花生疮痂病菌毒素对寄主细胞毒性及其机制研项目可行性研究报告.docx

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1、花生疮痂病菌毒素对寄主细胞毒性及其机制研究项目可行性研究报告一、项目提出的目的和意义(1)花生疮病病国内外研究花生(Arachishypoffaea)是我国主要的经济作物和油料作物，种植面积位列世界第二位，总产量居世界第一。我国花生种植面积较广，主要分布在山东、河南、河北、安微、广东、江苏和辽宁等省区，据国家粮油信息中心提供的数据显示，2013年我国花生种植面积已达471万公顷.花生.疮痂病(SPhaCdOmaarachidisBitaucourtCtJCnkinS)主要危害叶片和茎秆，形成大量疮痂状病斑(图1)。自1940年BitaUCOUrt首次在南美的巴西发现之后，日本(根岸宽山等,19

2、79)和阿根廷(GiOrdae/R,1985)等国家也相继报道，并在各花生产区Sft行成灾。近年来，我国广东、广西、福建、山东和辽宁等主要花生产区相维发生危害，分布广，危宙重，属典型的流行性病害。一般病田减产10%-30%,严重田块损失可达50%以上.辽宁省2009年仅在葫芦岛花生产区零星发生，2011年葫芦岛、阜新和锦州多个花生产区爆发式流行成灾，病田率75%700%,病株率82.6%100%,病叶率42.5%-95.3%,病情指数I8.1.535,发生面枳超过12万hm?(周如军等,2013),截止到2015年奥季已经传播到辽宁北部产区，且有维续苣延的趋势，已成为我国花生产业持续发展中亟待

3、解决的植保问题。图I花生疮痂病典型症状特征(左：叶片症状：右，茎杆症状)花生.疮痂病(SPhaCdoiaarachidisBitaucourtetJcnkins)属近年来新流行病害，国内外研窕报道较少日本学者根岸宽山在上世纪7(1.8O年代时日本该病病原学进行了研窕，明确了病原菌为Sp/wcM。，”rac加(加(根岸宽山等，1979)。巴西学者KCamCy对病残体和种子在花去疮摭病传播过程中的作用进行了研究，明确了田间病残体是该病初侵染源之一(KCamCyerR,2002),以菌丝体和分生抱子盘在病残体上越冬，翌年产生分生抱子，借助风雨传播。国外尚未见其他相关研究报道。目前国内研究主要集中在病

4、原学、发生调查(方树民等.2007：李峰等，2012)侵染特性(郭陞毒等，2015)化学防治(田云云等,2014)等领域，申请人近年来在其病原学、潦行因索分析、流行动态、扰性鉴定和田间防治等方面进行了系统研究并取得了相应结果(周如军等，2012,2014)。而国内外在病害致病因子、侵染机制、寄主与病菌互作等方面尚未见研究报道，研究基珈较为薄弱，极大限制f该病害的深入研窕，无法为后期抗病育种和新型防控技术研究提供理论基础。(2)植物病原真菌毒素在致病过程中的作用机制植物病原页菌与植物在长期协同进化和更杂的互作过程中，逐渐形成有利于致病性的进化，产生多种对寄主植物有击的物质统称为致病因子，致病因子

5、的种类、含量及其活力决定其致病力强弱，进而影响病害的发生和严重程度。近年来,病原真菌致病因子及其机理研究已成为植物病理学的研究热点。研究表明，病原真菌致病因子主耍包括旃类、毒素、激素和蛋白类等多种物质4|,其中毒素是尾刑菌(Cervospora)、镰抱菌(Fus(Irium)链格胞(A1.temaria)等多种重要植物病原真菌的致病因子。研究病原真菌毒素及其作用机理对r解病菌致病机理、寄主与病原物的互作机制、抗病育种和寻找新的病害防治途径具有重要意义。病原真菌毒素种类繁多，主要包括蛋白类，如小麦褐斑病菌(PywwMomtriticirepenis)产生的PTR徐素和棉花黄萎病菌(讪涓山du/M

