白鲜内生菌多样性及其产活性成分能力初步研究.docx

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1、编号（学号）:169240058毕业论文题目：白鲜内生菌多样性及其产活性成分能力初步研究毕业论文（设计）任务书论文（设计）题目白鲜内生菌多样性及其产活性成分能力初步研究下发任务日期2015.5.15学生姓名焦文莉指导教师郝宁一 .论文（设计）主要内容采用组织分离法对白鲜植物组织内生菌多样性进行研究，并对分离纯化得到的内生在菌进行扩繁和发醉，初步提取其代谢产物，利用T1.C法对其进行初步分高鉴定分析，旨在明确白鲜内生菌种群多样性及内牛.菌产生活性成分的能力，为后续内生菌活性成分分离鉴定葵定前期研究基础。二 .论文（设计）的基本要求1 .有关资料的收集：要求尽量收集到有关药用植物内生菌研究进展和其

2、代谢产物的分掰鉴定：白鲜有效成分的分离鉴定以及白鲜内生菌的研究进屣的第一手资料，资料要其实、可靠、有代表性。2 .资料的整理与分析：要求图片清晰、结果明确，数据分析详尽。3 .杳阅相关文献：要求以内生菌和白鲜为中心，收集全面、有参考价值。4 .认我撰写论文，字数在K）OoO字以上三.论文（设计）工作进度安排阶段论文（设计）各阶段名称日期1实验方案的设计与完善2015.5-2015.62黄柏叶斑病病害调查及症状观测2015.7-2015.1()3黄柏叶斑病病原菌分离纯化及保存2015.10-2016.124黄柏叶斑病病原菌牛.物学特性研究2016.3-2016.45黄柏叶斑病病原菌鉴定2016.

3、4-2016.56修改论文，准备答辩2015.5-2015.6*四.应收集的资料及主要参考文献(指导教师指定)(1 SangUnPark,Hyoun-Sub1.imet.a1.Funga1.EndophytesfromThreeCu1.trvarsofPanaxginsengMeyerCu1.tivatedinKorea(J)J.GinsengRes.x201236(1.):107-113.(2 Young-HwanPark,SOOrVGU1.eeet.a1.DiversityofFunga1.EndophytesinVariousTissuesofPanaxginsengMeyerCu1.t

4、ivatedinKorea(J.JGinsengRes,2012,36(2):211-217.(3 Young-HwanParkzYoungChangK1.met.a1.Age-dependentDistributionofFunga1.EndophytesInPanaxginsengRootsCu1.tivatedinKoreap.JGinsengRes,2012,36(3):327-333.(4 1.iMa,YongHongCaoet.a1.Phy1.ogeneticdiversityofbacteria1.endophytesofPanaxnotoginsengwithantagonis

5、ticcharacteristicstowardspathogensofrootrotdiseasecomp1.exJ).Antonievan1.eeuwenhoekz2013,103:299-312.(5 HaoWu,Hong-YanYanget.a1.DiversityofendophyticfungifromrootsofPanaxginsengandthersaponinyie1.dcapacitiesJ.SpringerP1.us,2013r2:107.(6胡凯，谈锋,等.南方红豆杉中产紫杉醉内生的分离和葡选西南师范大学学报(自然科学版)，2006,31:134/37.7方芳，戴传超

6、,等.茅苍术悬浮细胞系建立及内生真浮饶导子对其及内油积JK的影响川.中草菊2009,40(3):452-455(8)张薇.人参根际土壤真菌与内生真菌的多样性及人参它件生物傕化活性菌株的筛选A).辽宁师范大学硕士学位论文0江宇:江宁师范大学,2011:1-81.(9)刘丽姐,郝芳芳白鲜内牛.两分离与培养U1.广东农业科学,2012,20:149-150.(10朱利霞,张汉扬,等.白鲜皮药材的质量标准研究川.中华中医的学刊,2015,33:155-158.说明I此任务由指导教师填写一式两份，一份发给学生，一份发给指导效即留存.沈阳农业大学毕业论文（设计）选题审批表选题名称黄柏叶斑病病原菌鉴定及生物

