白鲜灰斑病病原学及细胞壁降解酶和黑色素产生条件研究.docx

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1、硕士当佐企攵白鲜灰斑病病原学及细胞壁降解酶和黑色素产生条件研究独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研窕成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名:时间：年月日导师签名:时间：年月日关于论文知识产权和使用授权的说明本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被

2、查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等史制手段保存、汇编学位论文.同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容.学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名:时间：年月日时间：导师卷名:目录摘要1Abstract1第一章尾范类真菌病害研究进展51.1 尾抱类真菌病害发生危宙及其分布51.1.1 尾抱类真菌病害种类51.1.2 尾胞类真菌分布及发生危杏;61.1.3 尾抱类真菌病害正状特征71.2 尾胞类真菌研究进展8121尾刑类真菌包含类群：8122尾抱类真菌分类和研究历史；81.2.1 尾胞类真菌分

3、子签定方法101.2.2 尾刑类真菌生物学特性研究101.3 尾抱类真菌病害发生规律研究121.4 尾胞类真菌病害防治现状121.4.1 农业防治12142药剂防治13第二章白鲜灰血病发生危害与病原鉴定142.1 材料与方法142.1.1 白鲜灰斑病的病情调查142.1.2 白鲜灰斑病病害症状152.1.3 白鲜灰斑病病原分离纯化与形态学鉴定152.1.4 白鲜灰斑病病菌的分子鉴定152.2 结果与分析172.2.1 白鲜灰斑病病情调查172.2.2 白鲜灰斑病病害症状17223白鲜灰斑病病原菌形态182.2.4 白鲜灰斑病菌致病性测试19225分了生物学签定结果202.3 结论与讨论22第三

4、章白鲜灰氏病菌生物学特性及产胞条件研究243J材料与方法242.3.1 供试菌株242.3.2 病原菌生物学特性242.3.3 白鲜灰斑病菌产胞条件263.2 结果与分析273.2.1 病原阑生物学特性273.2.2 白一灰斑病菌产蜂条件403.3 结论与讨论45第四章白鲜灰斑病病菌细胞壁降解酶及其活性研究464.1 材料与方法464.1.1 供试材料464.1.2 白鲜灰斑病病菌细胞壁降解辞的提取464.1.3 白鲜灰斑病病菌细胞壁降解酌的纯化474.1.4 鲜灰斑病病菌细胞壁降解的活性测定474.1.5 白鲜灰斑病病菌细胞壁降解陶产生条件研究474.1.6 白鲜灰斑病病菌细胞壁降解撤对白鲜

5、叶片作用的观察484.2 结果与分析484.2.1 白鲜灰斑病病的细胞壁降解陶产生条件研究484.2.2 细胞壁降解幅对白鲜叶片作用的观察524.3 结论与讨论53第五章白鲜灰血病菌黑色素性质及影响胞外黑色素产生的条件555.1 材料与方法555.1.1 供试材料555.1.2 白鲜灰斑病病菌黑色素的提取与纯化555.1.3 白鲜灰斑病病菌黑色素的理化性质565.1.4 白鲜灰斑病病菌黑色素红外光谱扫描565.1.5 三环嚏对白鲜灰斑病病菌黑色素产生的影响565.1.6 三环嚏对白鲜灰斑病菌生长速率、抱子产生量和致病力的影响565.1.7 白鲜灰斑病病菌胞外黑色素产生条件575.2 结果与分析

6、585.2.1 白鲜灰斑病菌黑色素的获取585.2.2 白鲜灰斑病病菌黑色素理化性质研究585.2.3 白鲜灰斑病病菌黑色素红外光谱分析58524三环哇对白鲜灰斑病菌黑色素产生的影响605.2.5 三环嚏对白鲜灰斑病菌生长速事、抱子产生量和致病力的影响615.2.6 白鲜灰斑病病菌胞外黑色素产生条件625.3 结论与讨论66致谢67参考文献68攻读硕士学位期间发表论文情况73CONTENTAbstract(inChinese)1Abstract(inEng1.ish)3Chapter I ResearchprogressofCercosporiodfungidisease51.1 Occurr

