免疫荧光检测.docx

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1、免疫荧光技术(检测抗核抗体(ANA)的试验方案)荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂,用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定址测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下干脆视察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间辨别荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等C本次试验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。抗核抗体(antinuc1.earantibody,ANA)乂称抗核酸抗原抗体

2、，是一组将自身其核细胞的各种成分脱辄核糖核发白(DNP)、DNA.可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为杷抗原的自身抗体的总称，能与全部动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。抗核抗体试验原理以小鼠肝细胞或某些培育细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。假如血清中含有ANA,就会与细胞核成分特异性结合、加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜F可见细胞核部位呈现荧光。试剂与器材1 .抗原片现多用商品试剂。如需自行制备，方法如下：(1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，

3、用滤纸吸F渗出的浆液。将切面轻压于战玻片上，使其在战被片上留下薄层肝细胞。冷风吹干，乙醉固定，冰箱可保存】周。Hep-2细胞抗原片制备：HeP-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。经相宜培有在载破片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培育基。F燥后，用无水乙醇固定。（3）肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚41.-301保存备用。2 .异硫（酸荧光素（F1.TC）标记的抗人IgG抗体（F1.TC-抗人IgG抗体）有商品供应，临用时按效价稀释。3 .0.01mo1.1.pH7.2PBS4,缓冲甘油取甘油9份加PBS1份。5 .待测血清、阳性和阴性比照血清临床标本筛选获得。6 .器材荧光显微镜、孵箱、有盖

4、湿盒、染色缸、吸管、试管等操作方法1 .打算：检查加样板，生物裁片豆原室温，标记。2 .稀释：PBS-TWeen缓冲液稀稀血清，设阴阳性比照C3 .加样：加样板放于泡沫塑料板上，加25m稀释后血消，至加样板的每一反应区，避开气泡。加完全部标本后起先温育。4 .温育：将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应起先，室温温育30分钟o5 .冲洗：用烧杯盛PBS-TWeen缓冲液流水冲洗生物薄片，然后马上将其浸入盛有PBS-TWeen缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。6 .加样：滴加201.荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一干净加样板的反应区，完全加完方可接着温育荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PB

5、S-TWeen缓冲液稀释。7 .冲洗：用烧杯盛PBS-TWeen缓冲液流水冲洗生物薄片，然后马上聘其浸入盛有PBS-TWeen缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。8 .封片：将盖片干脆放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至盖片：每反应区约101.o从PBS-TWeen缓冲液中取出1张生物薄片，用纸擦F背面和四边。还耍擦拭反应区间隙将生物薄片面朝下放在已打算好的盖玻片上，马上杳看并调整使盖片嵌入载片的凹槽中。然后接着下1张。结果判定荧光显微镜下视察1.细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。2,依

6、据细胞核着染色荧光的图像，可区分为：均质型：细胞核呈匀称样的荧光；周边型（核膜型）：细胞核四冏呈现荧光；斑点型（颗粒型）：细胞核内呈现施点状荧光；核仁型：核仁部分呈现荧光。混合型：两种以上核染色；应用细胞片做抗原片可检出着点型（ACA）留意事项1 .PBS-Tween缓冲液在4下可存放两周。2 .依据每次试验的标本量确定须要稀释的F1.TC标记的抗人球蛋白的量,稀释后可在4CF可存放1周。3 .血清或F1.TC标记的抗人Ig应滴加至加样板上，不能F脆滴到我片上。4 .载片盖到加样板上后，确保反应区与液滴完全接触后，才起先记时温育。5 .冲洗载片时水流要缓慢，以免冲洗掉基庾。载片上的反应区应保持

7、潮湿，不要将载片风干。6 .封片进不行用力挤压盖玻片，以免损坏基质。可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片叫槽里。7 .封片介质含有荧光稳定剂，应保存在2-8C。封好的栽片可于4C长期保存。试验探讨方法评价间接免疫荧光技术是检测ANA用常用的方法。该方法简便、敏感，且可依据核染色形态确定核抗原的类型。鼠肝印片细胞分布不匀称，多有重叠，冲洗时易丢失“HeP-2细胞具有核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明显.、具备人源性抗原的特征，对诊断和鉴别不同类型的自身免疫病非常有利。检测抗核抗体(ANA)的试验方案ANA简介抗核抗体(antinuc1.earantibodies,ANAs)经典定义：针对细胞核成分