6、iae)产生的VD奇素，：糖甘类，如甘蔗眼斑病侏i(Hdi而sporiSaE加rf)产生的长蝇白糖：脂类，如甜菜尾胞病菌(cezwsp”儿e产生的甘油三酯类毒素：杂环类(花酿类、酚醍类、不龈类等)以及氨基酸衍生物等类群。其中非配类毒素由于其具有光敏性可引起膜蛋白交联、膜脂过氧化、膜潦动性改变、细胞竹架损伤、DNA损伤等作用而备受瞩目。花旗类诟素主要包括交链胞毒素型、弗莱菌素里以及以金丝桃素为代表的其他类毒素。其中弗莱菌素型包括的尾胞菌素和痂囊腔菌爵素是倒萄黑痘病、柑橘疮痂病、大豆收斑病、玉米灰斑病等重要作物病害的主要致病因子。前期研究衣明尾抱菌毒素痂囊腔菌毒素是病菌侵染寄主植物的重要毒力因子(

7、1.iaotz/.2(X)8)o尾胞菌素(CercosPOrin)是由尾他属真菌(CtVWS”加)产生的红色的毒素，首次在(CerVO$叩2Aikuchii)中分离得到(OkUboeR,I975)痴囊腔菌素(EISinoChmme)是由痂囊腔曲(Eg决)产生的红色或橘红色的毒素，1957年Wciss等人首次在痂囊腔菌属真菌中发现，主要包括A、B、C和D四种衍生物(Weisseta1.1964：1.oUSbergeta1.,1969).尾抱菌素与痴囊腔菌素的生物合成还受到众多生理生化、物理因子的影响，其中光和氧气是两个必不可少的关键因素。CERSPORINCercosporaipp图3足用的素结

8、构图2布囊腔苗素结构花根类植物毒素(尾弛菌素与痂囊腔菌素)具有明显的光敏作用，在Kuang-RenChUng等人对大豆灰斑病、柑橘疮揄病等病害的研究中，证明光有利于北阻类植物毒素的产生I1.与其毒力大小为定的相关作用，光存在时会与氧反应产生对细胞有毒宙作用的活性氧,光敏作用一般分为类型【和类型H两种机制，光敏剂吸收光后，首先激发到寿命很短的单或态，然后系间穿越到三重态，后者相时单选态来说更稳定，寿命更长，因而光做作用通常通过三重态来进行。光敏剂的三重激发态可进行两种类盘的反应：机制I通过电子转移或抽药反应与底物相作用，产生底物和光敏剂的自由基，这些自由基与周阳的氧反应产生氧化物，如超氧阴离子自

9、由基(02)及羟基自由战(OH)等；机制H光破剂的三重态与基态氧发生.电子转移或能量转移产生超氧阴离子自由基(02)和雌重态氧CO。，后者是一种高亲电反应活性的物种,能行效地氧化生物分子(Guedesera/,2007)。在光敏作用中I型机制和H型机制同时出现，它们的相对强弱取决于溶剂极性、底物和光敏剂的特性和浓度、氧的浓度以及光敏剂与底物间的键合作用。由此可知氧与光敏作用密切相关，I1.在大多数光敏反应中O2是主要活性物种,但0?和QH的作用也不可忽视。活性氧(ROS)在寄主植物和微生物相互过程中起到重要作用。如在细胞发病机理过程中,NADPH氧化旃(NOX)信号诱导氧爆发以及程序性细胞死亡

