流式细胞术的临床应用.ppt

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1、流式细胞术的临床应用,什么是流式细胞术？,利用流式细胞仪（flow cytometry,FCM）对处在快速、直线、流动状态中的单个微粒多参数、快速定量分析，也可以同时对特定群体进行分选的技术分析对象包括细胞、细菌、荧光微球等，0.4m40m,什么是流式细胞仪？,六种技术：激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术四个系统：液流系统、光学系统、电路系统、分析系统,流式细胞仪构造,BD FACSCalibur双光源，488nm和633nm可同时检测四种抗原可分选（理论上）,流式细胞仪检测什么信号？,散射光信号,前向散射光（forward scatter

2、light,fsc）反映细胞大小侧向散射光（side scatter light,ssc）反映细胞内部颗粒、核膜等,FSC检测器,SSC检测器,外周血裂红后FSC/SSC分布 R1:淋巴细胞 R2:单核细胞 R3:中性粒细胞 R4:裂解碎片,流式细胞仪检测什么信号？,荧光信号,抗原抗体反应单克隆荧光抗体标记,常用荧光素,不同的激光器搭配不同的荧光素，原理是激发光波长有所不同,数据分析,设门（gating）：根据某些特性将分析细胞群圈起来。淋巴细胞：FSC/SSC CD45+/SSCdim T淋巴细胞：CD3+/SSCdim,数据分析,直方图,单参数分析横坐标：信号强度纵坐标：细胞数量,数据分析

3、,散点图,双参数分析横、纵坐标代表的均是信号强度UL:cd3-cd4+UR:cd3+cd4+LL:cd3-cd4-LR:cd3+cd4-,标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液(BALF)及其脱落细胞。血清和各类体液样本（可溶性蛋白）,标本染色的一般方法,洗涤上机,已开展的项目,淋巴细胞亚群 HLA-B27CD55、CD59检测CD34造血干细胞计数白血病和淋巴瘤免疫分型杂项（BALF、胸腹水等CD分子检测）,TH1/TH2细胞检测血小板活化炎症感染指标CD64CBA网织红细胞/血小板检测微小残留病灶（MRD）肿瘤细胞倍体（DNA）细胞凋亡,流式细胞术的临床应用,

4、其他临床应用,淋巴细胞亚群,试剂：BD IMK-Lymphocyte Kit标本：外周血（常用）检测指标：T细胞（CD3、CD4、CD8）B细胞（CD19）NK细胞（CD3-CD1656）,已开展的项目,实验室报告,医生报告,临床意义：体内免疫状态 判断某些免疫缺陷、自身免疫性疾病、病毒感染 SCID、AIDS、SLE、RA 急性GVHD、移植排斥、恶性肿瘤 免疫球蛋白缺乏症或分泌过多 结合淋巴细胞绝对数来看待百分比的改变 AIDS,淋巴细胞亚群,HLA-B27,试剂：BD HLA-B27 Kit 标本：外周血检测指标：T(CD3+)淋巴细胞上HLA-B27 定性检测,已开展的项目,临床意义：

5、强直性脊柱炎（高度相关）遗传性关节炎 Reiters 综合征 反应性关节炎、银屑病关节炎 急性前葡萄膜炎、肠炎性关节炎、,HLA-B27,CD55、CD59,试剂：CD59-FITC、CD55-PE 标本：外周血（红细胞、白细胞）检测指标：CD55、CD59百分比 CD55、CD59荧光强度,已开展的项目,临床意义：阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）酸化血清溶血试验（Hams试验）糖水试验 蛇毒因子溶血试验 补体溶血敏感实验 FCM检测（金标准）,CD55、CD59,以红细胞检测为例,normal,PNH,造血干细胞计数,试剂：BD Procount Progenitor Cell Enumer

6、ation Kit标本：骨髓、动员后的外周血检测指标：CD34及浓度,已开展的项目,蓝色荧光微球（数量已知）；红色CD34细胞,干细胞特征：CD45表达弱阴性(R2)CD34表达弱强(R4)DNA/RNA含量多，染色性较强(R1)大小（FSC）和颗粒度（SSC）淋巴细胞相似,临床意义：血液系统疾病的造血干细胞移植 数量的检测 采集时机的确定 某些肿瘤,造血干细胞计数,白血病和淋巴瘤（L&L）免疫分型,试剂：各种单克隆荧光抗体标本：骨髓、外周血、胸腹水、脑脊液、淋巴组织检测指标：我室目前开展了将近40种指标的检测 可满足大部分L&L的分型要求,已开展的项目,分型方案：CD45设门，四色标记，临床

7、意义：客观、快速地分析 确定异常细胞系来源及分化阶段 区分双克隆或双表型的HAL 判断预后,白血病和淋巴瘤（L&L）免疫分型,正常骨髓细胞CD45/SSC,R1:淋巴细胞R2:幼稚细胞R3:单核细胞R4:中性粒细胞R5:有核红细胞,AML-M1,R2占94，表达cd33,cd34,cd117,cd71,cd13,cd64,mpo,ALL(B),R2占65，表达cd79a,cd19,cd34,cd22,cd10,cd38,hla-dr,MM,R2占17，表达cd38(+),ckappa轻链,临床意义：结节病和特发性肺间质纤维化 肺部肿瘤疾病,已开展的项目,cd4/cd85.04,TH1/TH2细

8、胞检测,TH2，蠕虫感染 环境变应原的应答 IL-4、IL-5、IL-10等 介导体液免疫,其他临床应用,TH1/TH2细胞检测,细胞内细胞因子表达 IFN-和IL-4 检测前需要刺激活化（PMA+Lonomycin）Golgistop，含有莫能霉素（Monensin）设门策略：CD3+CD8-,其他临床应用,其他临床应用,血小板分析,血小板分析,注意事项：避免血小板的体外活化 使用真空采血管 枸橼酸钠，避免使用EDGA和肝素 尽快检测或分离血小板 固定,其他临床应用,感染性疾病CD64检测,CD64：FC受体 单核细胞（）中性粒细胞（dim）淋巴细胞（）检测指标：中性粒细胞CD64表达强度

9、CD64指数CD64中性粒/CD64淋巴临床意义：细菌感染、脓毒血症、败血症,其他临床应用,其他临床应用,液相芯片技术CBA,CBA：Cytometric Bead Array 可溶性蛋白 如：血清中细胞因子 荧光微球连结特异抗体 不同荧光强度 多个检测指标标本：血清、血浆、培养液、各种体液,液相芯片技术CBA,其他临床应用,仪器,保养：防尘、保护激光源、液路冲洗 仪器的校准 CaliBRITE beads 光路稳定性 PMT的转换的线性 多色补偿设定 时间延迟 灵敏度,标本,抗凝剂 外周血：EDTA、肝素和ACD均可 骨髓：肝素（推荐）、EDTA 血小板：ACD 储存时间 EDTA：2448h 肝素：4872h ACD：72h,试剂,抗体 级别、克隆号、荧光素种类、F/P 应尽量选用IVD的抗体或抗体组合 溶血素、破膜剂 膜抗原活性 膜通透性 胞内抗原与抗体结合力,对照,空白对照 同型对照 相同的种属来源、亚型和亚链和荧光标记 mouse anti human IL4(IgG1,)-FITC mouse(IgG1,)-FITC 阴性对照 阳性对照,Thank You!,