7、cnccJamagcanddistributeofCercosporiodfungi51.1.1 SpeCieSofCercosporiodfungi51.1.2 DistributcJamagcanddistributeofCcrosporiodfungi61.1.3 Morpho1.ogica1.characteristicsofCercosporiodfungi71.2 ResearchprogressofCcrcosporiodfungi81.2.1 Groupsinc1.uded81.2.2 C1.assificationandresearchhistory81.2.3 Method

8、sOfidentification1()1.2.4 Researchofbio1.ogica1.characteristics101.3 Researchofregu1.arpattern121.4 Currentsituationofpreventionandcontro1.121.4.1 Agricu1.tura1.contro1.121.4.2 Chemica1.contro1.13Chapter II OcciirrenceJamageandidentificationofpathogen142.1 Materia1.andMethods142.1.1 Invesiigationoft

9、hedisease142.1.2 Diseasesymptom152.1.3 Pathogeniso1.ationandmorpho1.ogica1.identiGcation152.1.4 Mo1.ecu1.aridentification152.2 Resu1.tsandana1.ysis172.2.1 Investigationofthcdisease172.2.2 Diseasesymptom172.2.3 Moho1.ogica1.characteristicsofpathogen182.2.4 Pathogenicity1.est192.2.5 Resu1.tofmo1.ecu1.

10、arbio1.ogica1.identification202.3 Conc1.usionanddiscussion22Chapter III Bio1.ogica1.characteristicsandspom1.ationconditionsofpathgen.243.1 Materia1.andMethods243.1.1 Thetestedstrains243.1.2 Bio1.ogica1.characteristicsofpathogen243.1.3 Sponj1.ationconditionsofpathogen263.2 Resu1.tsandana1.ysis273.2.1

11、 Bio1.ogica1.characteristicsofpathogen273.2.2 Spom1.ationconditionsofpathogen40CONTENT3.3 Conc1.usionanddiscussion45Chapter IV StudyontheCe1.1.Wa1.1.DegradingEnzymesofPathogenandItsActivities464.1 Materia1.andMethods464.1.1 Thetestedstrain464.1.2 ExtracionofCWDE464.1.3 PurificationofCWDE474.1.4 Enzy

12、meactivitynwasurcmcntofCWDE474.1.5 GenerationconditionofCWDE474.1.6 ObsevationofCwDEeffectongrey1.eafspot484.2 Resu1.tsandana1.ysis484.2.1 Researchofgenerationcondition484.2.2 ObscvationofCWDEeffectongrey1.eafspot524.3 Conc1.usionanddiscussion53Chapter V Charactristicsandconditionsofaffectinggenerat

13、ionofextrace1.1.u1.arme1.anian555.1 Materia1.andMcthw1.s555.1.1 Thetestedmateria1.555.1.2 ExtraciionanduriI1.caiionofma1.anin555.1.3 Physica1.andChemica1.PrOPenieSofma1.anin565.1.4 Infraredspectroscopicscanofma1.anin565.1.5 EffectofIricyc1.azo1.eonMe1.aniangeneraion565.1.6 EffectofIricyc1.azo1.confu

14、nga1.growthrate,sporu1.ationquantityand5.1.7 genicity565.1.8 Conditionsofgenerationofextrace1.1.u1.arme1.anin575.2 Resu1.tsandana1.ysis585.2.1 Extractionofma1.anin585.2.2 ResearchofPhysica1.andChemica1.1.,roperties585.2.3 Infraredspectroscopicana1.ysis585.2.4 Ef1.ectofIricyc1.azo1.eonMe1.aniangenera