10、的反应是寄生对入侵病原体的防御反应.与病原真菌后接触后，植物质膜结合的NOX活性提育,导致包括过氧化级(HQC在内的活性氧的快速枳累，其扩散进入细胞并激活植物防御(APdeta1.,2004)。最有代表性的植物防御反应是由ROS的积累和ROS清除旃的抑制产生的程序性细胞死亡响应，即过敏性坏死反应。ROS也参与防御的其他模式，如形成细胞壁的氧化交联的障碍以及抑制病原体侵入(Shct1.yefH,2008)。花胆类植物毒素产生的活性氧(ROS)对寄主植物细胞具仃极强的毒害作用。产毒病原真菌的致病机理包括三个可能过程：1)病原菌在侵染前释放毒素作为信号分子：2)择放的港索选择性地和寄主细胞上的受体位

11、点结合：3)解放的毒素抑制植物对真菌的侵染和定植的防御反应。因此，毒素对寄主产生的生理生化影响往往是通过与寄主体内的一种或几种生物大分子(靶分子)相互作用产生的.毒素进入寄主体内，通过与寄主体内特定靴分子相互作用，改变寄主原来正常的生理过程，引发一系列细胞学和生理生化反应，并最终使寄主产生一定的症状，如镰刀菌产生的毒素致使植物萎蕉，链格把毒素使寄主坏死，长蠕泡毒素使植物产生褪绿现象；尾抱属及痂囊腔菌属产生的毒素可使植物细胞膜过氧化，导致病害扩大危害，病情加重。尾胞菌素与痂囊腔菌素等花瓶类毒素均为脂溶性，在渗入细胞后可以作用于多种细胞器，包括溶的体、内质网、高尔基体、甚至破坏含有核酸的叶绿体和线

12、粒体以及细胞核等。尾胞菌素与痂囊腔菌素主要作用位点在细胞膜上,如在烟草悬浮细胞及柑橘原生质体中，添加尾泡菌素与痴囊腔菌素均能使细胞死亡。尾抱曲素与痂囊腔曲素在细胞间通过光敏作用产生的Q?以及其他活性氧种类，使细胞膜过氧化，电解质泄露到细胞间,为病原菌正常生长和产泡提供营养条件.接种叶片及培养液的初始电导率及总电导率的测定显示叶片中以及细胞中的电解质泄露到溶剂中，证明细胞膜的流动性降低，细胞内电解质泄露，细胞膜破裂，导致细胞死亡花生疮痂病为辽宁省花生产区新爆发式流行性病需，发生.区域广，危杏极为严重，殷病田减产10%30%,严重田块损失可达50%以上。仅辽宁2011年发生面积超过12JjhnR形

13、成爆发式流行，危击极为严亚，且有向北继续鹿延的趋势，已花生产业持续发展中酮待解决的植保问题。而国内外对于花生疮痂病的研究基础较为薄弱，缺乏病菌侵染过程、致病因子筛选、致病机制及寄主损伤机理等基础研究工作，无法诠释病菌与寄主之间的互作关系和互作机制，对F该病害的深入研窕及后期的抗病育种、新型安全防控技术的开发带来了巨大的理论屏障。本项目以花生疮加病菌为研究对象，深入开展花生疮痂病菌毒力因子筛选、毒素在致病中对寄主植物损伤和细胞凋亡作用及其作用机制等研究工作，探索花生疮痂病菌与寄主的互作模式和机制，研究结果该病害的深入研究和后期花生的抗病育种具有全要意义。结合申请人前期对辽宁花生疮痴病侵染过程和流

14、行因素的研究基础，本项目的研究结果可以很好地解释近年来辽宁花生产区花生疥痂病爆发式流行因素和流行机制。项F1.研究过程中会建立花生细胞悬浮体系，并对各种因素进行优化，该技术对于花生的遗传转化和功能基因的转化提供材料和技术支持。另外，本研究中将会探讨淬灭剂和金属离子对花生疮痂病菌毒素的缓解和抑制作用，进而减轻病害的发生和流行程度，该部分研究结果对于寻找新型、安全的病害防治方法提供了理论支持，对于花生减量使用农药具有重要意义。花生已成为辽宁省第三大作物，种植面积早已突破600万亩，且随着农业产业结构调整，玉米栽培面积减少，花生产业的发展势头持续见好。而花生疮痂病为辽宁省花生产区新爆发式流行性病害，