7、学特性研究题目来源教册自选学力169240058姓名焦文莉专业中草药栽培与鉴定指导教师郝宁职称讲师沈阳农业大学毕业论文（设计）考核表论文题目：黄柏叶班病病原菌鉴定及生物学特性研究姓名：焦文莉学号：169240058专业：中草药栽培与鉴定指导教师评语:指导教师（签字）：年月日答辩委员会意见:主任委员（签字）：成绩:年.月曰黄柏又名关黄柏，川黄柏，为芸香科植物黄皮树Phe1.1.odendronChinenSeSchneid.或黄梨Phe1.IodendronUmUrenSeRUPr的干燥树皮。黄树皮主产我国四川、贵州等省。黄菜主产吉林、辽宁、黑龙江等省。黄柏性寒味苦,主肾、膀胱经,具有清热燥湿、

8、泻火解毒、消退虚热的功效,主要用来治疗黄疸、胃肠道疾病。黄柏中活性成分主要有生物喊类，柠檬忒素类以及俗醉类三大类。近年来对于黄柏活性成分及其提取物的进一步研尢，黄柏中药根碱有很好的降血压作用，黄柏的提取物有良好的抗癌作用。在原生态的野生环境下，杂草丛生，相互隔离，药用植物病害种类很少，即使发生也不易流行。随着对黄柏功效研究的进一步深入，共.栽培面枳不断扩大，导致叶斑病病害日趋严宙，危杏黄柏的正常牛.长，使其产量逐年卜降，品质劣化。病害一直是影响药用植物产晶和痂量的重要限制因素。对于收获叶的药材.叶部病害可以说是直接降低产域，当叶部痛击严重时，少了叶部的光合营养吸收，植株直接枯萎死亡，其危害程度

9、可见一斑。叶斑病病害发生区域广泛，在世界各地均有危害，病原菌种类多样,寄生性强，寄主植物广泛，除危害药用植物外，对粮食作物及油料作物均有不同程度危害，如玉米灰斑病、花生.褐斑病等，可广泛寄生于芸乔科、木兰科、银杏科、马兜竹科、毛良科等植物。叶斑病作为危害药用植物的重要病害，常见有灰斑病、网斑病、褐斑病、黑斑病、叶枯病以及斑枯病等，主要危宙植物叶部，有时也危杏叶柄及茎杆，发病初期，叶片上常产生灰白色、浅黄色、黄褐色、暗褐色、黑褐色至黑色不等病部理点，呈圆形、椭圆形或类圆形，初发时斑点小，后斑点逐渐扩大，有时中心灰白色或灰褐色，有的病斑上可见明显轮纹，边缘有黄色至黑色孽圈，病部常发现有黑色小点，为

10、病菌的分生抱子器,发病后期病斑常汇合成不规则大理，潮湿条件下，叶背面常出现黑色毒层，老病理中央穿孔或有同心轮纹，严重发病时叶片枯萎，畸形，引起早起落叶，更有息者引起茎部病斑，导致植株地上部分枯萎，植株死亡。近年来关于黄柏的研究主要集中在牛理生化指标测定以及其中药根碱等有效成分的提取及病理作用等方面，但对丁黄柏叶斑病的研究目前还未见报道，针对目前黄柏生产中存在的向题，本研究对黄柏叶斑病进行病原菌分离，采用形态学鉴定以及分子鉴定两种方法对黄柏叶斑病的病原菌进行鉴定，对黄柏叶斑病病原菌的生物学特性进行系统的研究，了解其菌丝和饱了生长的最适条件，自在为病宙的发生及防治等研究葵定基础及提供理论依据。并以

11、空白培养基为对照，各处理30片叶.重史2次。格培养基置J25C恒温培养箱中，并注感保持培养基内湿度，待叶片发病后，记录发病叶片数，计算病情指数。1.3.2活体接种法选取健康的黄柏植铢盆栽，聘叶片用75%乙醇涂洗，晾干后将1.2中分离纯化得到的菌株，打取适宜大小的菌饼，分别采取直接接菌和刺伤接菌将菌饼接到叶片上，并以空白培养基为对照，套袋保湿。每个处理3株，每株10片叶,重宓2次。待叶片发病后记录发病叶片数数，计算病情指数.1.4 病原菌鉴定1.4.1 形态学鉴定将分离纯化后得到的菌株分别接种在PDA与MEA培养基上，25C恒温光照培养，4-10天后观察PDA与MEA培养基上曲落形态与菌落大小。

