区域的backgate的方j去也很好用，如通过CD14vs.CD45的双等数分析区分多个区域的淋巴.单修和粒如明群体.（4）分析异样细献节体：确定异样细胞群体后要进一步分析其免梭分型.分析抗原表达要国意：在1.&1.中，定性的描述（阳性或阳性）通常要t匕阳性百分率的计翁更有价伯.只有在设门内细抱全部是感爱好的绢抱而且荧光分布

11、的形蕊可以特别消断地区分阳性和阴性亚群的状况下，阳性百分率才有意义.当然，在某些抗原异质表达的群体中，可进行定性或定量的分析（X%无理细胞CDX阳性）；百分率也可用于描述异样和正常细胞的比例.评估抗原表达强度是分析的歪要组成部分,对于一个特异的抗体而古,荧光强度是抗原宓度的反映，同时也与所用的灵光索和独特的荧光素抗体爱合物有关.有时确认异样群体是因为没有表达应当趣的抗原，但有时只能从抗陵袤达的异样强度来函.如用一些髓性抗原CD14.CD33,CDW65的相对表达强度和散射光郴ET来确认单核维胞系丽细胞系的发IS成熟过程.英比强度的评估在大多数状况下可以采纳定性的资料.但由于试剂即机器上的不同，

12、仅仅基于荧光道数的简洁标准可能并不足够,最好以其在相同条件下相对正常侬的强度来表示.如CD45,CD8或CD38等在不同组胞上的表达施度相差几个对数范围.CD22或CD4等抗原SW在所谓阳性范围内在不同妞胞类型上的区分蛟小.区第弓阳径和明性密体：在臬些状况下对诊断有较大的价值,如B细胞看住肿痛的CD5弱表达,但弱表达的推断却经常很港.现行的标准为NO%阳性等都仍是人为的标准,依呼组方图上与比照组相比向右移动来推断阳性所需的霰小位移也是人为的标准.可用K-S统计来比较直方图的区分.亦可选用强的荧光SfeH,或用过未标的抗体IB断三困异染色,从而推断弱阳性染色的特异与否.6 .数据说明虽然对流式免段分型结果的说明最好与形态学结果综合考虑,但流式的作用仍远远多于对形态学结果的沽证明.流式可能招助形态学珑认某些诊断,也可能提出之前没有考虑的诊断,甚至在一些典生表现下流式免疫分型可以在其他方法的协助下诊断疾病,但应尽0说明任何流式结果和其他方法结果上的不一样，流式结果应与S床.形态学、细胞13传等其他方法综合考电.