15、ion605.2.5 Effectoftricyc1.azo1.confunga1.growthrate.sporu1.ationquantityand5.2.6 genicity615.2.7 Conditionsofgenerationofextrace1.1.u1.arme1.anin625.3 Conc1.usionanddiscussion66Acknow1.edgements67Reference68Paperpub1.ishedduringmasterphase73摘要白鲜（。无心“SdaSyCaSTUrCZ）为芸香科白鲜属多年生草本药用植物，其根皮为我国传统中药。欧亚大砧和北美

16、洲均有分布，在我国东北、华北、西北及华东等地区有丰富的野生资源。近年来I苍白鲜市场需求量逐渐增加.野生资源日渐枯蜡，辽宁东部山区开始进行人工典回，2012年作者在对辽宁省抚顺市清原满族自治县白鲜人工归|网试验基地进行病害调查时发现种叶部病宙危害严重，产生大量病理导致叶片黄化及提早落叶，严I1.i影响了白鲜产量和质量.经杳阅国内外文献尚未见相关研究报道，为新发生病害，根据病害症状特征和病菌种类初步命名该病害为白鲜灰斑病。本文对病害的发生危害、病原菌种类鉴定、生物学特性、细胞壁降解陶和黑色素产生条件进行了系统研究，旨在为白鲜灰斑病的田间诊断和防控提供科学理论依据.1 .明确了辽宁白鲜灰岗病的发生危

17、.古，鉴定并命名其致病菌为Paracercosporadictamnico1.asp.nov.,M新种。20122014年对抚顺、清原和沈阳各白鲜种植区进行了系统调杳，该病发生极为普遍,危害严道,病田率100%,病株率4278%,病情指数5.3596调查过程中同时采集病害样本，并分离纯化获得纯培养，对其致病菌形态特征进行详细描述，结合ITS和1.SU多序列分析，鉴定其致病菌为尾胞类真菌一新种，命名为ParacercosHradicamicoiaY.H.Ou&R.J.Zhou,sp.nov.02 .明确了白鲜灰斑病菌牛.物学特性及其胞子产牛.条件。结果表明，菌丝生长最适培养基为CA培养基，最适湿

18、度为25C,最适PH为6,班适碳源为果糖,最适氮源为酵母行，光照有利于菌落生长，菌丝致死温度为54CIOmin.分生胞子萌发最适温度为25,C,最适PH为6,最适碳源为1%葡萄糖溶液，最适氮源为1%硝酸钾溶液，光照不利于抱子萌发，胞子致死温度为53CIOmin,胞子产生垠适产胞培养基为V8培养基，15d可产抱9.5X1.a个m1.,最适温度为25C,最适pH6光照有利于抱子产生,在无碳酸钙的V8培养基中添加钠离子有助于产胞，I5d产抱量为1.3x1.（）7个/mJ3 .明确/白鲜灰斑病病菌致病因子细胞壁降解的种类、产生条件及其活性变化，为进一步阐述白鲜灰身病病菌的致病机理提供理论依据。结果表明

19、，白鲜灰斑病病菌产生果胶的4种（PG、PMG.PMTE和PCiTE）,纤维素的2种（P-葡萄犍件旅和Cx）细胞壁降解酹活性与温度关系密切，25C条件活性最高，PG含量较其他细胞壁降解酶高，在259时可达9.63UmI.:果胶榆受PH值影响较大，PCkPMG在pH56范围内院的活性最高。而PGTE和PMTE在pH67时活性最高，纤维素前受PH影响不显著：光照条件变化对细胞樊降解施活性影响不显著.细胞壁降解的活性与培养时间有关，果,胶的PG,PMG在25d达最大值，分别为9.61UZm1.和7.16Um1.果胶酹PGTE的活性在2(k1.最高，PMTE的活性在25d明显升离，纤维崇旃小彷荀域仔曲和