8、的一大组抗体滑。抗核抗体新概念(FANA)传统定义：顾名思义是指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称狭义定义现代定义：是指抗细胞内全部抗原成分的自身抗体的总称。对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸（nuc1.eicacid）和核蛋白（nuc1.eoprotein）抗体的总称广义定义能抗原分布：细胞核细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期抗核抗体检测方法检测细胞内抗原自身抗体“金标准”一I1.FANA检测方法进展：仅限于I1.F改良法（底物选择、制备方法）试图将E1.1.SA发推广为最基本的筛选方法未获胜利复制细胞抗原全部成分极其困难抗原存在的相对浓度、自然抗原确定簇的二级结构与高级结构荧

9、光染色模型可初步推断相应抗体性质范囤或确定抗体特异性IIF法：HEp-2细胞底物（90%以上试验室采纳）# 完整的ANAS抗原谱（细胞核、浆、骨架、周期）# 可预料分析ANA靶抗原范闱# 阅历性强E1.ISA法：采纳高度纯化抗原或全细胞抗原# 抗原谱有限（十余种）# 假阴性结果#操作简洁快速其他方法：金标法、比浊法ANA靶抗原多核甘酸：双链DNA、单链DNA、RNA组蛋白：H1.,H2,H2B,H3,H4,H2A-H2B复合物核浆的核糖核蛋白:U1.-nRNP、Sm.SS-A(Ro).SS-B(1.a).Ku、Mi-KMi-2、核点、增殖性细胞核抗原核仁抗原:SCI-70、U3-nRNP/原纤

10、维蛋白、RNA多聚酶I、PM-SC1.(PM-1)、7-2-RNP(TO)4-6-S-RNA、核仁形成中心(NoR)核膜抗原：板层索(层粘连蛋白)若丝点：着丝点蛋白ANA检出率与年龄和性别有关与个体的免疫稳定性相关运用足够敏感的方法，每个人都可检测出一些ANA.自然ANA生理性自身免疫维持机体内环境的生理稳定.滴度较低，亲和力弱，大多为IgM型。ANA检测方法初筛抗核抗体：IIF最佳基质：联合生物薄片（HEP-2细胞/猴肝冰冻组织）区分抗核抗体的把抗原：E1.ISA、印迹法和免疫印迹法ANA初筛IFT:HEp-2细胞/灵长类肝脏完整的抗原诺（细胞核与细胞求）可预料靶抗原帮助检测其它项目（如AN

11、CA、ENA）E1.ISA：采纳高度纯化的抗原初筛ANA抗原谱有限操作简洁快速间接免疫美光法生物薄片技术采纳滴定平板技术进行间接免疫荧光试验为r使试验操作标准化，欧蒙开发r滴定平板技术？：滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片栽片盖布加样板表面的凹槽里，这时，载片上的全部生物薄片均与液滴接触，反应同时起先。系统的儿何结构确定r液滴的位置和高度。因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再须嘤传统的“湿盒”。并且可在样的反应条件下同时温育任何数地的标本。打算：检杳加样板是否反应区亲水而周边硫水？假如不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可运用家用洗涤剂或EXtranMAOI(默克公司)，再用水彻底

12、冲洗。须要消祢时，可于3%的SckuscptExtra(汉高公司)中浸泡1小时。只方当载片平衡到室温后方可打开袋F。不要触与生物薄片。依据要求用记号笔对玻片进行标记。稀释：依据试剂盒运用说明稀释血清标本。每次试验均需加入阳性和阴性比照。比照血消运用前必需混匀。加样：在加样板的每个反应区加入稀释血清，避开产生气泡。滴加完全部待测标本后才起先温育(一次最多20。份)。运用聚苯乙烯加样板。加样体积：101.反应区(3X3mm)251.反应区(5X5mm)70口1/反应区(7X9mm)温育：将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即起先。确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触,室温温育30

13、分钟。清洗：用烧杯盛PBS-TWeen缓冲液，流水冲洗栽片，然后马上放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。冲洗1秒钟小杯内浸洗5分钟加样：将荧光标记的抗人免疫球蛋白(的结合物)加入干净加样板的每个反应区。完全加完全部的.抗后，方可接着温育(最多可加50个载片)。运用连续加样器。加样前应运用加样器混匀。为节约时间，可在第一步温育的同时滴加醐结合物至另一个加样板的反应区中。加样体枳：10W/反应区(3X3mm)201.反应区(5X5mm)601.反应区(7X9mm)温育：从PBS-TWeen清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，马上将栽片覆有生物薄片的面朝