15、发牛.区域广，危需极为严重。结合前期研尢，该项目的顺利实施，不仅能够完善花生疮痛病的致病机制的理论探讨，同时对于我省花生产业的健康发展和农民增收具有重要意义.二、项目研究内容和研究方案1 .研究内容(1)花生疮痴病菌毒素对寄主细胞的毒性利用花生细胞悬浮培养体系和致病性测定，明确花生疮痂病菌毒素含量与细胞死亡率和病斑扩展动态之间的关系，确定花生疮痂病曲毒素在致病过程中的歪要作用。(2)花生疮病病菌毒素在寄主-病菌互作过程中的作用机制花生疮痴病三毒索对寄主防御的影响动态测定花生疮痂病菌毒素对寄主防御海的响应动态，确定毒素对寄主生理生化的的影响，进一步证明花生疮痂病的毒索是否为花生疮掘病菌的毒力因子

16、。O花生疮痂病菌毒素对寄主细胞质膜过氧化的影响利用细胞悬浮体系通过测定寄主细胞膜的选择透过性、流动性、细胞膜施活性和质膜过氧化程度，探索毒素对寄主植物细胞膜水平的毒害作用“。花生疮疝病菌毒素对活性氧产生动态及细胞需亡的作用机制利用细胞悬浮体系测定花生细胞程序性死亡过程中的1。2、Of以及H?O?三种不同活性氧种类及其含量.分析与细胞凋亡的关系，明确毒素对花生细胞凋亡的作用机制。(3)淬灭剂对花生细胞毒性和膜损伤的抑制作用明确淬灭剂种类和浓度对寄主细胞凋亡的缓解或抑制作用,通过添加不同类型的活性氧淬灭剂，探索不同类型活性氧作用，进一步证实毒素在花生.疮痂病菌致病中的主导作用。2 .研究目标和拟解

17、决的关健科学问题(I)花生疮斑病毒素对寄主铀胞的毒性及其机制；从细胞程序性死亡、抗性根响应、细胞膜损伤和活性氧等方面揭示菌毒素是花生疮痂病菌的或要致病因子。(2)毒索诱导产生的活性气是寄主细胞程序性死亡的关健机制，活性氧的含量与细胞程序性死亡的关系及淬灭剂对细胞毒性的抑制作用正反两个方面证明活性乳的IR要作用。3 .研究方案和试验方法(I)花生疮确病菌毒素对寄主细胞的毒性花生疮痴病菌毒素对病病毒形成和扩展的影响采用前期病原菌侵染机制中的接种方法，以花生疮痴病菌毒素接种寄主植物叶片、茎干，在不同的环境条件下，通过网格法测量叶面积，以浸染位点数计算侵染概率。明确花生疮痂病菌毒素对病斑形成及犷展的具

18、体作用。3花生疮疝病菌毒素对细胞凋亡的作用建立花生、烟草的细胞悬浮体系，细胞活力采用氯化三苯基四概(TTC)法测定，通过紫外分光光度法确定花生疮痴病菌毒素的浓度，将不同浓度的花生疮痂病菌毒素添加到不同密度的悬浮细胞中，通过荧光染色法检测细胞存活率，利用扫描电镀检测细胞内结构的凋亡特征以及对细胞存活不同时期进行DNA条带分析，对细胞避亡的过程进行动态观测分析。(2)花生疮病病菌毒索对寄主细胞毒性作用机制研究花生疮痂病菌毒素对寄主防御S1.的影响动态在对细胞程序性死亡研究的基S1.i上，采用测定植物叶片及悬浮细胞过氧化氮的(CAT)、过氧化物酹(POD).苯丙皴酸解氨菊(PA1.).多酚氧化酹(P