12、15天后观察MEA培养基分生抱子器若生位置并记录其数量，刮取分生他了催制成玻片,在光学显微镜下观察分生抱了器的形状、大小以及分生抱子的形状和大小,有无油球，产抱细胞的特征。1.4.2 形态学笠定依据观察菌落形态、颜色:分生抱了笔的形状,大小：分生胞子的形状和大小及产胞细胞的特征,根据中国真：曲志第卜五卷球壳抱目室点痂属叶点新属M白金销2003)及PhOmaIdentificationManua1.!(Boeremaeta1.2004)进行病原菌的鉴定。1.4.3 窗丝体的培养、收集将在PDA上活化七天后的病原菌，在无菌条件下，取10个直径为Icm的曲饼于PD中，震荡培养7天，过晚后，将菌饼分离

13、，取雨丝于30C烘箱烘干备用。1.4.4 DNA提取采用试剂盒法，按照试剂盒说明步骤提取病原菌DNA.,1.4.5 PCR扩增ITS序列分析1.5 病原菌生物学特性1.5.1 兔子萌发历程将病原菌的分生电子用无菌水配制抱子悬浮液.池子悬浮液滴丁凹玻片上251C保湿培养，分别在2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h,24h检查池子萌发情况，每次检100个施子，以芽管长度超过抱了直径半作为萌发标准。以确定他子萌发最佳时期以及抱子最佳观测期.1.5.2 培养基对菌丝生长、胞子萌发及产胞量的影响将病原菌分别接种于PDA、PSA,PNA.0A.CZA、MEA六种培

14、养基上，25C持续光照培养，采用卜字交叉法每两天测量一次菌落直径，每个处理克第3次。在上述6种培养基生长15天后，分别加入IOm1.无菌水，用无菌被璃棒将分生抱子器刮破，使分生抱子充分拜放在无曲水中，吸取至无菌试管中定容至20m1.,充分麴荡制成菌悬液，用血球计数罂统计池子数量。1.5.3 温度对菌丝生长、产苑量及胞子萌发的影响在菌落边缘取直径为5mm的菌饼，接种于PDA平板中央位置，设5、10、15、20、25、30、35C的温度梯度，菌落直径测定方法同1.5.2。在MEA培养基上接种直径5闻的菌饼，置丁10、15、20、25、30C不同温度的光照培养箱中持续光照培养，15d后检查分生胞子器

15、产生的数量及成熟分生抱子落的数量，他子数星测定同1.5.2。无菌水制备池子悬浮液，滴加在凹玻片上，分别置T5、10、15、20、25、30、35匕的恒温箱中培养，在h后镜检，每次检100个泡子，每个处理克匏三次，计算抱子萌发率。1.5.4 光照对丝生长、疳子萌爱及产胞量的影响将病原菌接种于PDA平板中央，分别设置光周期为全光照、121.2h光暗交替、全黑暗，置于25C培养，菌落宜径与产抱量测定方法同1.5.2。在MEA培养基上接种直径5间的菌侨.光周期设置同上，置丁25C培养，分生抱子器与胞子数量的测定同1.5.3o用无菌水制备抱了悬浮液，滴加在凹玻片上，分别设置光周期为全光照、12h光暗交替

16、、全黑喑并F25C的恒温箱中培养，在h后镀检，每次检100个抱子，每个处理设三次重复，计算泡子前发率。1.5.5 PH对丝生长、胞子萌发及产布的影响用ImO1.儿的IIC1.和1.mo1.1.的NaOH调节PDA培养基的pH梯度为3、4,5、6、7、8、9、10.11,置于25*C恒温培养，菌落直径测定方法同1.5.2。用1.mo1.1.的HC1.和Imo1/1.NaOH调节MEA培养基的PH梯度同上，置于25七恒温培养，分生的子器与抱子数量的测定同1.5.3.用InIO1./1.的HC1.和ImoI/1.的NaoH调节菌悬液的PH梆度为3、4、5、6、7、8,9、10.11,于25C恒温培养