14、下，盖在加样板的凹槽里。留意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。检杳生物薄片是否与液滴接触良好，然后按着下一张。从现在起先，裙意避开阳光直射栽片。室温温育30分钟。清洗：用烧杯盛PBS-TWeen缓冲液，流水冲洗载片，然后马上放入装有PBS-TWeen缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。可在每150m1.磷酸盐缓冲液中加10滴(1501.)伊文氏蓝进行复染。冲洗1秒钟小杯内浸洗5分钟封片：在盖玻片上滴加甘油/PBS。运用聚星乙烯封片板。从PBS-TWeen清洗缓冲液中取出一张战片，用纸擦干背面和四边，留意不要擦拭反应区间隙。将栽片的生物薄片朝下置于打算好的盖玻片上，马上检查盖玻片是否放入载片的凹

15、槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。然后再进行下一个栽片的操作。封片体积：103/反应区(3X3mm)101.反应区(5X5mm)201.反应区(7X9mm)结果推断：荧光显微镜卜.视察荧光。详细操作荧光工作台的布置清洗清洗栽片的擦拭封片ANA的结果间接免疫荧光法的独特优势（一种基质-可筛杳上仃种不同的抗体）用HEp-2细胞检测自身抗体ANA荧光模型核均质型核仁型核颗粒型胞浆型ANA确认试验（1）IFT:-HEP-2细胞/灵长类肝脏：特殊的荧光模型如若丝点、核膜型、核糖体P蛋白、肌动蛋白E1.ISA:-ANA分项（含ENA谙）：包被高度纯化抗原斑点法/印迹法-ENA谱:采纳各种高度纯化的抗原

16、E1.ISA：抗ENA谱印迹法：抗ENA滑EuroirhunRHT1.田杭Pwfi1.p1.usSc1.-70SmSS-ASS-BJo-1Contro1.band印迹法：抗ENA谱免疫印迹法ANA确认试验（2）Westemb1.ot:HEp-2细胞提取物- 定性- 相宜特殊须要（如区分靶抗原R。52或R。60）- 检测目前无法纯化的靶抗原的抗体（如PM-SC1、Ku）结论初筛试验：免疫荧光技术（HEP-2细胞/灵长类肝脏）E1.ISA（纯化的多种核抗原）ANA阳性率（）95-10080-10010010020-4020-5085-9530-50确认试验：E1.ISA印迹法斑点法Westemb1

17、.otANA谙与相关疾病相关疾病的ANA请ANA的各种荧光模型、靶抗原与相关性高滴度的ANA仅出现在自身免疫性疾病中自身免疫性疾病系统性红斑狼疮活动期非活动期药物诱导的红斑狼疮混合性结缔组织拓类风湿性关节炎进行性系统性硬化症多发性肌炎与皮肌炎干燥综合征慢性活动性肝炎70-80溃疡性结肠炎70-80其它风湿病26S1.E抗核抗体的检出率靶抗原检出率()dsDNA30-90Sm5-30核糖体P货白5-15周期蛋白I(PCNA)3ssDNA70-95组蛋白40-80U1.-nRNP15-40SS-A20-60SS-B10-20Ku5-10心磷脂、b2-GP1.20-40抗细胞抗体荧光模型Gmmuno

18、f1.uorescentpattern)常见的荧光染色模型有6种:核均质型(homogeneouspattern,H)核颗粒型(GranUIOgUSpattern,S)核仁型(nuc1.eouspattern,N)核膜型(membranouspattern,M)着丝点型(CentrOmertpattern,ACA)胞浆型(cytop1.asmicpattern,ACYA)HEp-2细胞/灵长类肝脏：核均质型ssDNA/dsDNA阳抗原：单链、非自然DNA（嗦吟和嘴嘘诊基对）双链、自然DNA（脱氧核糖核酸结构）相关性：ssDNA类风湿80.8%干燥综合征44.0%皮肌炎12.3%类风湿性关节炎5

19、1.7%献血员6.8%S1.E30%-90%抗dsDNA：绿蝇短膜虫组蛋白靶抗原：组蛋白H1.、H2A、H2B、H3、H4（主要抗原H1.和H2B）功能：形成核小体相关性：药物诱导性1.E:100%（唯一的标记抗体）其它风湿性疾病：少见HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗RNP/SmU1.-nRNP靶抗原：与U1.FRNA连接的3个蛋白分子(70K、A和C蛋白)功能：切割pre-mRNA相关性：MCTD:95%-100%S1.E:15%-40%抗Sm抗体靶抗原：与UI-、U2-、U4-、U5-或U6-nRNA连接的6种不同蛋白分子(coreproteinsB,B,D,E,F,G)功能：切割pre-m