19、PO).超氧化物歧化酹活性(SOD)，确定在花生.疮娜病菌毒素浸染叶片及毒杏细胞的过程中寄主植物及细胞的生理变化及花生疮痂病菌傩素的作用机制。花生疮痂病窗毒素对寄主细胞质膜过氧化和脂质过氧化的影响通过测定花生疮痂病的毒索的PC值确定其主要作用位置.，采用测定饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比值以及细胞膜上H4-ATPasc.CaJATPaSC的活性确定细胞膜的活性大小，丙二醛(MDA)含量采用琉代巴比妥酸(TBA)比色法测定，膜破裂程度以电解质渗透率为指标，探究花生疮痂病菌毒素对细胞损伤的机制，明确花生疮痂病菌毒素时寄主植物及细胞内的具体作用部位。白花生疮疝病菌毒素对活性氧产生动态及细胞宿亡的作用机

20、制花生抢痴病菌毒素的加入使植物体内产生过量自由基，自由基有极强的氧化能力，能通过氧化反应来攻击细胞膜“1。2的产生及其氧化产物的含量采用DaubandHangarter(1983)的方法进行测定：OT产生用四哩赳蓝(NTB)方法测定：的含址采用Uchida等的方法。(3)淬灭剂对花生细胞毒性和膜损伤的抑制作用淬灭剂对花生疮痂病的抑制作用选取胡萝卜素、DABCO.维生素E、维生素B6、维生素C、谷胱廿肽、肺氨酸、半胱级酸等不同的活性氧淬灭剂，在花生疮痂病菌毒素接种的不同时期进行涂抹，通过测定病现扩展速率以及侵染概率明确单线态氧等活性氧在浸染中的机制，为防治花生疮痂病提供理论基础。部灭剂对寄主细胞

21、宿亡的抑制作用选取胡萝卜素、DABC0、维生素E、维生素B6、维生素C、谷胱甘肽、氨酸、半胱焚酸等不同的活性氧淬灭剂，通过TTC等染色法测定细胞活性，确定淬灭剂对细胞凋亡的抑制作用。4 .技术路线图4项目技术路线5 .项目可行性分析(1)研究基础和研究方案的可行性：项目申请人所在团队长期从事花生病击研究工作，具有扎实的研究基础。项目申请人近5年来先后主持参加了辽宁省科技攻关项目“花生病虫害安全控制技术体系研究(2011214(X)2)”、辽宁省博士启动基金项目，,花生疮施病流行动态及其模拟模型的研究(201311()6)”和辽宁省农业领域青年科技创新人才培养资助计划项目“花生疮痂病侵染机制及其

22、流行成灾关键因子研究(2014056)”等多个相关研究课题，对花生疮痂病的分离培养技术、生物学特性、致病性、发生规律等方面进行f系统研究，发表多篇论文，相应研究基础扎实。近年来开展/花生疮痴病菌不同菌株产毒能力、致病性差异和产毒条件等研究工作，为本项目的顺利实施莫定了很好的前期研究基础(具体在研究工作基础和条件中削述)。本项目试验设计合理,试救方法和试险方案可行。（2）研究条件的可行性：课题组所在的植物病击流行研究室依托辽宁省及农业部我点学科植物病理学科及辽宁省植物病宙重点实验室，技术力量较强，设备条件先进，近年来伴随着沈阳农业大学的跨越武发展，在省、市和学校的大力支持下，投入大量经费进行先进

23、设备仪器添巴和更新换代，建立了学院和学科中心实验平台，结合学校开放科研平台，现拥有分子生物学、植物生理学、植物病理学、生.物化学等相关学科完整、先进的实验设备和仪冷平台，能够满足本项目研究所需要的实验仪冷好软硬件条件。（3）研究人员配和知识结构可行性：项目组成员具有高级职称2人，中级职称1人，均为固定研究人员，主要从事植物葫害流行学和宏观植物病理学教学和研究工作，另外配备5名研究生进行花生疮痂病专项研究工作,研究人员梯队和知识结构搭配合理,能够完成本项目的忒验实施、数据分析、论文发表及课题总结等工作.6 .项目的特色与创新之处.（1）首次揭示花生疮痂病菌毒素为病菌的重要毒力因了，为花生疮痂病的

