应用生物化学2.ppt

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1、离 心 技 术,应用生物化学 第二章,离心技术（centrifugal technique）,是根据颗粒在匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为发展起来的一种分离分析技术。,一、离心技术的应用,1.用于生物、医学、化学等实验室分析研究的，转速从每分钟几千到几万转以上，此类技术的使用目的在于分离和纯化样品，以及对纯化的样品有关性能进行研究。2.用于工业生产的，如化工、制药、食品等工业大型制备用的离心技术，转速都在每分钟5000转以下。,二、离心机基本组件,1.低速离心机 转子 速度控制系统最高转速在6000rpm以下实验室中常用于分离制备。,2.高速离心机 系列转子 速度控制系统 温控系统最高

2、转速在25,000rpm以下常用于生物大分子的分离制备,3.超速离心机 系列转子 速度控制系统 温度控制 真空系统 常用于分离亚细胞器、病毒粒子、DNA、RNA和蛋白质分子。,转子(Rotor),固定角式转子(fixed-angle rotor)水平转子(Swing-bucket rotor)垂直转子(vertical rotor)带状转子(zonal rotor)连续转子(continuous rotor),1.固定角式转子,离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度,角度变化在14-40之间。,固定角式转子,角式转子的特点：（1）重心低,转速可较高（2）样品粒子穿过溶剂层的距离

3、略大于离心管的直径;（3）“管壁效应”：有一定的角度,在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀,此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。,2.水平转子,（1）转子静止时,处在转子中的离心管中心线与旋转轴平行；（2）转子旋转加速时,离心管中心线由平位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋转轴成90角。,水平转子的特点：（1）转子的重心位置较高（2）样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径（3）对于多种成分样品分离特别有效（4）常用于速率区带离心和等密度离心,三、基本原理,1.转速（1）rpm Revolutions Per Minute 为每分钟转速（转/分）（2）角速度：每秒转过的弧度数(弧度/

4、秒)1 弧度即为弧长等于半径的圆弧所对的圆心角,2.离心力 Centrifugal force(F)F离心力=m2r m:质量:旋转角速度 r：旋转体离旋转轴的距离,3.相对离心力 Relative centrifugal force(RCF)RCF就是实际离心力转化为重力加速度的倍数，通常用g表示 RCF F离心力/F重力 m2r/mg=2r/g 1.118 10-5(rpm)2 r半径,4.离心转速换算公式（rpm与g）离心速度1000rpm与1000g有什么区别？（Eppendorf 5415C 1000g 对应 3066rpm）（BOECO M-24 1000g 对应 3222rpm）

5、g（RCF）1.118 10-5(rpm)2 r半径 运用离心力列线图换算rpm与g,离心力列线图,5.沉降系数 Sedimentation coefficient(S),样品颗粒的大小 形状 密度 溶剂的粘度、密度 离心加速度 S=X1:离心前粒子离旋转轴的距离X2:离心后粒子离旋转轴的距离,6.沉降速度 Sedimentation velocity,定义：指在强大离心作用下，单位时间内物质运动的距离。,d：球形粒子的直径p：粒子的密度m：介质的密度：流体介质的粘度数 r：粒子距离心轴垂直半径,四、离心分离方法,制备型超高速离心机的几种分离方法：A差速离心：速率区带法（rate zonal）

6、B密度梯度离心法：等密度离心法（isopycnic）,A差速离心：,利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别,在同一离心条件下,沉降速度不同,通过不断增加相对离心力,使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。差速离心的特点是操作简单，但分离纯度不高。,主要细胞成分的大小,细胞核 4-12 m质膜 3-20 m高尔基体 1-2 m线粒体 0.4-2.5 m溶酶体/过氧化物酶 0.4-0.8 m微粒小泡 0.05-0.3m,匀浆组织的差速离心（）,匀浆组织的差速离心（）,组织匀浆 1000g for 10 min上清 from 1 3000g for 10 min上清 from 2 15,0

7、00g for 15 min上期 from 3 100,000g for 45 min,1000g 沉淀:细胞核,质膜层3000g 沉淀:大线粒体,高尔基管15,000g沉淀:小线粒体,溶酶体,过氧化物酶100,000g 沉淀:微粒,差速离心（）,B、密度梯度离心,对不同粒子怎样进行密度梯度分离?,p=m 即 p-m=0 V=0 粒子平衡 pm 即 p-m0 V0 粒子达到某一位置后就达到平衡 pm 即p-m0 V0 粒子逆着离心方向上浮,从方程式预测,密度梯度离心过程,1）速率区带法（rate zonal）,根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速率（S）分离。将所需分离的样品小心地

8、加至密度梯度溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成一负梯度。由于不同大小的粒子在离心力作用下，在梯度中移动的速度不一样，所以经过离心后会形成几条分开的样品区带。注意：样品粒子的密度（p）必须大于梯度液注中任一点的密度（m）。离心过程必须在区带到达管子底部前停止。,STOP,2）等密度离心法（isopycnic）,根据粒子的不同密度来分离。离心过程中，粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。密度梯度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度。样品可以在密度梯度液粒上面或均匀分布在密度梯度中。经离心后，样品粒子达到它们的平衡点。注意：平衡后粒子的分离完全由其密度决定，与时间无关。,粒子密度（p）最

9、大介质密度（m）,等密度离心法,等密度离心法的离心结果,五.梯度溶液的制备,(一).梯度材料的选择原则:1、与被分离的生物材料不发生反应。2、可达到要求的密度范围,且在所要求的密度范围内,粘度低,渗透压低,离子强度和pH变化较小。3、不会对离心设备发生腐蚀作用。4、容易纯化,价格便宜或容易回收。5、浓度便于测定,如具有折光率。,（二）常用的梯度材料：糖类:蔗糖、甘油、聚蔗糖、右旋糖酐、糖原无机盐类:CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、NaCl、KBr等有机碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等硅溶胶:Percoll。蛋白质:牛血清白蛋白非水溶性有机物:氟代碳等,(三).梯度材料的应用范围 1.蔗糖:

10、水溶性大，性质稳定，渗透压较高，最高密度可达1.33g/ml,价格低，容易制备。常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料制备 有较大的渗透压,不宜用于细胞的分离。,2.聚蔗糖:商品名Ficoll,渗透压低，粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞,3.氯化铯:离子性介质，水溶性大，最高密度可达1.91g/ml重金属盐类,在离心时形成的梯度有较好的分辨率。被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，价格较贵。,4.卤化盐类:Br和NaCl可用于脂蛋白分离KI和NaI可用于RNA分离,其分辨率高于铯盐NaCl梯度 可用于分离脂蛋白NaI梯度可分离天然或变性的DNA。,5.Percoll:SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮，渗透压低，对生物材料的影响小，颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，粘度高，在酸性pH和高离子强度下不稳定。用于细胞、细胞器和病毒的分离。,离心事故,离心机转头损坏的原因（操作或使用不当所造成的）过速 腐蚀 金属疲劳 不平衡,