20、RNA相关性：S1.E:5%-30%HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗核糖体P蛋白抗核糖体P蛋白抗体抗原：核糖体的亚单位（60S）,3个蛋白分子组成:PO、PKP2（38、19、17kDa）。在碳末端具有相像的免峻反应表位。功能：蛋白合成易位过程中的辅蛋白相关性：S1.E:5%-15%原发性干燥综合征的抗体谱靶抗原阳性率（）SS-A40-95SS-B40-95ssDNA40-95HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗SS-A/SS-B抗SS-A抗体靶抗原：与Y1.,Y3,Y4或Y5型RNA连接的2个蛋白(52kDa和60kDa)功能：调整mRNA的转译活性相关性：干燥综合征：40%-95%S1.E:20%

21、-60%抗SS-B抗体靶抗原：与小分子RNA(U6-RNA,pre-tRNA)结合的磷脂发白(48kDa)功能：RNA多聚酶III的辅蛋白相关性：干燥综合征：40%-95%S1.E:10%-20%进行性系统性硬化征的抗体谱靶抗原阳性率()ssDNA30-60原纤维蛋白5-10RNA聚合悔4PM-Sc1.（重拄综合征）3NOR-90（核仁形成区）少见Ku（多肌炎型重叠综合征）1-7HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗着丝点抗体抗若丝点抗体和抗原：连接动粒（着丝点）上的4个蛋白分子：A-、B-、C-、D-蛋白，分子量（17、80、140、50kDa）主要的靶抗原：着丝点B蛋白（与HFT相关性：100%）

22、功能：与纺锤体纤维连接相关性：硬皮病：18%局限性硬化征(CREST综合征):80%-95%HEP-2细胞/灵长类肝脏：抗Sc1.-70抗Sc1.-70抗体靶抗原：DNA拓扑异构酶I(100kDa)功能：DNA豆制和翻译过程的辅蛋白相关性：硬皮病：25%-75%抗PM-Sc1.抗体犯抗原：多个蛋白分子的电合物主要的靶抗原100kDa（与DNA拓扑异构醐I不同）功能：未知相关性：硬皮病：2%-5%肌炎：8%重登综合征：24%HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗RNA多聚酶RNA多聚酣I、11和11I靶抗原：多个蛋白亚单位组成的核仁酶复合物功能：多聚醒I：转录rRNA基因多聚醐II:转求mRNA基因多聚

23、酶III：转录tRNA基因相关性：硬皮病：4%HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗原纤维货白抗原纤维蛋白（U3-nRNP）抗体靶抗原：与基础蛋白（34kDa）连接的U3-nRNA和其它5个蛋白功能：分别pre-rRNA相关性：皮肌炎：5%-10%HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗NORHEp-2细胞/是长类肝脏：抗KU多肌炎和皮肌炎的抗体谱靶抗原阳性率（）40-50ssDNAJo-I25-35PM-Sc1.（重登综合征）8Mi-25Ku（带硬皮病的重叠综合征）1-7P1.-7、P1.-12、OJ.EJ、KJ2-3HEp-2细胞/灵长类肝脏:抗Jo-IJo-I靶抗原：组包酰tRNA合成酶（50kDa）细胞

24、浆磷脂蛋白功能：将锐基酸与相应的tRNA连接相关性：多肌炎、皮肌炎25%-35%伴有肺间质纤维化的多肌炎70%原发性胆汁性肝硬化的身抗体谱靶抗原阳性率()AMAM2AMAM4AMAM985-9540-6035Sp-100(nuc1.eardots)30Actin10-20HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗线粒体抗AMAM2抗体靶抗原：含3个不同的酰基转移能的多酶复合物:- 丙酮酸脱氢醐(74kDa)- 2-耐酸脱氧酶(50kDa)- 2-酮戊酸脱氢懒(50kDa)蛋白X(52kDa),与丙酮酸脱氢酶豆合物相关相关性：PBC:85%-95%HEp-2细胞/灵长类肝脏:核点型HEp-2细胞/大鼠肾:核

25、点型/AMAHEp-2细胞/灵长类肝脏：若丝点+核点型HEP-2细胞/展长类肝脏：抗肌动蛋白HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗核膜型联合a生物薄片（HEP-2/猴肝冰冻组织切片）检测到的些少见的特殊的荧光模型与细胞周期相关的荧光模型HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗周期蛋臼IHEp-2细胞/灵长类肝脏：抗周期蛋白IIHEP-2细胞/灵长类肝脏：中心粒HEp-2细胞/灵长类肝脏：中间体细胞浆中的抗体HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗溶版体抗体HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗高尔基体HEP-2细胞/灵长类肝脏：抗波形蛋白灵K类肝脏：抗肌内膜抗体灵K类肝脏：抗胆管抗体汉长类肝脏：ANCAc-ANCA阳性P-ANCA阳性