20、Cx总体趋势较为稳定，25d时的活性为23IUm1.和1.33Um1.:碳源对纤维素随影响较大，其中葡萄犍件施在蔗糖环境里表现出来很高的活性，可达41.80Um1.,CX在蔗犍环境中旃活性较高，为1.1.82Um1.,果胶酹活性普遍较低，PG在蔗糖环境卜、PMG在果糖环境下、PGTE和PMTE在甘露醉环境下的活性较高，分别为8.76U/m1.、6.06U/m1.、9.04U/m1.和557Um1.:在不同氮源环境卜.白鲜灰斑病菌均可产生细胞壁降解的，果胶的活性普遍较纤维素的高，B-葡萄糖件曲在蛋白腺条件下的的活性最高，为867Um1.PG和PMG在酵母环境卜、PGTE和PMTE在酪氨酸环境卜活

21、性最高，分别为4.64U/m1.、3.47Um1.4.53Wm1.、3.02Um1.*CX的活变化不大，蛋白膝环境下0.69U/m1.：静置利于果胶随产牛.，而对纤维素陶影响不显著。果股的和纤维素酹处理叶片均能产生症状,初步证明果胶施和纤维素的均是白鲜灰斑病菌的致病因子。4 .首次确定了白鲜灰斑病第产生黑色素的种类，并探索了其产生条件，为明确病菌致病机制提供理论基础.利用酸碱沉降法对病菌产生黑色素进行分离纯化，并进行红外光谱检测，结果表明，白鲜灰斑病菌胞内产生黑色素主要为DHN黑色素，胞外产生黑色素主要为DOPA黑色素：白鲜灰斑病菌在25C恒温培养2535d时胞外黑色素积累量急速增加。黑暗条件

22、F病菌微外黑色素的产量为光照培养条件卜的1.16倍。25*C震荡培养，pH67时，并添加酪氨酸,铜离子及适量的三环理有利丁胞外黑色素的产生。添加三环晚能够促进白鲜灰现病菌胞外黑色素的合成，研究结果进一步证明了胞外黑色素与DHN黑色素的生物合成机制并不相同“关键词：白鲜灰斑病；Paracercosporadictannico1.a；病原学；细胞壁降解的；黑色素AbstractDictamiuisdasycarpusTurczisaperennia1.herbintheRutaceaefami1.yoriginatedfromEurope.AsiaandNorthAmeriCaandthenort

23、hernpartofChina.TherootbarksofD.dasycarpusisca1.1.edCortexdictamni.whichisusedinChinesetraditiona1.medicine.Inrecentyears,thedemandofmarketincreasesgradua1.1.ywithknowingmoreaboutD.dasycarpus,wi1.dresourcesincreasing1.ydep1.eted./Xrtificia1.p1.antingD.dasycarpusfie1.dswereestab1.ishedinnorthpartof1.

24、iaoning.Since2012.agray1.eafspotdiseasecausingsignificantdamagetop1.antsofD.dasycarpusinQingyuanCounty.FushunCity.1.iaoningProvince.Chinahasoccurred.Thefungusmain1.yinfected1.eavesofthehostp1.ants.Yie1.dandqua1.ityofCortexdictamniwereserious1.yhur1.ed.Nore1.ated1.iteraturecou1.dbefoundinandoutofChin

25、a.ItisanewdiseaseonD.dasycarpus.ThepathogenofdiseaseisidentifiedasanewspcciscsParacercospora(Iictamnico1.acombiningthemorpho1.ogica1.characteristicsandphy1.ogeneticana1.ysis.Theoccurrenceofthedisease,identificationofpathogen,bio1.ogica1.characteristicsofpathogen,pathogenicfactorandfungicidescreening

26、testaboutgray1.eafspotofDictanmusdasycarpuswcrcstudiedtoprovideascientifictheorybasisforpreventionandcontro1.inthefie1.d.1. Theoccurrenceanddamageofthediseasein1.iaoningwereconfimd,andfirst1.yidentificationofpathogenasanewspcciscsParacercospora(Iictamnico1.a.FrOm2012to2()14,asystemSUrVCywerestudiedi