24、致病机制的研究提供理论基础.（2）利用细胞悬浮培养技术从细胞膜和活性氧两个方向研究花生疮痂病菌毒素对寄主植物细胞的损伤及其诱导细胞程序性死亡过程，能够更加准询地阐述其作用机制。（3）通过添加活性氧淬灭剂探究其在缓解或抑制毒素对细胞的损伤和毒害作用，不仅能够反向证明毒素是花生疮痂病菌的全要致病因子，而且研究结果能够为花生疮痂病的综合防治提供一个崭新的视角。三、年度研究计划及预期研究结果1 .年段研究计划2017年3月-12月；花生疮痂病曲大量扩繁培养，利用已建立的提取方法对花生疮痂病菌毒素进行提取、分离纯化：维续优化花生细胞悬浮体系，建立稳定平齐的花生细胞组织；利用花生疮伽病菌毒素对花生进行接种

25、，明确其在侵染过程中对病班扩展的影响:通过添加一定浓度的毒素，测定花生愈伤组织中相关防御的活性，如超氧化物歧化陶、过氧化物版及抗坏血酸氧化旃等，明确花生痂囊腔菌毒素在植物发病过程中生理生化等动态变化，进而为花生痴囊腔菌毒素致病机制的更深一步研窕做好研究基础。2018年1月2018年12月：提取花生疮痂病菌毒素并优化花生疮痴病菌倦素的提取条件，通过添加不同浓度的毒素,测定花生细胞悬浮体系中细胞死亡率，细胞膜透性及丙二醛含量等相关指标，明确花生咖囊胞的毒素对细胞损伤及其使细胞膜过辄化的机制，探索其诱导细胞程序性死亡的的机制。参加国内外学术会议1次。发表学术论文12篇。201阵1月.2020年4月，

26、花生疮加病菌毒素对活性氧产生动态研究：通过添加不同浓度的毒素，测定组织及细胞内活性氧的产生及含量，探索活性氧在细胞凋亡过程中的作用机制：通过添加能使活性氧失活的淬灭剂、活性辄消除剂等试剂，明确淬火剂对细胞损伤以及花生疮掘病的抑制作用，进一步证明活性氧的亚要作用，整理研究结果，撰写结题报告，撰写研究论文12篇。2 .预期研究结果本项目以花生疮痂病菌为研究对缴，在前期研究的基础上，以细胞悬浮体系为试骐平台，利用植物病理学和病生理学理论和研究方法，对花生疮痂病菌蠹素的细胞毒性，脂质过氧化、氧化胁迫和淬灭剂的作用及其机理进行系统研究，旨在明确花生疮痴病菌毒素在致病过程中的作用及其生理生化机制，研尢结果

27、对于揭示花生.疮痂病菌的寄主病菌互作和致病机制，抗病育种及新型防控药剂和技术的研发奠定了理论基础。（I）建立成熟的花生细胞悬浮体系，为花生病击的致病机制研究提供技术平台.（2）明确花生疮加病菌毒素在致病过程中的作用及其细胞毒性：（3）明确花生疮痂病菌毒素细胞毒性的生理生化机制，为病菌的致病机制研究和抗病育种提供理论依据：（4）明确活性氧淬灭剂对细胞毒性和病情扩展动态的抑制作用机制，为花生疮痂病新型防控药剂和技术的研发奠定理论机制。（5）发表研究论文2-3篇,其中SC1.论文1篇,培养研究生2-3人四、研究基础与工作条件1 .工作基础申请人近年来主持2项与花生疮痂病宜接相关项目,辽宁省博士启动基