17、.在一一h后测定施了萌发率，每次检100个胞子，每个处理设三个重熨。1.5.6 C源对菌丝生长、胞子萌发及产胞量的影响以察氏培养基为基础培养基，分别用葡荀糖、乳糖、麦芽糖、半乳犍、甘诺糖、果糖等处替换察氏培养基中的蔗融作为碳源，以察氏培养基为对照，25C恒温箱内培养，菌落直径与池子数量测定方法同1.5.2。将上述含有不同碳源的培养基除去琼脂，制成培养液，分别与抱子悬浮液等体积混合，滴于凹坡片上培养，在h后进行镜检，测定其萌发率，每次检100个孩子，每个处理设V个重品.1.5.7 N源对窗丝生长、施子萌发及产范置的彩响以察氏培养基为基础培养基，分别以酵母粉、蛋白豚、甘氨酸、赖鸵酸、苯丙氨酸、散酸

18、钺、筑化彼等量置换察氏培养基中的硝酸钠作为怒源，以察氏培养基为对照，25C恒温箱内培养，菌落直径与抱子数量测定方法同1.5.2。将上述含石不同氮源的培养基除去琼脂，制成培养液，分别与抱了悬浮液等体积混合，滴于凹坡片上培养，在h后进行银检，测定其萌发率，每次检100个电子，每个处理设三个重复。1.5.8 湿度对拖子萌发的影响采用不同盐饱和溶液，分别设置60%、65%,70%、75%,80%、85%,90%、95%的相对湿度，25C恒温箱内培养，一一h取出镜检胞子萌发情况，每次检100个抱子，每个处理设三个重究，计算泡子萌发率。1.5.9 菌建及分生拖子的致死温度取灭菌试管，每管加入5m1.无菌水

19、，分别于4(rC、45C、50C、55C、60C、656个不同温度的恒温水浴锅预热，温度稳定后加入5m直径的菌饼，震荡摇匀，处理IOmin,立即用自来水冲洗冷却，将菌饼接种于PDA平板中央，25C恒温持续光照培养，10天后记录黄丝生长情况，每个处理5次理发。取灭菌试管，每管加入5m1.无菌水，分别40C、45C、50*C,55C、60C、65T6个不同温度的恒温水浴锅预热，温度稳定后加入等量的饱子悬浮液，处理IOmin,立即用自来水冲洗冷却，取冷却后的前悬液滴至凹玻片，25C恒温持续光照培养，h后测定施子萌发情况，每个处理5次重复。2结果与分析2.1 黄柏叶装病症状病害主要危害黄柏叶片，发病初

20、期,叶片上形成黄褐色小斑点，随后病情扩展，形成圆形、椭圆形或不规则形病理，周围有褪绿的黄色型圈，病部有黑色小点，为病菌的分生抱子器，发病后期几个病斑汇合成不规则大斑，老病斑中央穿孔，整个叶片黄化、拈死，提早落叶。2.2 病原菌的分离与纯化采用组织分离法对黄柏叶斑病病原菌分离，共分离得到株病原菌.2.3 致病性测定2.3.1 离体接种2.3.2 活体接种2.4 病原菌鉴定2.4.1 形态学签定分生m子器初埋生于表皮下，成熟后顶端突破表皮露出，呈小黑点状.分生抱子器扁球形，黑褐色，顶端有孔口，内生分生抱子。分生.胞子玳胞，无色，纺锋形，有12个油球。病原为茎点霉属真菌(PhOmasp.),属半知菌

21、亚门，腔饱纲，球克的目，茎点航属真菌。2.4.2 序列分析2.5 病原菌生物学特性2.5.1 曲子萌发时间黄柏茎点毒的分生胞子在25C,无菌水中经过20h开始萌发，萌发率为瑞，经过一h后，池子萌发到达中间值，h后萌发率达到最大值，以后增幅不明显，抱子萌发的最佳观测时期为.2.5.2 培养基对菌丝生长、胞子萌发及产胞量的影响六种培养基对病原菌培养的结果表明，病原菌在PDA、PSA、PW、ME八、CZA、OAJb均能生长。病原菌在CW、PW与ME.A培养基上培养时均能产生分生池子器，MEA上最明显，而在PDA、PSA与CZA培养战上不产生分生袍子器.2.5.3 温度对菌丝生长、产抱，及胞子萌发的影

22、响从表O看出，病菌在10-3(TC范用内均能生长。但在病原菌在温度为30C时菌落圾大。当温度达到5C和35C时病原菌停止生长。同时病原菌在1030C时在PDA上不产生分生抱子器。2.5.4 光照对菌丝生长、疳子萌发及产疳量的影响2.5.5 PH对蕾丝生长、拖子萌发及产胞量的影响2.5.6 C源对菌丝生长、疳子萌发及产泡量的影响2.5.7 N源对蕾丝生长、范子萌发及产胞量的影响2.5.8 湿度对范子萌发的影响2.5.9 菌丝及分生范子的致死温度2.4白鲜内生菌产活性成分初步研究3结论与讨论参考文献I“中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典岱.2000年板,北京:化学工业出版社.2000.8