27、nCVCryfie1.dsofD.(1.asycausinFushunCity.ShenyangCityandfoundthediseasewasspreadedwide1.yandserious1.y.Therateofdiseasedfie1.dis100%,therateofdiseasedp1.ant42-78%anddiseaseindexis5.3-59.6.Diseasesamp1.eswereco1.1.ectedduringthesurvey,andpurecu1.tureweregot.Thepathogenofdiseaseisidentifie1.asanewSPeCi

28、SeSParacercosporadictamnico1.aY.H.Ou&RJ.Zhou,biningthemorpho1.ogica1.characteristicsandphy1.ogeneticana1.ysis(ITSand1.SU).2. Bio1.ogica1.characteristicsofpathogenandconditionsofcondiaproductionwerecontinued.Itturnedoutthatdifferentnutritiona1.conditions,temperature,1.ightandpHva1.uehadsignificanteff

29、ectsonmyce1.ia1.growthandsporegermination.Theresu1.tsshowedthemyce1.iumgrownfastonCA,bestpHva1.uewaspH6,optima1.temperaturewas25Candgrownwe1.1.inthe1.ight.Thebestcarbonandnitrogensourcesarefructoseandyeastextract.Thenyce1.iacou1.dnotsurviveabove54Cfor1.()nin.Theoptima1.temperatureforconidia1.germina

30、tionwas25T.bestpHva1.uewaspH6.Conidiagerminatedbestinthedark.Ihebestcarbonandnitrogensourceswere1%dextroseand1%KNO?.Theconidiacou1.dnotgerminateabove53Cfor10nin.V8isthebestmediatoproductcondiaas15d9.5106.thebesttemperatureandpHva1.ueare25CandpH6and1.ightpromotesconidiaproduction.V8withNaproductmorec

31、ondiaas15d1.3IO7.3. ThespeciesofCWDE.andoptimizingconditionforproducingthemandthechangeswereconfirmedtoprovidetheoretica1.basisforfurtherexpoundsthemechanismofpathogenicfactor.ItturnedoutthatCWDEinc1.uded4kindsofpectinase(PG.PMG、PMTEABSTRACTandPGTE)and2kindsofce1.1.u1.ose(-g1.ucosidaseandCx).T1.ieac

32、tivitiesofCWDEwerec1.ose1.yre1.atedtotemperatureand25CistheoptimizingIen1.PeratUre.IheactivityofPGwashigher.9.63U/m1.at25C.PectinasewaseffectedbypHmore.PGandPMbestatH56.PGTEandPMTEbestatpH6-7.Ce1.1.u1.osewas1.itt1.einf1.uenced.TheactivitiesofCWDEwasre1.atedtothetime.PGandPMbestat25dfor9.61U/m1.and7.

33、16U/m1.PGTEbestat20d.PMTEsignificant1.yincreasedat25d.-g1.ucosidaseandCxweremorestab1.e,2.31U/m1.and1.33U/m1.at25d.Theactivitiesofce1.1.u1.osewasc1.ose1.yre1.atedtocarbonsources,theactivitiesof-g1.ucosidaseandCxbestinsugeras41.80U/m1.and11.82U/m1.TheactivitiesofPcctinascwac1.ower.TheactivitiesofPGin

34、sugcr.PMGinfructose.PGTEandPMTEinmannito1.were8.76U/m1.6.06U/m1.9.04U/m1.and5.57U/m1.CWDEcanbeproductcdindifferentnitrogensourceenvironment,pectinasebetterthance1.1.u1.ose,-g1.ucosidascbestinpeptoneas8.67U/m1.PGandPMGinyeastenvironnwnt.PGTEandPMTEintyrosinewerebestas4.64U/m1.,3.47U,m1.4.53U/m1.3.02U

35、/m1.Cxwas1.itt1.einf1.uenced.0.69U/m1.inpeptone.Pcctinascwasproductcdmorewhenrest.3to5timesmorethanshaking.Ce1.1.u1.osewas1.itt1.einf1.uenced.1.eafspotdea1.ingwithce1.1.u1.oseissma1.1.and1.ighterthanthatwithpectinase.4. TheSpCCiCSofme1.anin,andoptimizingconditionforproducingthemandthechangeswereconf