28、金项目,花生疮痂病流行动态及其模拟模型的研究（20131106）”和辽宁省农业领域声年科技创新人才培养资助计划项目“花生疮痂病侵染机制及其流行成灾关键因子研究（2014056）”项目。在以上课题的资助下，开展了花生疮痂病病原学、分离扩繁技术、抗病性鉴定、流行动态和潦行规律等研究工作，并发表多篇学术论文。对于本项目的研究内容，课题组进行了相应的前期研究工作。已完成供试窗株和对照菌株分离纯化及病原学研究工作：截止到2016年末课题组已完成辽宁省、江苏省、山东省等主要产区菌株收集工作，共获得菌株4（X）株。并获得柑橘疮痂病菌和葡萄黑豆病菌2株对照菌株“花生疮痂病菌分离培养难度极大，且菌落生长速度缓慢

29、30天菌落直径约为2.1cm）,前期研究掌握了病菌的分离培养及扩繁技术，建立了一套病菌稀释单菌落分离及研磨快速扩繁体系,并对不同菌株的培养性状和致病性进行了初步研究，发现不同菌株间存在生长速度、形态和产毒差异（如图5）：完成了已获得菌株的形态和分子鉴定工作，在对病菌分子特性研究的基础上撰写完成了Mo1.ecu1.arandPathogcnicityCharacterizationofSphace1.oiiiaarachidisIso1.atesfrom1.iaoningprovinceinChina论文（投稿）图S花生疮痴病萧培养性状（左I病倒快速扩繁：中：病曲产毒能力；右：部分曲株培养性状篇

30、选出不同抗感品种，明确接种条件：前期已完成了辽宁主要花生品种的抗病性鉴定工作，筛选出白沙1016为高感品种，对于病原前的生测提供了试验材料（周如军，2013,2014）,明确了花生疮痂病菌的接种条件，（周如军，2017）。花生疮疫病三毒索提取条件的初步建立：课题组在前期研究的基础上已经掌握从花生疮痂病菌中提取毒素的方法。将烘干的菌饼置于西酮中连续两次萃取I6h后合并，溶液经旋转蒸发挥去内丽后，将瓶壁用Im1.丙酮溶解得到花生痂囊腔菌毒素提取液，用薄层色谱法进行鉴定。建立了白沙1016的细胞悬浮体系：花生.细胞悬浮体系的建立是该项目顺利实施的保障之。课题组通过组织培养技术，以白沙1016为试材初

31、步建立了细胞悬浮体系，（愈伤组织诱导：MS为基础培养基，添加ISmg1.的2.4-D、1.Omg，1.的KT+3.0mg1.的6-BA；悬浮培养：MS液体培养基为基础培养基，25mg1.24D+1.5mg1.KT+2.5g1.6-BA+30g1.蔗糖，培养20d）.0.710.640.290.11图6花生疮卷耕的冷素T1.C分析左：荧光；右；HJt）2 .工作条件(1)课题坦拥有大量先进仪器设备.课题组所在的植物病害流行研究室依托辽宁省及农业部重点学科植物病理学科及辽宁省植物病害重点实验室，技术力量较强，设备条件先进，近年来伴随若沈阳农业大学的跨越式发展，在省、市和学校的大力支持下，投入大量经费进行先进设备仪器添置和更新换代，建立了学院和学科中心实验平台，结介学校开放科研平台，现拥有分子生物学、植物生理学、植物病理学、生物化学等相关学科完整、先进的实验设备和仪器平台，具有很好的研究平台。(2)课题组拥有较好的研究梯队。项目组成员具仃高级职称2人.中级职称1人,均为固定研究人员，主要从事植物病害流行学和宏观植物病理学教学和研究工作，另外配备5名研究生进行花生疮痴病专项研究工作，研究人员梯队和知识结构搭配合理，能够为本项H的顺利实施提供良好的人员保障。