23、3.|21楼之岑.秦波.常用中药材品种整理和质量研究.北京:北京医科大学、中国办和医科大学联合出版社,1996:332-339.3HongYuChcn.ZhenYiHuct.a1.DictaminsAC.threeunprecedentedaptHirca1.1.anc-typc(rinortriter)cnoidsfromDictamnusdasycarpusJ.Tetrahedron1.exers.2013.54：4150-4153(4congSconYnon,HyckyungYangcc.a1.1.imonnidsfromDictamnusdasycarpusProtectAgainst

24、G1.utamate-indcedToxicityinPrimaryCu1.turedRacConica1.CeMJ1.JMo1.Neurosci2010.42:9-165yuanyuanbaikxingjinet.a1.Twonewapo(iruca1.1.ane4ypeisomericIriteipenoidsfrom(herootbarkofDic1.ainnusdasyarpuswiththeiranti-pr1.ifera(iveactivi1.y(Jj.Phytochcniis1.ry1.xUers.2014.738:1-5.(6)PeiWang.JianboSune1.a1.Ph

25、arnuicokine1.ics.tissuedistributionandexcretionstudyofdictamnine.amajorhioactivccomponentFromthexxxbarkofDictamnusdasycarpusTurcz.(Rutaccac)J.Journa1.ofChromatographyB.2013.942-943:1-87徐强,吴斐华,朱丹妮,楞胴作为肝病治疗药物的应用P.中国:CN2O51004O8782OO5.(8Mi1.1.erEGPortcrJ1.c.a1.Furtherstudiesontheanticanccractivityofcit

26、rus1.imonoidsJ.Journa1.ofAgricuhura1.andFOOdChemistry.2004.52(15):4908-4912.9邹文欣,谏仁禅,植物内生菌研究新迸展IJ1.植物学抵2001.43(9):881892.IIOChenGT1YangM.SongY.e(a1.Microbia1.transformationofginsenosideRbbyAcremoniutnStrictum.(J.App1.icdMicrobio1.ogica1.Biotechno1.ogy.2008,77:1545-1350.UI周东坡,平文祥,等.紫杉醇产生赭分离的研加人微生物学杂志

27、20012ii81912UaoWu.Hong-YanYangx(.a1.DiVeniiIyofendophyticfungifromrootsofPanaxginsengandtheirsaponinyie1.dcapacities(J.SpringcrPIus.2013.2:10713)中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典S.2010年版,北京:化学工业出版社,2010.|14|冉启琼,罗兰,朱丹圾白鲜皮质艇标准研究U1.中医的学刊,2OO5,23(9X15S5I586(15)谭晓亮.李瑞海.白鲜皮洗剂的质量标准研究四.中成药.2008.3(M6):1819.16王春桃.符洪.白山片

28、的薄层色谱鉴别方法研究J.中国热带医.2008&6):1036103Z|17)朱利诙.张汉扬.杨春云.白鲜皮药材的质加标准研究几中华中火药学刊2O15ESS/58.|18|赵强强,扬明,日鲜皮中白鲜球的薄层膝别及含疑测定J.成都中医药大学.2009:14|19|李振荣,张建生,白鲜皮及其混沿品的T1.C鉴别J,中药材,2000.23(10):607.608.沈阳农业大学本科毕业论文（设计）承诺书论文（设计）题目白鲜内生菌多样性及其产活性成分能力初步研究完成人姓名专业中草药栽培与鉴定指导教师姓名职称讲师本毕业论文（设计）的创新点：通过对白鲜内生菌进行分离，统计和对比不同部位白鲜内生菌的数量，进一步地证明了药用植物内生菌的普遍性和多样性。通过用薄层色谱法对其代谢成分的初步测定，发现有能产生白鲜碱、榨用和黄柏削的内生真菌，为下一步深入研究提供依据。承诺内容:本毕业论文是本人在导师郝宁师指导下独立完成的，没有抄袭他人成果,对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明.完成人卷名:年月曰年月曰