36、irmedtoprovidetheoretica1.basisforfurtherexpoundsthemechanismofpathogenicfactorforthefirsttime.Theme1.anininandoutofce1.1.ofstrincSAUCC1208weredifferentduringextraction,purificationandinfraredspectrumdetection.Theresu1.tisthattheme1.aninince1.1.isDHNandthatoutofce1.1.isDOPA.Theme1.aninoutofce1.1.was

37、projectedfastat25dto35d.Dark,shaking.pH6-7,25C,addingIyroSinC.Cu,andtherightamountofIricyc1.azo1.che1.pedtheme1.aninoutofce1.1.production.Itisprovedthattheme1.anininandutofce1.1.arcdifferentsynthesismechanismbecausemorenw1.aninoutofce1.1.weregotwhenaddingIricyc1.azo1.cKeywords:gray1.eafspotofDictamn

38、usdasycarpus;Paracercospora:pathogen:ce1.1.wa1.1.degradationenzymatic:第一章尾胞类真菌病害研究进展尾抱类真菌病害即由尾抱类真菌(CCrCoSPOriodfungi)侵染寄主导致的病害。尾抱类真菌主要包括CerCoSPora、PSeUdoCerConPOra和Passa1.ora等十多个属(CrOUS2013),种类繁多，是丝池纲从屈于球腔菌属的最大类群之一，也是造成植物主要病害的最大病原类群之一(BraUn2014)。国嗑必寄主范围广,对环境适应性较好，广泛分布于热带和亚热带地区，目前为止尾胞类真菌引致病害在亚洲、欧洲、美洲

39、、非洲等地均有相关研究报道.在我国，该类群引起的病害在东北、华北、及南部地区均有相关报道.病菌主要危害叶片，形成明显的I列形、近例形、多角形或不规则形病斑,常引起植物叶片黄化及提早落叶，严重影响作物生长和经济产量。1.1尾胞类真菌病害发生危害及其分布1.Ij尾胞类真菌病害种类尾胞类真菌是植物重要的病原菌物，能够引致玉米、花生、大豆等主要农作物及人参、枸杞、地黄等药用植物及三色莹、女贞等观赏植物病宙，通居称为灰斑病、褐斑病或叶斑病，危需严重，损失巨大。世界各地均有此类病菌的研究报道。目前全世界报道尾胞类真菌近6000种。表1-1部分植物尾泡类病害Iab1.c1-1Somep1.antdiseas

40、escausedbyCcrcosporiodfungi我班名称粕原信寄主主要鱼班部也NameofdiseasePaihogcnHostDamagepatCerctiswracapita探期叶甜泰褐如病CeEWPo,Hbev1.a菜叶花生栩匿病CfrvoipttntaraMdicf!a花生叶玉米衣岗的CaCtZNrQZiWmay玉米叶CefCOipomIeina大豆灰班病CeirtMporap(raPanaeicoki人参叶天仙子灰风病CeirtMporadaturiat1.a大仙子叶毓茄灰斑病CCrc(NPOraempav?&11构纪次次病CentnparaIyciiI-地货灰现MJGwxwdigia1.idh地黄叶外t尾的类IXffi衲害研究进展确书名称病燎曲布主主要杜哲部位NanofdiseasePaihogcnHostDamageat独活灰城桁Cenwiporaapii独活叶荷香灰药病CeirtMptfrafsporapini(1.ensif1.orue影响，大面积枯萎，松树的价值受到了影响，使之被大府砍伐。我国发生较普遍的Pseud*Ce1.VoSWraIigwri可危害女此产生叶斑，影响女贞的观赏价值。在塞拉利昂，1.,sedocercoswraUngo1.ensis可危害根橘属植物，对其叶和果实形成斑点，